分子医学技能-PCR技术应用.ppt

生物化学与分子生物学进展 目 录n PCR技术的创建n PCR的原理n PCR的类型n PCR的应用PCR PCR 可以可以可以可以在在在在3 3 3 3小时小时小时小时内内内内把把把把 特特特特定的基因定的基因定的基因定的基因指数指数指数指数放大放大放大放大染色体染色体染色体染色体神奇而又简单的神奇而又简单的PCRPCRPCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCR技术的创建一、最初的理论描述一、最初的理论描述一、最初的理论描述一、最初的理论描述KhoranaKhoranaKhoranaKhorana n nKhorana Khorana Khorana Khorana(1971)(1971)(1971)(1971)等等等等最最最最早早早早提提提提出出出出核核核核酸酸酸酸体体体体外外外外扩扩扩扩增增增增的的的的设设设设想想想想：“经经经经DNADNADNADNA变变变变性性性性，与与与与合合合合适适适适的的的的引引引引物物物物杂杂杂杂交交交交，用用用用DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶延延延延伸伸伸伸引引引引物物物物，并不断重复该过程便可合成并不断重复该过程便可合成并不断重复该过程便可合成并不断重复该过程便可合成tRNAtRNAtRNAtRNA基因。基因。基因。基因。”n n但但但但由由由由于于于于当当当当时时时时基基基基因因因因序序序序列列列列分分分分析析析析方方方方法法法法尚尚尚尚未未未未成成成成熟熟熟熟，热热热热稳稳稳稳定定定定DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶尚尚尚尚未未未未报报报报道道道道以以以以及及及及引引引引物物物物合合合合成成成成的的的的困困困困难难难难，这这这这种种种种想想想想法法法法似似似似乎乎乎乎没没没没有有有有实实实实际际际际意意意意义义义义。加加加加上上上上70707070年年年年代代代代初初初初分分分分子子子子克克克克隆隆隆隆技技技技术术术术的的的的出出出出现现现现提提提提供供供供了了了了一一一一种种种种克克克克隆隆隆隆和和和和扩扩扩扩增增增增基基基基因因因因的的的的途途途途径径径径，所所所所以以以以，KhoranaKhoranaKhoranaKhorana的的的的设设设设想想想想被被被被人人人人们遗忘了们遗忘了们遗忘了们遗忘了二、二、二、二、PCRPCRPCRPCR技术的发明技术的发明技术的发明技术的发明Kary MullisKary MullisKary MullisKary Mullisn n1985198519851985年年年年，Kary Kary Kary Kary MullisMullisMullisMullis在在在在CetusCetusCetusCetus公公公公司司司司工工工工作作作作期期期期间间间间，发发发发明明明明了了了了PCRPCRPCRPCRn nMullisMullisMullisMullis要要要要合合合合成成成成DNADNADNADNA引引引引物物物物来来来来进进进进行行行行测测测测序序序序工工工工作作作作，却却却却常常常常为为为为没没没没有有有有足足足足够多的模板够多的模板够多的模板够多的模板DNADNADNADNA而烦恼而烦恼而烦恼而烦恼n n1983198319831983年年年年4 4 4 4月月月月的的的的一一一一个个个个星星星星期期期期五五五五晚晚晚晚上上上上，他他他他开开开开车车车车去去去去乡乡乡乡下下下下别别别别墅墅墅墅的的的的路路路路上上上上PCR技术的创建n nPCRPCR从构想成为现实从构想成为现实 19831983年年1212月，月，MullisMullis用同位素标记法看到了用同位素标记法看到了1010个循环后的个循环后的49 bp49 bp长度的第一个长度的第一个PCRPCR片段；片段；19851985年年1010月月2525日申请了日申请了PCRPCR的专利，的专利，19871987年年7 7月月2828日批准（专利日批准（专利号号4,683,202 4,683,202），），MullisMullis是第一发明人；是第一发明人；19851985年年1212月月2020日在日在ScienceScience杂志上发表了第一篇杂志上发表了第一篇PCRPCR的学术论文，的学术论文，MullisMullis是共同作者；是共同作者；19861986年年5 5月，月，MullisMullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习学习PCRPCR的方法。的方法。有关有关PCRPCR反应反应PCR反应体系PCR过程PCR的基本原理标准的标准的标准的标准的PCRPCRPCRPCR反应体系反应体系反应体系反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200200mol/Lmol/L引物引物 各各0.10.11.01.0 mol/Lmol/LTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 0.50.5 2 2.5U5U缓冲液（缓冲液（MgMg2+2+）1 1.5 5 2 2.0mmol/L0mmol/L模板模板DNA DNA 1 1g g有关有关PCRPCR反应反应PCR反应条件PCR过程PCR的基本原理94949494变性变性变性变性5555退火退火退火退火Mullis的构思1983年PCR反应条件PCR过程PCR的基本原理有关有关PCRPCR反应反应5533XX延伸延伸延伸延伸（DNADNADNADNA聚合酶）聚合酶）聚合酶）聚合酶）55949455553737?