现代生物实验技术培训课件.ppt

现代生物实验技术现代生物实验技术刘利英刘利英西安交通大学医学院西安交通大学医学院生物医学研究实验中心生物医学研究实验中心培训目的培训目的掌握基本的实验技能；了解一些先进的实验手段及大型仪器的应用；在课题设计中如何将组织形态学，细胞学，分子生物学的手段结合起来，进行不同层面的研究；了解实验中心的运行方式；医学实验中心管理制度1：可以申请使用大型仪器的补贴；大型仪器的使用需要提前预约；2：冰箱管理制度：免费使用低温冰箱；普通冰箱三个月清理一次；3：门禁制度：采用刷卡制；4：其他：技术服务；资料室的网络使用；投诉信箱等。第一章免疫组化技术主要内容主要内容理理 论论 基基 础础1 操作流程及基本技术操作流程及基本技术2常常 见见 问问 题题3基础理论基础理论 理论基础是基于利用放射性核素和其他标理论基础是基于利用放射性核素和其他标记物（记物（荧光素荧光素，酶酶，重金属离子等）作为示踪重金属离子等）作为示踪剂，通过剂，通过免疫亲和免疫亲和（抗原（抗原-抗体特异抗体特异性结合）和性结合）和核酸杂交核酸杂交（碱基配对特异性连接）（碱基配对特异性连接）途径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示途径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技术。生物大分子的动态变化而建立的一门染色技术。基本技术基本技术免疫酶组化技术免疫酶组化技术免疫荧光技术免疫荧光技术示踪的两大技术示踪的两大技术实验流程实验流程组织材料的制备组织材料的制备 细胞玻片的制备细胞玻片的制备石蜡切片冰冻切片细胞爬片细胞滴片DAB显色操作流程操作流程抗原修复内源性过氧化物抑制正常血清封闭第一抗体酶标记抗体第二抗体以免疫酶组化为例结果分析免疫酶组化结果图像分析荧光显微镜免疫荧光结果激光共聚焦显微镜常见问题组织或细胞脱片抗原修复时间，方式一抗稀释度DAB显色非特异性背景免疫组化照片免疫组化照片兔股骨头BMP-2染色（复染后）人肝癌HepG2细胞P42染色人乳腺癌HeLa细胞P42荧光染色第二章激光捕获显微切割基本内容基本内容激光捕获显微切割的应用激光捕获显微切割的应用3 激光捕获显微切割的原理激光捕获显微切割的原理2 激光捕获显微切割的发展历史激光捕获显微切割的发展历史1 激光捕获显微切割的优点激光捕获显微切割的优点4 激光捕获显微切割的发展历史激光捕获显微切割的发展历史激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCM)是一项在显微镜直视下，快速从组织切片中分离，纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术。手工（mannual)显微切割显微操纵器（micromanipulator)切割激光束（lasermicrobeam)切割1996年美国国立卫生院国家肿瘤研究所推出LCM技术间接获取靶细胞间接获取靶细胞激光捕获显微切割的原理激光捕获显微切割的基本原理是通过低能红外激光脉冲激活热塑膜乙烯乙酸乙烯酯聚合物（ethylenevinylacetatepolymer,EVA膜)，随后瞬时冷却，选择性地将靶细胞粘附于膜上，再通过特定的裂解液将靶细胞转运至EP管中。EVA膜具有透明的热塑性，含有吸收近红外线的特殊染料，不吸收显微镜所使用的可见光，当使用波长与该染料所特异吸收的波长相一致的激光束照射时，激光的能量绝大部分被EVA膜吸收，随着温度的升高，EVA膜的粘滞度急剧下降，保证了局部的轻度加热就能使其渗透到细胞间隙，并迅速冷却，固化成牢固的连接，足以使靶细胞脱离切片。激光捕获显微切割的应用DNA水平的研究RNA水平的研究蛋白质水平的研究激光捕获显微切割的优点v快速，简便，易行；还可避免无关细胞和碎片的污染。v准确度高。定位准确程度可以达到1m,捕获点范围达到3-5m,因而足以捕获单个细胞。v细胞内分子结构完整。不仅捕获的细胞结构完整，而且剩余组织的结构也未破坏。v特异性强。注意事项注意事项1载玻片上的组织不可太干燥，可用二甲苯保持组织的湿度，在切割前使二甲苯蒸发。2采用冰冻组织切片进行显微切割时应注意切片的厚度，一般在410um为宜。3在切割前可将切片浸在3%的甘油内30s，这样可以降低组织的脆性，并且较容易移取切割下的组织成分。4在每次切割前，应先进行收集器，PCR管盖底观察位置焦面，激光切割线的校准，并在空白处进行预切，以检查参数设置是否妥当，更换物镜后应再次检查参数。