Caco2与口服药物的吸收.ppt

Caco-2与口服药物的吸收目录 肠上皮细胞及Caco-2细胞简介 体外Caco-2细胞及体内肠细胞的药物转运 Caco-2在研究口服药物吸收中的应用肠上皮细胞及Caco-2细胞简介肠道的解剖生理（小肠为例）小肠由浆膜层、肌层、黏小肠由浆膜层、肌层、黏膜下层和黏膜组成。膜下层和黏膜组成。小肠黏膜分为小肠黏膜分为3 3层：层：1.1.黏膜肌层黏膜肌层2.2.固有层：主要由结缔组固有层：主要由结缔组织组成。织组成。3.3.上皮：由单层柱状上皮上皮：由单层柱状上皮细胞（肠上皮细胞）组成，细胞（肠上皮细胞）组成，覆盖于隐窝和绒毛表面。覆盖于隐窝和绒毛表面。覆盖小肠绒毛上皮的细胞：吸收性细胞或肠上皮细胞，是高吸收性细胞或肠上皮细胞，是高柱状细胞柱状细胞杯状细胞：分泌黏液，与肠上皮杯状细胞：分泌黏液，与肠上皮细胞比，更耐受高渗透压。细胞比，更耐受高渗透压。内分泌细胞：产生激素和肽类，内分泌细胞：产生激素和肽类，如促胃液素等。如促胃液素等。丛细胞丛细胞 小肠内的消化 小肠内的营养物质和水通过小肠内的营养物质和水通过肠粘膜上皮细胞，最后进入血液肠粘膜上皮细胞，最后进入血液和淋巴的过程中，必须通过肠上和淋巴的过程中，必须通过肠上皮细胞的腔面膜和底膜（或侧膜）皮细胞的腔面膜和底膜（或侧膜）。物质通过这些膜的机制，即吸。物质通过这些膜的机制，即吸收机制，包括简自由扩散、协助收机制，包括简自由扩散、协助扩散、主动运输、胞吐和胞吞等。扩散、主动运输、胞吐和胞吞等。跨细胞途径跨细胞途径药物跨过肠上皮细胞的途径：、被动细胞转运、被动细胞转运 、胞旁转运、胞旁转运、载体介导转运、载体介导转运 、胞饮作用、胞饮作用细胞模型运用的意义药物研究和新药开发在借助高通量筛选方法确定具药物研究和新药开发在借助高通量筛选方法确定具有预期药理作用性质的化合物之后，往往需要进行有预期药理作用性质的化合物之后，往往需要进行基于细胞平台的、可预测先导化合物的组织通透性基于细胞平台的、可预测先导化合物的组织通透性测定研究。基于细胞平台的研究方法可用来确认具测定研究。基于细胞平台的研究方法可用来确认具有理想的组织通透性的化合物，随后可采用动物模有理想的组织通透性的化合物，随后可采用动物模型进行最终筛选。型进行最终筛选。这一方法不仅具有最佳的成本这一方法不仅具有最佳的成本-效能比，而且能够达效能比，而且能够达到最少使用动物资源的目的。到最少使用动物资源的目的。肠上皮细胞模型为了有效评估药物的肠转运，细胞株必须分化成极化为了有效评估药物的肠转运，细胞株必须分化成极化单层细胞膜单层细胞膜，而且保持人类肠细胞的，而且保持人类肠细胞的形态特征形态特征。人类肠细胞的原代培养细胞活性低，且不能分化形成人类肠细胞的原代培养细胞活性低，且不能分化形成单层细胞膜。单层细胞膜。经过研究，已经能培养出无线增殖的细胞，其中由人经过研究，已经能培养出无线增殖的细胞，其中由人结肠癌得到的结肠癌得到的Caco-2Caco-2细胞株是应用最广泛的模型。细胞株是应用最广泛的模型。肠上皮细胞模型1974年，人们分离得到年，人们分离得到Caco-2细胞株。细胞株。Caco-2细胞株的生长包括增殖、融合和分化阶段。细胞株的生长包括增殖、融合和分化阶段。在半透膜上生长分化的在半透膜上生长分化的Caco-2细胞与正常肠细胞具有细胞与正常肠细胞具有非常相似的形态特征。即紧密连接、顶侧基面、基非常相似的形态特征。即紧密连接、顶侧基面、基地侧面和刷状缘。地侧面和刷状缘。