三、三、三、三、PCRPCR技术的改进和发展技术的改进和发展技术的改进和发展技术的改进和发展n n19881988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术，大大提技术，大大提高了高了PCRPCR的效率。的效率。Taq DNATaq DNA聚合酶（聚合酶（Thermus aquaticusThermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20Saiki,1988Saiki,1988年年年年PCRPCR技术的发展技术的发展727294945555PCRPCR循环循环循环循环三、三、三、三、PCRPCR技术的改进和发展技术的改进和发展技术的改进和发展技术的改进和发展n n19881988年第一台年第一台PCRPCR仪问世，仪问世，PCRPCR逐步实现自动化逐步实现自动化n n19891989年美国年美国ScienceScience杂志列杂志列PCRPCR为十余项重大科学发明之首，为十余项重大科学发明之首，比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年。爆炸年。n n19931993年，年，MullisMullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。因此项技术荣获诺贝尔化学奖。Kary B.Mullis（1944）http:/PCR仪的变迁仪的变迁n三个水浴锅，用手移动三个水浴锅，用手移动 （MullisMullis等人当时用的）等人当时用的）n电加热块电加热块 自来水冷却自来水冷却 （PEPE，19881988）n电加热块电加热块 内置循环液冷却内置循环液冷却 （PEPE，19891989）n三个加热块三个加热块 机械手机械手 （StrategeneStrategene，19941994）n半导体制冷和加热（半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,EppendorfMJ,PE,BioMetra,Eppendorf）n空气加热空气加热 (Roche)(Roche)n梯度梯度PCRPCR仪仪,实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR仪仪nLab-on-chipLab-on-chip式的式的PCRPCR仪仪(芯片芯片PCR)PCR)全新全新4 4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCRPCR仪仪普通普通PCRPCR仪、梯度仪、梯度PCRPCR仪仪PCR技术的原理 无细胞分子克隆法：以拟扩增的无细胞分子克隆法：以拟扩增的无细胞分子克隆法：以拟扩增的无细胞分子克隆法：以拟扩增的DNADNA分子为模板，以一对分分子为模板，以一对分分子为模板，以一对分分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNADNA聚合酶的作用下，按聚合酶的作用下，按聚合酶的作用下，按聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNADNA合成。通过合成。通过合成。通过合成。通过不断重复这一过程，可以使目的不断重复这一过程，可以使目的不断重复这一过程，可以使目的不断重复这一过程，可以使目的DNADNA片段得到扩增。另一方面，新片段得到扩增。另一方面，新片段得到扩增。另一方面，新片段得到扩增。另一方面，新合成的合成的合成的合成的DNADNA片段也可以作为模板，因而片段也可以作为模板，因而片段也可以作为模板，因而片段也可以作为模板，因而PCRPCR技术可使技术可使技术可使技术可使DNADNA的合成量的合成量的合成量的合成量呈指数型增长。呈指数型增长。呈指数型增长。呈指数型增长。1 1stst cycle cycle2 2ndnd cycle cycle3 3rdrd cycle cycle过过过过 程程程程变变变变 性性性性退退退退 火火火火延延延延 伸伸伸伸经典循环参数（500bp以内）94 30s 94 30s 55 45s55 45s72 1min72 1min94 5min94 5min30次72 7min72 7min4 forever4 foreverPCR技术的特点n n灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高1.1.1.1.30303030轮循环轮循环轮循环轮循环,扩增量达扩增量达扩增量达扩增量达2 2 2 230303030个拷贝（个拷贝（个拷贝（个拷贝（101010109 9 9 9拷贝）拷贝）拷贝）拷贝）2.2.2.2.将模板从皮克将模板从皮克将模板从皮克将模板从皮克(pg=10(pg=10(pg=10(pg=10-12-12-12-12)量级扩增到微克量级扩增到微克量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10(ug=10(ug=10-6-6-6-6)水平水平水平水平3.3.3.3.能从能从能从能从100100100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞4.4.4.4.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3 3 3个个个个PFUPFUPFUPFU5.5.5.5.