食管癌组织癌细胞的激光捕获显微切割照片食管癌组织癌细胞的激光捕获显微切割照片切割前组织照片切割后组织照片切割下来的组织照片第三章图像信号采集系统基本内容基本内容 图像信号采集的原理图像信号采集的原理1 图像信号采集的应用图像信号采集的应用2图像信号采集系统原理输入系统光电转换图像采集系统A/D转换计算机系统图像处理的核心输出系统打印机，光盘等 一一.图像分析系统主要应用图像分析系统主要应用 1：图像处理：图像处理:图像质量的改善图像质量的改善,主要指对医学或主要指对医学或 生物成像的处理与编辑，提高图像的反差、清晰度，生物成像的处理与编辑，提高图像的反差、清晰度，对图像进行必要的修饰；对图像进行必要的修饰；2：图像保存；：图像保存；3：图像测量。图像测量。图像信号采集系统的应用的应用二.图像分析的具体应用一-定量分析 1:1:组织化学定量组织化学定量 核酸定量：核酸定量：Feulgen 法特异对法特异对DNA染色，染色，天青天青B法特异对法特异对RNA染色染色 总蛋白定量：考马斯亮兰总蛋白定量：考马斯亮兰,萘酚黄萘酚黄s 组蛋白：固绿组蛋白：固绿 多糖和糖原：多糖和糖原：PAS反应反应 酶类定量：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶酶类定量：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶图像信号采集系统的应用的应用2:2:免疫组化定量免疫组化定量 某种特定蛋白的定量某种特定蛋白的定量,受体配体的结合受体配体的结合,抗抗原抗体的结合原抗体的结合3:3:原位杂交原位杂交 图像信号采集系统的应用的应用几何测量：面积，长度，直径，周长等；区域测量：数目，面积百分比等；灰度测量：灰度值，光密度，积分光密度，透射率。三.图像分析的具体应用二-图像测量图像信号采集系统的应用的应用（1）灰度值与物质的浓度成反比，灰度值越高反映为阳性表达率越低，灰度值越低则阳性率越高。（2）光密度与物质的浓度成正比，光密度值的大小代表染色的深浅，反映物质的相对浓度。（3）积分光密度为构成被测对像的所有像素点的光密度的和。其与物质的质量成正比，积分光密度值的大小代表被染色物质的多少，反映物质的相对含量。（4）平均透射率反映物体的透光性，亮意味着透光多，暗意味着透光少，光被吸收的多。灰度测量参数的意义应用图像分析的注意事项（1）应选择无疵点，无污渍的薄厚均匀的载玻片和盖玻片。（2）使用相同的封片剂。（3）严格控制切片的厚度和染色条件的一致。（4）测量光密度的样品最好不要复染，尽量减少样品染色的不一致或不均匀。（5）图像获取时光的条件要求严格一致，尽量用40倍的物镜采集图像，以便测量时精确分割图像。第四章第四章 细胞培养技术细胞培养技术主要内容主要内容基本概念基本操作检测方法注意事项细胞系细胞系(cell line)：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。细胞株细胞株(cell strain)：通过克隆形成法或选择法从原代培养物细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物成为细胞株。ATCC(American Type Culture Collection）库库：美国标准培养物库。基本概念基本概念原代培养原代培养原代培养原代培养(Primary culture)(Primary culture)：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。传代培养传代培养传代培养传代培养(Passage Subculture)(Passage Subculture)：细胞从一个培养器皿转移至另一个培养器皿中培养。小牛血清小牛血清(calf serum)：取自出生1030天的小牛。胎牛血清胎牛血清(fatal bovine serum）：取自剖腹产的胎牛或心脏穿刺方法获得。基本概念基本概念基本操作基本操作原代培养：原代培养：从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养组织块培养法消化培养法器官培养法基本操作基本操作传代方法：传代方法：细胞长满培养瓶细胞长满培养瓶70-80%时即可传代时即可传代悬浮细胞直接传代直接传代离心传代离心传代贴壁细胞弃去原培养液加胰酶消化终止消化离心重悬后传代人原髓细胞白血病HL-20细胞人肝癌HepG2细胞基本操作基本操作冻存与复苏冻存与复苏4 10 分钟分钟-20 30 分钟分钟-80 16-18 小时小时(或或隔夜隔夜)-液氮槽液氮槽vapor phase 长期储存。