Caco-2细胞的特点 Caco-2细胞来源于人的结肠细胞来源于人的结肠癌，结构和功能类似于人小癌，结构和功能类似于人小肠上皮细胞，并含有与小肠刷状缘上相关的酶系。在细胞肠上皮细胞，并含有与小肠刷状缘上相关的酶系。在细胞培养条件下，细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续培养条件下，细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。出现反分化的情况不同。Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接，这些性形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接，这些性质可以恒定维持约质可以恒定维持约20天。由于天。由于Caco-2细胞性质类似小肠上细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。Caco-2细胞模型 Caco-2 Caco-2细胞模型是一种药物细胞模型是一种药物离体口服离体口服特性筛选模型，已广特性筛选模型，已广泛用于药物在小肠吸收的评价和各种转运机制研究中。特别泛用于药物在小肠吸收的评价和各种转运机制研究中。特别是在药剂学研究注重在分子水平和细胞水平上发展的今天，是在药剂学研究注重在分子水平和细胞水平上发展的今天，CacoCaco2 2细胞模型可应用于多类药物研究，帮助了解药物的吸细胞模型可应用于多类药物研究，帮助了解药物的吸收机制，预测体内吸收和药物相互作用，研究药物的小肠代收机制，预测体内吸收和药物相互作用，研究药物的小肠代谢情况，从而促进新药研发。谢情况，从而促进新药研发。Caco-2细胞模型的发展1 1、FoghFogh等人在等人在1971974 4年首次分离年首次分离出了出了Coca-2Coca-2细胞。细胞。2 2、19891989年年BorchardtBorchardt等人将其应等人将其应用于小肠吸收并作了大量研究。用于小肠吸收并作了大量研究。Caco-2类似细胞模型发展迅猛的主要原因较差的药物动力学性质如药物吸收不充分，是临床研较差的药物动力学性质如药物吸收不充分，是临床研究阶段中候选新药研究失败的主要原因究阶段中候选新药研究失败的主要原因药物通过生物屏障的吸收是一个相当复杂、涉及整个药物通过生物屏障的吸收是一个相当复杂、涉及整个途径的过程，因此无法轻易地借助于整体实验动物进途径的过程，因此无法轻易地借助于整体实验动物进行解释分析行解释分析在药物开发发现阶段中引进组合化学方法所获得的化在药物开发发现阶段中引进组合化学方法所获得的化合物数量巨大，传统动物吸收模型不能适应繁重的研合物数量巨大，传统动物吸收模型不能适应繁重的研究工作要求究工作要求Caco-2模型现存的优缺点优点：优点：Caco-2Caco-2模型是模型是FDAFDA认可的对药物进行吸收研究的两种模型认可的对药物进行吸收研究的两种模型之一（另一种为之一（另一种为MDCKMDCK）。）。其特殊性在于，实验装置中的小肠上皮细胞顶侧基面和其特殊性在于，实验装置中的小肠上皮细胞顶侧基面和地侧基面两侧具有实验操作的可接近性或可到达性，这地侧基面两侧具有实验操作的可接近性或可到达性，这是其成为研究药物转运、外排的极佳模型。是其成为研究药物转运、外排的极佳模型。仅需极微量化合物（约仅需极微量化合物（约1mg1mg）即可进行药物转运实验。）