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3 3 3个细菌个细菌个细菌个细菌n n特异性强特异性强特异性强特异性强 引物序列与模板结合的特异性引物序列与模板结合的特异性引物序列与模板结合的特异性引物序列与模板结合的特异性n n快速简便快速简便快速简便快速简便 一次性加好反应液，一次性加好反应液，一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 2 2 24 4 4 4小时即可完成扩增小时即可完成扩增小时即可完成扩增小时即可完成扩增1 1 1 1）不对称）不对称）不对称）不对称PCRPCRPCRPCR2)2)2)2)反向反向反向反向PCRPCRPCRPCR3 3 3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCRPCRPCR4 4 4 4）LP-PCRLP-PCRLP-PCRLP-PCR5 5 5 5）锚定）锚定）锚定）锚定PCRPCRPCRPCR6 6 6 6）PCRPCRPCRPCR固相分析法固相分析法固相分析法固相分析法7)7)7)7)原位原位原位原位PCRPCRPCRPCR8 8 8 8）逆转录）逆转录）逆转录）逆转录PCRPCRPCRPCR9 9 9 9）荧光定量）荧光定量）荧光定量）荧光定量 PCRPCRPCRPCR PCR的类型 目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限 制性引物制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.010.5M,0.010.5M,关键是限制关键是限制 性引物的绝对量。性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究 1.不对称不对称PCR 高浓度引物低浓度引物2.2.反向反向PCR(reverse PCR(reverse PCR)PCR)用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段对某个已片段对某个已知知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。可可对对未未知知序序列列扩扩增增后后进进行行分分析析,如如探探索索邻邻接接已已知知DNADNA片片段段的的序序列列；用用于于仅仅知知部部分分序序列列的的全全长长cDNAcDNA的的克克隆隆,扩扩增增基基因因文文库库的的插入插入DNADNA；建立基因组步移文库。；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶3.3.多重多重PCRPCR（复合（复合PCRPCR）在同一在同一在同一在同一PCRPCR反应体系中，设计多对引物，同时扩增一份反应体系中，设计多对引物，同时扩增一份反应体系中，设计多对引物，同时扩增一份反应体系中，设计多对引物，同时扩增一份DNADNA样样样样品中几个不同靶区域的品中几个不同靶区域的品中几个不同靶区域的品中几个不同靶区域的DNADNA片段，这一过程称为多重片段，这一过程称为多重片段，这一过程称为多重片段，这一过程称为多重PCRPCR。可。可。可。可用于检测特定基因序列的大小、缺失、突变是否存在。用于检测特定基因序列的大小、缺失、突变是否存在。用于检测特定基因序列的大小、缺失、突变是否存在。用于检测特定基因序列的大小、缺失、突变是否存在。电电电电泳泳泳泳引物引物12341234DMD：人类肌营养不良基因：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失4.LP-PCR（Labelled primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检用以直观地检测目的基因。测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物5.锚定锚定PCR（anchored PCR,A-PCR）PCRPCR的局限：需了解靶基因片段两侧的序列的局限：需了解靶基因片段两侧的序列 对于未知序列怎么办？对于未知序列怎么办？cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG5 5 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG55CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC锚定锚定PCR首先合成第一链首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作一起作PCR扩增扩增6.PCR6.PCR固相分析法固相分析法模模板板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探探针针亲和固亲和固相介质相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作7.7.原位原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是由）是由）是由）是由HaaseHaase等等等等于于于于19901990年首创。它是年首创。它是年首创。它是年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系利用完整的细胞作为一个微小的反应体系利用完整的细胞作为一个微小的反应体系利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段来扩增细胞内的目的片段来扩增细胞内的目的片段来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下在不破坏细胞的前提下在不破坏细胞的前提下在不破坏细胞的前提下,利用一些特定利用一些特定利用一些特定利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。的检测手段来检测细胞内的扩增产物。的检测手段来检测细胞内的扩增产物。