长期储存。冻存程序冻存程序原原 则：则：慢冻速溶慢冻速溶培养瓶培养板n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。超净台nCO2培养箱设定的条件为37，5CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：n用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n保持培养箱内空气干净。定期消毒。n箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。CO2培养箱滤器纯水仪纯水仪细胞计数细胞计数:血球计数板计数法血球计数板计数法细胞数/mL=(4个格子细胞总和/4)x104(每一大格子长，宽均为1mm,深0.1mm,故每个大格子体积为0.1mm3,可容纳0.1ul,那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大格子细胞数的10000倍。）基本操作基本操作细胞检测方法 细胞活力的检测细胞活力的检测 台盼蓝染色法台盼蓝染色法MTT法法台盼蓝染色法：台盼蓝染色法：台盼蓝染色法：台盼蓝染色法：正常细胞不染色，死亡细胞呈蓝色。正常细胞不染色，死亡细胞呈蓝色。细胞活力细胞活力(%)=(总细胞数总细胞数-着色细胞数着色细胞数)总细总细 胞数胞数100%判断时间判断时间：1-3min内计完。注意注意注意注意：为一种粗略的检测存活细胞的方法，不能准确反映细胞活力差异。细胞检测方法 MTTMTT比色法：比色法：比色法：比色法：活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。用酸性异丙醇或用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于溶解后，于 酶标仪上测定光吸酶标仪上测定光吸收值。紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和收值。紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态相关。功能状态相关。细胞存活率=试验组光吸收值对照组光吸收值100%细胞检测方法MTT操作步骤操作步骤 （1）单细胞悬液接种于单细胞悬液接种于96孔培养板；孔培养板；1x105细胞细胞/孔，每孔培孔，每孔培养基总量养基总量200uL，37、5CO2培养箱中培养一段时间培养箱中培养一段时间（根据实根据实验目的决定培养时间）验目的决定培养时间）（2）加入加入MTT，20uL孔；继续培养孔；继续培养3-4小时。小时。（3）吸出孔内培养液后，加入吸出孔内培养液后，加入DMSO液，液，150uL孔，将培孔，将培养板置于微孔板扳荡器上振荡养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔酶标仪检测各孔OD值（检测波长值（检测波长490nm）。）。记录结果，记录结果，绘制细胞生长曲线。绘制细胞生长曲线。细胞检测方法MTT实验注意事项：1.设空白调零孔，即只加培养液，不加细胞。2.每组平行设3-6孔。每组细胞密度一致。3.吸取培养液上清时，枪尖不能接触细胞底部。如是悬浮生长的细胞，一定要离心后再吸上清液。4.检测前，要震荡摇匀。细胞周期的检测细胞周期的检测 PI单染法单染法(流式细胞仪流式细胞仪)细胞检测方法 PI单染色法单染色法 (1)离心收集细胞离心收集细胞（15）106，1000rpm,5min,弃去上弃去上清液；清液；(2)PBS洗涤洗涤2次次x5min；(3)离心去离心去PBS，用预冷的用预冷的70%酒精固定，酒精固定，4过夜过夜；(4)离心去酒精，离心去酒精，PBS洗涤洗涤2次次x5min；(5)加加PI染液染液100L，4 避光染色避光染色30min30min；(6)上流式细胞仪检测，并用随机软件分析。上流式细胞仪检测，并用随机软件分析。细胞检测方法细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 PI单染法单染法(流式细胞仪流式细胞仪)；Annexin-V/PI双染法双染法(流式细胞仪，共聚焦显微镜流式细胞仪，共聚焦显微镜)；TUNEL试剂盒试剂盒；DNA Ladder；电镜检测凋亡小体电镜检测凋亡小体；凋亡相关蛋白的检测凋亡相关蛋白的检测：如：如：Bcl-2,Bax,Caspase-3等。