即可进行药物转运实验。缺点：缺点：虽然虽然Caco-2Caco-2细胞株极易生长，且形成极化的单层细胞膜，细胞株极易生长，且形成极化的单层细胞膜，但这种单层细胞膜还是不同于人肠屏障。但这种单层细胞膜还是不同于人肠屏障。培养过程中无杯状细胞，故顶层基面并无粘液层，而人培养过程中无杯状细胞，故顶层基面并无粘液层，而人们通常认为肠黏膜黏液可能是药物吸收的另一道屏障。们通常认为肠黏膜黏液可能是药物吸收的另一道屏障。这使得研究时可能会人为高估某些药物渗透系数。这使得研究时可能会人为高估某些药物渗透系数。Caco-2Caco-2细胞株生化特征和形态特征类似于肠细胞，但并细胞株生化特征和形态特征类似于肠细胞，但并不完全一致。不完全一致。Caco-2模型现存的优缺点体外Caco-2细胞及体内肠细胞的药物转运药物跨肠上皮细胞转运途径被动扩散被动扩散细胞旁路转运细胞旁路转运载体转运载体转运胞饮和吞噬作用胞饮和吞噬作用被动扩散9090以上的药物脂溶性好，油水分布系数大，易以上的药物脂溶性好，油水分布系数大，易分布于上皮细胞脂质膜，且小肠上皮细胞的刷状分布于上皮细胞脂质膜，且小肠上皮细胞的刷状缘膜表面积约为旁路转运吸收面积的缘膜表面积约为旁路转运吸收面积的10001000倍。倍。细胞旁路转运1.常常难以快速地分布到小肠刷状缘膜上常常难以快速地分布到小肠刷状缘膜上2.细胞旁间隙仅占肠管表面积细胞旁间隙仅占肠管表面积0.01%0.1%3.部分经细胞转运途径被吸部分经细胞转运途径被吸4.细胞间的紧密连接细胞间的紧密连接针对吸收速度慢且不完全的药物针对吸收速度慢且不完全的药物载体转运1.一元羧酸转运蛋白（一元羧酸转运蛋白（MCT）介导的主动转运）介导的主动转运 2.pH依赖的特异转运载体介导的主动转运依赖的特异转运载体介导的主动转运3.其他转运载体介导的主动转运其他转运载体介导的主动转运某些与营养物质化学结构相似的药物某些与营养物质化学结构相似的药物1.这类药物的转运通过被动扩散和载体介导这类药物的转运通过被动扩散和载体介导共同完成。共同完成。2.肠上皮细胞上还存在外排载体如肠上皮细胞上还存在外排载体如P 糖蛋白。糖蛋白。载体转运胞饮和吞噬作用 胞饮和吞噬作用在药物吸收中的作用相胞饮和吞噬作用在药物吸收中的作用相对较小对较小,主要是一些肽类抗原物质的转运方主要是一些肽类抗原物质的转运方式式,因为分子体积大通常不被其他途径转运。因为分子体积大通常不被其他途径转运。缺点就是转运部位存在大量的蛋白水解缺点就是转运部位存在大量的蛋白水解酶酶,使得许多外源性蛋白在转运过程中水解。使得许多外源性蛋白在转运过程中水解。实验证明实验证明,被动扩散药物在被动扩散药物在Caco-2细胞细胞上的转运吸收与体内吸收差异较小。与小上的转运吸收与体内吸收差异较小。与小肠上皮结构相比较肠上皮结构相比较,Caco-2细胞层是平面结细胞层是平面结构构,而小肠褶皱及微绒毛结构使得体内吸而小肠褶皱及微绒毛结构使得体内吸收面积剧增收面积剧增,因此推测只有部分吸收面积因此推测只有部分吸收面积参与了快速被动扩散药物的转运。参与了快速被动扩散药物的转运。Caco-2细胞及体内肠细胞的比较 对于吸收慢且不完全的药物对于吸收慢且不完全的药物,体内吸收速率约体内吸收速率约为为Caco-2体外模型吸收速率的体外模型吸收速率的30 80 倍倍,原因有原因有:1.药物的体内和体外细胞旁路渗透系数的差异；药物的体内和体外细胞旁路渗透系数的差异；2.