的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。扩增。可进行细胞内定位。扩增。可进行细胞内定位。扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列适用于检测病理切片中含量较少的靶序列适用于检测病理切片中含量较少的靶序列适用于检测病理切片中含量较少的靶序列既既既既往往往往鉴鉴鉴鉴定定定定细细细细胞胞胞胞内内内内特特特特异异异异序序序序列列列列一一一一般般般般采采采采用用用用原原原原位位位位杂杂杂杂交交交交（ISHISH）,但但但但在在在在每每每每个个个个细细细细胞胞胞胞中中中中目目目目的的的的片片片片段段段段的的的的拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数少少少少于于于于1010的的的的情情情情况况况况下下下下,该该该该方方方方法法法法的的的的敏敏敏敏感感感感度度度度就就就就明明明明显显显显下下下下降降降降。而而而而标标标标准准准准的的的的PCRPCR则则则则可可可可扩扩扩扩增增增增出出出出细细细细胞胞胞胞内内内内单单单单拷拷拷拷贝贝贝贝的的的的序序序序列列列列,敏敏敏敏感感感感度度度度很高很高很高很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。但却未能与细胞形态学研究相结合。但却未能与细胞形态学研究相结合。但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCRISPCR则可把这两者结合起来则可把这两者结合起来则可把这两者结合起来则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的成为细胞学诊断中一种崭新的成为细胞学诊断中一种崭新的成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内以及分析细胞内以及分析细胞内以及分析细胞内RNARNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细表达产物等方面发挥一定作用。在检测细表达产物等方面发挥一定作用。在检测细表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。胞的潜在感染方面也具有重要意义。胞的潜在感染方面也具有重要意义。胞的潜在感染方面也具有重要意义。原位原位PCR的作用的作用操作步骤操作步骤1.1.1.1.细细细细胞胞胞胞或或或或组组组组织织织织固固固固定定定定：细细细细胞胞胞胞经经经经固固固固定定定定和和和和乙乙乙乙醇醇醇醇通通通通透透透透化化化化处处处处理理理理后后后后便便便便适适适适于于于于一一一一般般般般PCRPCRPCRPCR试剂（包括引物和试剂（包括引物和试剂（包括引物和试剂（包括引物和TaqTaqTaqTaq酶）进入酶）进入酶）进入酶）进入2.PCR2.PCR2.PCR2.PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3.3.3.3.原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照阳性对照B.阴性对照阴性对照C.原位检测原位检测mRNA表达表达8.8.逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对对PCRPCR产物进产物进行标记跟踪行标记跟踪,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以结合相应的软件可以对结果进行分析对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。计算待测样品的初始模板量。荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR仪仪仪仪 荧光定量荧光定量PCRPCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的统的PCRPCR仪仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。通常配有电脑系统及相应的分析软件。9.9.荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR标记方法标记方法标记方法标记方法 内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)5353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitationTaqman ProbeRQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR与普通与普通与普通与普通PCRPCR的比较的比较的比较的比较 实时在线监控实时在线监控实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了提高了PCRPCR反应反应的特异性的特异性 增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控全程监控,准确的算法进行定量准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便,无需跑胶无需跑胶无需跑胶无需跑胶 荧光定量荧光定量PCR仪仪 普通普通PCR仪仪PCR的应用领域n n生物学基础研究生物学基础研究生物学基础研究生物学基础研究 目的基因扩增和鉴定；目的基因扩增和鉴定；DNADNA序列测定；定点突变；基因表达分析序列测定；定点突变；基因表达分析n