等。可用免疫组化法；流式细胞仪；共聚焦显微镜；可用免疫组化法；流式细胞仪；共聚焦显微镜；Western blot.细胞检测方法Annexin-V/PI双染法双染法 标记的Annexin-V检测细胞外膜上的磷脂酰丝氨酸；PI可以结合死亡或凋亡细胞DNA。(1)离心收集细胞，用4预冷的PBS洗涤，1000rpm,2x5min；(2)用250l结合缓冲液重悬细胞，并使其浓度为1106/mL；(3)取100l细胞悬液于5mL流式管中，加入5lAnnexin-v和10 l的PI溶液，室温避光染色15min；(4)在反应管中加入400lPBS，流式细胞仪分析。细胞检测方法细胞检测方法细胞内离子浓度的检测如：钙离子(流式细胞仪，激光共聚焦显微镜）细胞膜离子通道的检测如：钾离子通道；钠离子通道(膜片钳)细胞内自由基的检测SOD,MDA检测试剂盒；激光共聚焦显微镜细胞膜或线粒体膜电位的检测流式细胞仪，激光共聚焦显微镜细胞内细胞内SOD检测（检测（DCFH-DA标记）标记）v保证细胞生长环境与操作环境的无菌。保证细胞生长环境与操作环境的无菌。v细胞传代时间与实验用细胞均应处于对数生长期。细胞传代时间与实验用细胞均应处于对数生长期。v尽可能保证培养细胞用的培养基或血清为同一批次的。尽可能保证培养细胞用的培养基或血清为同一批次的。v血清，胰蛋白酶应分装保存，避免反复冻融。血清，胰蛋白酶应分装保存，避免反复冻融。v血清首次用前要热灭活补体（血清首次用前要热灭活补体（56水浴，水浴，30min)。v细胞冻存与复苏的原则：慢冻速溶。细胞冻存与复苏的原则：慢冻速溶。v血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。故培养用血清浓度不宜过高。综合反应。故培养用血清浓度不宜过高。细胞培养中应注意的问题第五章流式细胞仪在医学研究中的作用主要内容流式细胞仪原理流式细胞仪的应用注意事项流式细胞仪原理概念 流式细胞术是世纪年代发展起来的一种快速对流式细胞术是世纪年代发展起来的一种快速对 单细胞进行定量分析和分选的新技术单细胞进行定量分析和分选的新技术。如测量细胞的物理 或化学性质,如大小、内部结构、蛋白质、抗原等,并可对其分类收集。流式细胞仪结合了三大体系：流体力学，光学，及电子 学。随着单克隆抗体技术、荧光染料技术等多学科新技术高 度发展,它在生物医学领域的应用越来越广泛。流式细胞仪原理DOTPLOT流式细胞仪原理光的散射信号在流式细胞仪是非常有价值的信息：FSC(前向散射光或小角度散射)：细胞相对大小；SSC(侧向散射光或大角散射)：细胞颗粒度及内部精细结构的特性；FL1,FL2,FL3,FL4,等：不同的荧光波段。散射光和荧光信号接收后经转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可同时测定一个细胞上的多种不同的特征,如细胞大小、含量、细胞表面抗原表达、癌基因蛋白等等。流式细胞仪的应用免疫学中的应用免疫学中的应用常用于免疫细胞的分类、分型常用于免疫细胞的分类、分型,而且还能再进一步区分而且还能再进一步区分各系的亚群。例如用抗各系的亚群。例如用抗4、8、3、56、16的单克隆抗体可以将淋巴细胞分为辅助细胞亚的单克隆抗体可以将淋巴细胞分为辅助细胞亚群，抑制细胞亚群，并区分出自然杀伤细胞群，抑制细胞亚群，并区分出自然杀伤细胞()，然，然后通过对、和细胞水平的测定，检测机体的后通过对、和细胞水平的测定，检测机体的免疫状态。免疫状态。血液学中的应用血液学中的应用对恶性血液病尤其是白血病可进行分类，另外对恶性血液病尤其是白血病可进行分类，另外它通过对细胞周期相关的参数与恶性细胞相关表面它通过对细胞周期相关的参数与恶性细胞相关表面抗原标志同时测定，可以了解这种细胞的动力学特抗原标志同时测定，可以了解这种细胞的动力学特点和恶性细胞的来源，以期达到个体化化疗的目的。点和恶性细胞的来源，以期达到个体化化疗的目的。流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用肿瘤研究中的应用肿瘤研究中的应用流式细胞仪的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃，流式细胞仪的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃，用于测定细胞含量，分辨率高用于测定细胞含量，分辨率高,精确，可为判断肿瘤精确，可为判断肿瘤的生物学行为提供客观而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断的生物学行为提供客观而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。