体内和体外实际吸收面积的差异。体内和体外实际吸收面积的差异。Caco-2细胞及体内肠细胞的比较药物的吸收转运机制研究Caco-2细胞模型可以同时测定药物的双向转运通细胞模型可以同时测定药物的双向转运通过参数计算确定药物的吸收转运机制。过参数计算确定药物的吸收转运机制。1.若在整个浓度范围内若在整个浓度范围内(于漏槽条件下于漏槽条件下)的的Papp值恒定值恒定,则被动则被动扩散为主扩散为主;2.若若P Caco-2(B A)与与P Caco-2(A B)相同相同,则也可确定被动扩则也可确定被动扩散为主散为主;3.若若PCaco-2(B A)/P Caco-2(AB)1.5,则提示可能存在主动则提示可能存在主动转运机制转运机制;4.P 糖蛋白和多药耐药相关蛋白是糖蛋白和多药耐药相关蛋白是Caco-2细胞上细胞上2 种主要的转运种主要的转运蛋白蛋白,发挥外排泵的作用发挥外排泵的作用,能将细胞内物逆浓度梯度转运至细胞能将细胞内物逆浓度梯度转运至细胞外外Caco-2在研究口服药物吸收中的应用Caco-2在研究口服药物吸收中的应用（1 1）药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价）药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价（2 2）药物吸收过程中相互作用的预测）药物吸收过程中相互作用的预测（3 3）药物的化学结构和体内转运间关系的研究）药物的化学结构和体内转运间关系的研究（4 4）药物肠吸收限速因素的揭示）药物肠吸收限速因素的揭示（5 5）药物代谢稳定性的估计）药物代谢稳定性的估计（6 6）肠腔）肠腔 pH pH 值对药物吸收影响的评价值对药物吸收影响的评价一、药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价1、药物经、药物经 Caco-2细胞单层转运过程中细胞单层转运过程中测定测定 TEER 值：检查细胞单层的完整性值：检查细胞单层的完整性测定测定Papp 值：考察其透膜性值：考察其透膜性 2、当药物影响细胞单层的完整性时、当药物影响细胞单层的完整性时 跨膜电阻值的下降跨膜电阻值的下降 揭示上皮细胞黏膜毒性揭示上皮细胞黏膜毒性一、药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价 3、制剂处方中的辅料制剂处方中的辅料 用于影响制剂物料的性能用于影响制剂物料的性能 改善药物制剂质量改善药物制剂质量 判断辅料对小肠上皮完整性产生的影响判断辅料对小肠上皮完整性产生的影响由于由于 Caco-2细胞模型与小肠上皮细胞类似细胞模型与小肠上皮细胞类似,评价方式如下：评价方式如下：（1）考察各种处方组成对于药物转运的影响考察各种处方组成对于药物转运的影响：P app 值的大小值的大小（2）评价处方组成对上皮细胞黏膜的安全性评价处方组成对上皮细胞黏膜的安全性：表现为表现为跨膜电阻值和转运漏出标志物跨膜电阻值和转运漏出标志物（如甘露醇如甘露醇）Papp 值值的变化的变化当跨膜电阻值下降而当跨膜电阻值下降而 P Pappapp值上升时值上升时,可以证实处方对可以证实处方对 Caco-2 Caco-2细胞细胞完整性有不利作用。完整性有不利作用。当药物从细胞模型上移走后当药物从细胞模型上移走后,以跨膜电阻以跨膜电阻 TEER TEER 作为时间作为时间t t的函数的函数,可以判断此作用是否可逆可以判断此作用是否可逆。