n医学临床应用医学临床应用医学临床应用医学临床应用遗传疾病基因诊断；致病病原体检测；癌基因检测；器官移植组织配遗传疾病基因诊断；致病病原体检测；癌基因检测；器官移植组织配型型n n法医学物证鉴定法医学物证鉴定法医学物证鉴定法医学物证鉴定个体识别；亲子鉴定个体识别；亲子鉴定n n其他其他其他其他 动、植物检疫（转基因动植物检测）；生物物种鉴定，系统进化研动、植物检疫（转基因动植物检测）；生物物种鉴定，系统进化研究；分子考古学（恐龙究；分子考古学（恐龙DNADNA分析）等分析）等 分子克隆分子克隆（目的基因的获取和鉴定目的基因的获取和鉴定）重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段PCRPCR技术应用于科学研究技术应用于科学研究55Bam H IBam H IEcoR IEcoR IBam H IBam H IEcoREcoR I IPCR(5端引入限制酶识别位点端引入限制酶识别位点)PBS groupK5 group*n n K5K5 通过抑制肿瘤血管新生抑制肝癌生长通过抑制肿瘤血管新生抑制肝癌生长通过抑制肿瘤血管新生抑制肝癌生长通过抑制肿瘤血管新生抑制肝癌生长（RT-PCRRT-PCR技术获得技术获得技术获得技术获得K5K5基因）基因）基因）基因）PBS K5 PCRPCR技术应用于科学研究技术应用于科学研究Yang X,et al.Cancer Biology&Therapy,2006.Gu X,Yang X*,et al.Apoptosis.2011Li L,Yang X*,et al.J Biol Chem.2014.n n 围绕二硫键构建不同结构的围绕二硫键构建不同结构的围绕二硫键构建不同结构的围绕二硫键构建不同结构的K5K5缺失突变体缺失突变体缺失突变体缺失突变体（PCRPCR缺失突变）缺失突变）缺失突变）缺失突变）PCRPCR技术应用于科学研究技术应用于科学研究Yang X,et al.Journal of Cellular and Molecular Medicine,2010Li C,Yang X,et al.Cornea.2013临床基因诊断临床基因诊断A内源性病变基因正常人A病 人PCRPCR技术应用于临床检测技术应用于临床检测遗传疾病的基因诊断遗传疾病的基因诊断 基因缺失、插入或置换等地中海贫血珠蛋白链合成不平衡PCRPCR技术应用于临床检测技术应用于临床检测A正常人正常人病病 人人正正常常病病人人A病原微生物基因病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)PCR技术应用于临床检测技术应用于临床检测登革病毒的检测登革病毒的检测登革病毒的检测登革病毒的检测登革病毒基因检测登革病毒基因检测 1：Marker2：阳性模板：阳性模板3：待测样品：待测样品14：已确诊乙肝病人样品：已确诊乙肝病人样品5:待测样品待测样品26:待测样品待测样品37:阳性模板阳性模板乙肝病毒基因检测乙肝病毒基因检测 阴性阴性阴性阴性乙肝病毒基乙肝病毒基因携带者因携带者基因检测在乙肝诊疗各阶段的应用基因检测在乙肝诊疗各阶段的应用药物治疗方案的确定药物治疗方案的确定（用药：干扰素、拉米夫定、（用药：干扰素、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦）阿德福韦、恩替卡韦）药物治疗药物治疗（疗效评价）（疗效评价）前前C C区区18961896位点突变检测试剂盒位点突变检测试剂盒跟踪随访跟踪随访乙乙 肝肝 病病 毒毒 定定 量量 检检 测测 试试 剂剂 盒盒确确诊诊病毒学病毒学分析分析乙肝病毒分型检测试剂盒乙肝病毒分型检测试剂盒拉米夫定耐药检测试剂盒拉米夫定耐药检测试剂盒阿德福韦耐药检测试剂盒阿德福韦耐药检测试剂盒共价闭合环状共价闭合环状DNA(cccDNA)检测试剂盒检测试剂盒恩替卡韦耐药检测试剂盒恩替卡韦耐药检测试剂盒PCR-RFLPPCR-RFLP法：法：(PCR(PCR产物限制性酶切片断多态性分析产物限制性酶切片断多态性分析)Ras癌基因限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶PCR技术应用于临床检测技术应用于临床检测突变限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶正常正常正常正常突变突变突变突变电电泳泳法医学物证鉴定法医学物证鉴定 个体识别；亲子鉴定方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性）DNA指纹 PCR-ASO（等位基因特异性寡核苷酸）PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）多态性 PCR-STR（短串联重复序列）多态性 PCR-SSCP（单链构象多态性）线粒体DNA测序PCRPCR技术应用于法医学鉴定技术应用于法医学鉴定性别鉴定女女性性男男性性Y Y引物引物PCR男性男性 女性女性n PCR-STR(short tandem repeat)多态性检测多态性检测PCR；电泳检测PCRPCR技术应用于法医学鉴定技术应用于法医学鉴定现场血迹现场血迹现场血迹现场血迹 嫌疑人嫌疑人嫌疑人嫌疑人1 1 1 1 嫌疑人嫌疑人嫌疑人嫌疑人2 2 2 2 嫌疑人嫌疑人嫌疑人嫌疑人3 3 3 3个体识别PCRPCR技术应用于法医学鉴定技术应用于法医学鉴定父父父父 父父父父 子子子子 母母母母亲子鉴定PCRPCR技术应用于法医学鉴定技术应用于法医学鉴定小小 结结pp 掌握掌握PCR技术的原理及基本步骤技术的原理及基本步骤pp 熟悉熟悉PCR技术的广泛应用技术的广泛应用参考书目参考书目未未 结结 束束 语语pp 神奇且具革命性意义神奇且具革命性意义 pp 予精妙于简单予精妙于简单pp 启发：勤于思考、勇于创新启发：勤于思考、勇于创新 Thank you Thank you