非整倍体的出现是癌前病变发生早期癌和鉴别诊断。非整倍体的出现是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。淋巴瘤、白血病的早期阶段不像上皮性变的一个重要指标。淋巴瘤、白血病的早期阶段不像上皮性肿瘤的癌变或癌变早期具有一定组织上的特征，但应用流式肿瘤的癌变或癌变早期具有一定组织上的特征，但应用流式细胞仪可测得正常细胞和异常细胞含量的微小差别。细胞仪可测得正常细胞和异常细胞含量的微小差别。标本来源标本来源血液、尿液、细胞培养液、胸水、腹水、灌洗液、新鲜实体瘤及活检组织标本、石蜡固定标本等。注意事项注意事项1细胞数量要求达到一定的数目，一般在105-107；2贴壁细胞的收集过程中要注意不能消化过久，以防碎片过多；3细胞固定时要充分打散，以防出现细胞块，堵塞机器喷嘴；4如连续测量多个时间点的样品，可将固定好的样品置于5-20，最后一个时间点一起染色上机检测。第六章激光扫描共聚焦显微镜主要内容激光扫描共聚焦显微镜原理共聚焦显微镜与普通显微镜的不同共聚焦显微镜的应用激光共聚焦显微镜的原理 Confocal 利用放置在光源后的利用放置在光源后的照明针孔照明针孔和放置在检测器前的和放置在检测器前的探测针孔探测针孔实现实现点点照明照明和和点点探测探测，来自光源的光通过照明针孔发射，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针照明针孔孔与与探测针孔探测针孔对对被照射点被照射点或或被探测点被探测点来说是来说是共轭共轭的，因此被探测的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像共焦图像。只要载物台沿着。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。激光共聚焦显微镜的原理激光共聚焦显微镜原理示意图共聚焦显微镜与普通显微镜的不同抑制图像的模糊，获得清晰的图像抑制图像的模糊，获得清晰的图像具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片增加侧向分辨率增加侧向分辨率由于点对点扫描去除了杂散光的影响由于点对点扫描去除了杂散光的影响1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续光学切片，显微无损伤、连续光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组真正的三维重组4.假三维图的显示假三维图的显示5.可沿可沿Z轴（轴（xy平面）和平面）和Y轴（轴（xz平面）方向进行光切平面）方向进行光切6.定量分析定量分析7.时间序列扫描时间序列扫描:xyt、xyzt 和和 xt 扫描扫描8.图像处理图像处理9.旋转扫描旋转扫描10.感兴趣区域扫描感兴趣区域扫描11.光谱扫描光谱扫描激光共聚焦的功能激光共聚焦的应用 定位、定量定位、定量 三维重组三维重组 动态测量动态测量 活细胞或组织内游离活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化分布和浓度的变化 测量（测量（Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位蛋白质的转位活细胞内活细胞内H+浓度（浓度（pH值值）的测量）的测量线粒体线粒体膜电位膜电位的测量的测量其他应用其他应用激光共聚焦的应用一、具体应用一一、具体应用一-定位、定量定位、定量n免疫荧光标记（单标、双标或三免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定标）的定位、定量：如：量：如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的布、两种或三种蛋白的共定位共定位、蛋白与细胞器的、蛋白与细胞器的共定位，核转录因子转位和干细胞的增殖、分化。共定位，核转录因子转位和干细胞的增殖、分化。n细胞凋亡细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI 末端原位杂交末端原位杂交-fitc+PIn荧光原位杂交：荧光原位杂交：染色体基因定位染色体基因定位 激光共聚焦的应用二：具体应用二-标记细胞器线粒体溶酶体高尔基体内质网细胞核激光共聚焦的应用三三.