一、药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价 1、载体介导的主动转运的药物、载体介导的主动转运的药物 其吸收过程中载体的饱和其吸收过程中载体的饱和显著地影响药物的生物利用度显著地影响药物的生物利用度 2、联合用药时、联合用药时增加了药物之间互相竞争酶、增加了药物之间互相竞争酶、载体或外排泵的可能性载体或外排泵的可能性导致单独给药与联合用药时导致单独给药与联合用药时生物利用度出现较大差异生物利用度出现较大差异二、药物吸收过程中相互作用的预测1、这种与药物吸收有关的这种与药物吸收有关的相互作用，相互作用，可以在可以在 Caco-2细细胞模型中进行研究和估计胞模型中进行研究和估计2、与药物吸收有关的相互与药物吸收有关的相互作用作用来源来源：特定药物重复给：特定药物重复给药后对代谢酶、药后对代谢酶、载体、载体、外外排泵等的诱导作用排泵等的诱导作用 当药物通过经细胞转运途径吸收时当药物通过经细胞转运途径吸收时 外排载体外排载体(如如 P 糖蛋白糖蛋白)成为药物吸收的一个成为药物吸收的一个重要生化屏障重要生化屏障 将进入细胞内的药将进入细胞内的药物外排从而物外排从而减少了药物的吸收减少了药物的吸收二、药物吸收过程中相互作用的预测 成为口服药物成为口服药物生物利用度低、生物利用度低、个体差异大个体差异大的一个重要因素的一个重要因素 PS.具有这种具有这种 P 糖蛋白底物性质的药物分子在与糖蛋白底物性质的药物分子在与P糖蛋白抑制剂合用时糖蛋白抑制剂合用时,其其透过细胞膜吸收的程度将增强透过细胞膜吸收的程度将增强(表示为表示为Papp值的增大值的增大)。例子：例子：（1）维拉帕米和红霉素等：通过抑制）维拉帕米和红霉素等：通过抑制 P 糖蛋白提高非索非那定、糖蛋白提高非索非那定、他林洛尔和地高辛的吸收度。他林洛尔和地高辛的吸收度。（2）这类药物分子与这类药物分子与 P 糖蛋白诱导剂合用时糖蛋白诱导剂合用时,其吸收程度将有其吸收程度将有不同程度的降低不同程度的降低,。（3）利福平对）利福平对 P 糖蛋白的诱导作用则显著降低了他林洛尔及地糖蛋白的诱导作用则显著降低了他林洛尔及地高辛的吸收。高辛的吸收。二、药物吸收过程中相互作用的预测结论：结论：Caco-2细胞中存在与小肠上皮细胞相同的各种运动系细胞中存在与小肠上皮细胞相同的各种运动系 统、代谢酶统、代谢酶,因此可以作为研究药物相互作用的体外模型。因此可以作为研究药物相互作用的体外模型。例子：例子：（1）一系列用于减肥的）一系列用于减肥的 1,5 苯二氮苯二氮 类化合物类化合物(CCK A 受体激动剂受体激动剂),其化学结构和吸收转运间其化学结构和吸收转运间(表现渗透系数表现渗透系数Papp)具有较强的相具有较强的相关性关性:（式中（式中 n 为氢链数目为氢链数目,S 为表面积为表面积,E 为溶剂化能。）为溶剂化能。）（2）有实验证明）有实验证明,增加药物亲脂性可较大幅度的提高母体药物的增加药物亲脂性可较大幅度的提高母体药物的膜通透性。膜通透性。三、药物的化学结构和体内转运间关系的研究结论：结论：1.化学结构对小肠吸收的影响化学结构对小肠吸收的影响,可大大促进有效口服药物可大大促进有效口服药物的发现。的发现。2.应用化学结构方面的信息应用化学结构方面的信息(如油水分配系数、如油水分配系数、氢键数、氢键数、偶极矩和分子表面积等偶极矩和分子表面积等),可以可以提高药物命中率提高药物命中率,合成具合成具有有较好生物利用度较好生物利用度的药物。