具体应用具体应用-动态测量动态测量 细胞内离子动态变化测量细胞内离子动态变化测量 1)游离游离Ca2+测量测量 2）药物进入细胞的动态过程及定位分布）药物进入细胞的动态过程及定位分布xyzt 扫描扫描激光共聚焦的应用第七章第七章 Western Blot主要内容主要内容 基本知识点基本知识点 主要操作步骤主要操作步骤 注意事项注意事项基本知识点基本知识点SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变，这样这样SDS-蛋白蛋白 质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷 和形状的影响，而只与蛋白质的分子量有关。和形状的影响，而只与蛋白质的分子量有关。由于由于SDS和和DTTDTT的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。量。SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯 酰胺的浓度和交联度。酰胺的浓度和交联度。SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围*丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）1512431016687.536945.057212*双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为1：29。基本知识点基本知识点主要操作步骤蛋白质分离蛋白质分离(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳)转转 膜膜免免 疫疫 染染 色色(抗原抗原-抗体反应抗体反应)主要操作步骤主要操作步骤蛋白质的分离蛋白质的分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳注意：注意：每孔上样蛋白质的总量应一致；每孔上样蛋白质的总量应一致；上样体积不超过上样体积不超过20l。滤纸滤纸胶胶膜膜主要操作步骤主要操作步骤转转 膜（半干法）膜（半干法）主要操作步骤主要操作步骤免疫显色免疫显色封闭一抗二抗显色干燥保存注意事项注意事项1：膜胶滤纸；：膜胶滤纸；短路的原因是上下滤纸有接触，只要避免短路的原因是上下滤纸有接触，只要避免接触就行。滤纸在转移缓冲液中湿润时会扩大，这点在裁剪接触就行。滤纸在转移缓冲液中湿润时会扩大，这点在裁剪滤纸时应考虑到。滤纸时应考虑到。2：胶浓度的选择，电压与电流的选择应根据蛋白质分子量的：胶浓度的选择，电压与电流的选择应根据蛋白质分子量的大小和膜面积而定。大小和膜面积而定。凝胶上所加电压为凝胶上所加电压为8V/cm 2。3：要标记内参照（要标记内参照（GAPDH或或-actin)4：转膜与封闭要排除气泡；整个操作过程应戴手套。转膜与封闭要排除气泡；整个操作过程应戴手套。第八章膜片钳主要内容v膜片钳的原理v膜片钳的应用膜片钳的概念1976年由德国生理学家Nehetr和Sakmann建立的膜片钳技术是一种以记录过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的(或数个)离子通道活动的技术“它为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征及通透性和选择性等膜信息,提供了最直接的手段。作为先进的细胞电生理技术,膜片钳一直被奉为研究离子通道的金标准。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性，分子结构，药物作用机制等进行深入的研究。该技术可将一尖端经加热抛光的玻璃微电极吸管吸附一片只有几平方微米的细胞膜,形成吸管内外近似电密封。再在吸管内施以负压,使微电极尖端与记录的细胞膜片表面形成封接,因而可通过微电极直接对膜片进行电压钳制,无需使用其它微电极。膜片钳技术对膜电压的钳制是通过负反馈回路而实现的。这种负反馈电路要求细胞膜电位在所有时间都与经放大器输出的指令电压相等。当由于离子通道的开放造成膜电位与指令电位之间发生差异时,微电极放大器就通过记录电极向胞内自动注入大小相等和方向相反的电流而使膜电位得以钳制，通过记录放大器用以维持细胞膜钳制电位所输出的电流大小,即可推算出由于离子通道开放所产生的电流大小,以及由此导致的膜电导的改变。