的药物。三、药物的化学结构和体内转运间关系的研究 通常通常,当不溶性或难溶性药物吸收困难时当不溶性或难溶性药物吸收困难时,如何增加药如何增加药物溶解性是处方设计中必须解决的问题物溶解性是处方设计中必须解决的问题,但是在这之前但是在这之前,阐阐明药物本身是否具有良好的转运能力非常重要。明药物本身是否具有良好的转运能力非常重要。四、药物肠吸收限速因素的揭示 Caco-2细胞模型应用优点：细胞模型应用优点：1.有效地揭示药物吸收转运的限速过程是药物的溶解性有效地揭示药物吸收转运的限速过程是药物的溶解性还是膜通透性。还是膜通透性。2.通过不同浓度范围的通过不同浓度范围的Papp值变化来考察吸收的限值变化来考察吸收的限 速过速过程程,进而采取相应措施。进而采取相应措施。原因：原因：在小肠上皮细胞的刷状缘膜上发现的酶在小肠上皮细胞的刷状缘膜上发现的酶(如氨基肽酶、如氨基肽酶、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、二肽氨基肽酶等二肽氨基肽酶等)在在 Caco-2细胞中均存在。细胞中均存在。Caco-2细胞含有许多小肠上皮细胞中包含的酶细胞含有许多小肠上皮细胞中包含的酶 因此可用于评价转运过程中药物的代谢稳定性。因此可用于评价转运过程中药物的代谢稳定性。五、药物代谢稳定性的估计例子：例子：有证据表明微粒体细胞色素有证据表明微粒体细胞色素P450同工酶存在于同工酶存在于 Caco-2细胞中细胞中,这些同工酶类似人小肠细胞中的这些同工酶类似人小肠细胞中的 CYP3A。五、药物代谢稳定性的估计结论：结论：Caco-2细胞是研究药物分子经小肠上细胞是研究药物分子经小肠上皮吸收首过代谢的有效模型皮吸收首过代谢的有效模型 传统体外模型：传统体外模型：离子化的药物分子只有很窄的吸收范围离子化的药物分子只有很窄的吸收范围,并且只在胃肠道的特定部位吸收并且只在胃肠道的特定部位吸收(此时非离子型占重要部分此时非离子型占重要部分)传统体外模型缺点：传统体外模型缺点：难以决定药物的弱吸收是由于离子化还是其本身固有的难以决定药物的弱吸收是由于离子化还是其本身固有的弱转运性或二者同时引起。弱转运性或二者同时引起。六、肠腔 pH 值对药物吸收影响的评价采用采用 Caco Caco-2 2细胞模型细胞模型CacoCaco-2 2细胞模型的优点：细胞模型的优点：1.可以评价不同可以评价不同 pH 值下离子化程度与药物跨膜转运的关系值下离子化程度与药物跨膜转运的关系,从而了解弱收原因。从而了解弱收原因。2.Caco-2细胞模型提供了吸收机制的细节细胞模型提供了吸收机制的细节,是解决与转运相关是解决与转运相关的低生物利用度问题的有效工具。的低生物利用度问题的有效工具。六、肠腔 pH 值对药物吸收影响的评价 Caco-2细胞来源于人体细胞来源于人体,不会造成上皮细胞的形态学和生不会造成上皮细胞的形态学和生理学性质上的种属差异理学性质上的种属差异,也不会像许多其他的体外肠吸收模型也不会像许多其他的体外肠吸收模型一样要求使用实验动物一样要求使用实验动物。用用 Caco-2细胞模型可详尽地研究药物从细胞模型可详尽地研究药物从AP 端跨过上皮细端跨过上皮细胞、胞、摄取、摄取、代谢到代谢到 BL 端的排放等细节端的排放等细节,对于研究药物的小对于研究药物的小肠吸收机制有重要意义。肠吸收机制有重要意义。结 语2015-11-11