膜片钳原理膜片钳主要功能直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程；区分离子通道的离子选择性；能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率；膜片钳的主要应用1.细胞膜离子通道的性质鉴定及其动力学研究；2.研究细胞分泌：其原理在于细胞分泌的胞吐过程是在细胞膜上进行的,它会引起细胞形态的改变和物质流动,从而导致膜片参数发生变化。尤其是伴随着分泌活性,整个细胞表面积(与膜电容比较)必然增加,通过测量细胞膜电容,便可估计单细胞分泌活性；3.研究信号转导；4.研究新的离子通道；5.分子生物学研究：膜片钳技术也是研究转运蛋白基因克隆、表达和功能分析的有效手段；6.金属离子作用于细胞膜行为的研究：主要应用于植物学，研究稀土元素对植物的影响；7.其他应用。第九章Real-TimePCR主要内容主要内容v 原原 理理v 基本概念基本概念v 优优 点点v 常用的探针种类常用的探针种类原原 理理RT-PCR是指在是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号的指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来及时测定特异性产物的量，并据此判断目的基因的初始量强弱来及时测定特异性产物的量，并据此判断目的基因的初始量。其应用探针的基本原理就是根据荧光共振能量转移现象其应用探针的基本原理就是根据荧光共振能量转移现象(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)设计的。当设计的。当一个荧光分子一个荧光分子(供体分子供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分受体分子子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰竭，的激发光谱相重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰竭，这种现象即是这种现象即是FRET。随着距离的延长，随着距离的延长，FRET现象减弱。现象减弱。基本概念基本概念(1)Ct值：又称循环域值，表示在值：又称循环域值，表示在PCR循环中，最先循环中，最先(2)监测到的高于基线水平的荧光信号时所对应的循环监测到的高于基线水平的荧光信号时所对应的循环(3)数。数。Ct值越低表示起始模板的拷贝数越高；值越低表示起始模板的拷贝数越高；(4)(2)Rn值：代表在值：代表在PCR反应中所检测到的荧光信号反应中所检测到的荧光信号(5)水平。水平。(6)(3)Rn值：由标准报告值减去基线信号值而得。值：由标准报告值减去基线信号值而得。(7)基线信号基线信号 值是通过在值是通过在PCR反应刚开始的几个循环反应刚开始的几个循环(8)时设置基线而得。时设置基线而得。优点(1)操作简便，快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性操作简便，快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。(2)由于是在封闭的体系中完成扩增，并进行实时测定，由于是在封闭的体系中完成扩增，并进行实时测定，大大降低了污染的可能性，且无需在扩增后进行操作。大大降低了污染的可能性，且无需在扩增后进行操作。(3)定量结果准确。定量结果准确。常用的探针和荧光染料常用的探针和荧光染料Taqman探针；杂交探针；分子信标；Scorpions.SYBRGreen应用SYBRGreenI的原理能非特异地掺入到双链DNA中。在游离状态下不发荧光，但一旦与双链DNA结合，便会发出荧光。原理SYBRGreenI优缺点优缺点优点优点(1)可以与任意的引物，模板相结合，用于任意的反应体系中。(2)价格便宜。缺点缺点由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中有非特异性扩增，那就会影响定量结果的可靠性与重复性。要避免这一不利因素，一方面可以做扩增产物的熔点曲线分析，区分PCR产物和本底造成的荧光信号；另一方面就是选择良好的引物与探针，并优化反应条件以消除非特异性影响。数据分析1.标准曲线法：绝对定量法2.Ct值法（2-CT）：相对定量法