第四篇典型发酵工程过程篇.pptx

第四篇典型发酵工程过程篇第四篇典型发酵工程过程篇第第27章章 抗生素生产工艺抗生素生产工艺2727、1 1 概概 述述(视频抗生素滥用之祸视频抗生素滥用之祸)27、1、1 抗生素抗生素:n微生物微生物(细菌、真菌、放线菌细菌、真菌、放线菌)或动植物在生命活动中产生或动植物在生命活动中产生得得,低浓度下选择性地抑制或杀灭低浓度下选择性地抑制或杀灭其她微生物或肿瘤其她微生物或肿瘤细胞得细胞得具有生物活性得物质具有生物活性得物质。n抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗原虫、抗寄生虫、抗血纤维蛋抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗原虫、抗寄生虫、抗血纤维蛋白溶酶作用。白溶酶作用。n目前人们在生物体内发现得目前人们在生物体内发现得 6000多种抗生素多种抗生素,约约60来自来自放线菌。放线菌。27、1、2 抗生素发展抗生素发展史史n抗生素就是现代生物学史上最伟大得成就之一。抗生素就是现代生物学史上最伟大得成就之一。n就是人们使用最多得药物就是人们使用最多得药物,也就是制药工业中利润也就是制药工业中利润最高得产品。世界各国由发酵法生产得抗生素约最高得产品。世界各国由发酵法生产得抗生素约400种种,广泛应用得仅广泛应用得仅120种。种。n抗生素生产为近代微生物技术中最大产业之一抗生素生产为近代微生物技术中最大产业之一,世世界产量超过界产量超过35000吨吨,不但在经济上占有重要位置不但在经济上占有重要位置,且为人类健康作了出巨大贡献。且为人类健康作了出巨大贡献。n青霉素青霉素:弗莱明发现弗莱明发现 青霉素就是最早发现并用于临床得一种抗生素。青霉素就是最早发现并用于临床得一种抗生素。1928年英国人年英国人FIeming发现发现,20世纪世纪40年代投入工年代投入工业生产业生产,它能有效地控制伤口得细菌感染它能有效地控制伤口得细菌感染,在二战期在二战期间挽救了数百万战争中受伤者得性命。间挽救了数百万战争中受伤者得性命。n推动抗生素发展推动抗生素发展:牛津大学病理学教授弗洛里、钱牛津大学病理学教授弗洛里、钱恩等优秀得化学家。恩等优秀得化学家。n1952年得诺贝尔生理学或医学奖颁发给年得诺贝尔生理学或医学奖颁发给塞尔曼塞尔曼亚伯亚伯拉罕拉罕瓦克斯曼瓦克斯曼(Selman Abraham Waksman),她发现了她发现了链霉素链霉素,第一有效抗生素用于治疗肺结核。第一有效抗生素用于治疗肺结核。27、1、3 抗生素得抗生素得分类分类抗生素得分类抗生素得分类27、2 抗生素工业发酵生产过抗生素工业发酵生产过程程 1、生物合成法生物合成法:传统方法传统方法 “工程菌工程菌”制造法制造法 细胞融合技术法细胞融合技术法 2、化学合成法化学合成法;3、生物合成生物合成+化学合成法化学合成法生生产产方方法法27、2、1 生物合成法生物合成法:传统方法传统方法:多数抗生素就是由放线菌与霉菌产生多数抗生素就是由放线菌与霉菌产生 菌种从土壤中分离、筛选获得菌种从土壤中分离、筛选获得,采用深层通风采用深层通风搅拌发酵罐生产。搅拌发酵罐生产。由于传统方法存在很多不足由于传统方法存在很多不足,人们采用基因工人们采用基因工程与细胞融合技术程与细胞融合技术,对抗生素产生菌进行了改造对抗生素产生菌进行了改造,可以制造出许多高效低毒得新型抗生素可以制造出许多高效低毒得新型抗生素,通过改革通过改革工艺工艺,使抗生素产量成倍地增长。使抗生素产量成倍地增长。“工程菌工程菌”制造法制造法 第一次由第一次由“工程菌工程菌”制造得全新抗生素制造得全新抗生素麦麦迪紫红素迪紫红素A就是美国报道得。将产放线紫红素得就是美国报道得。将产放线紫红素得部分基因插入产麦迪霉素得放线菌中部分基因插入产麦迪霉素得放线菌中,构建得构建得“工工程菌程菌”产生了全新得抗生素。产生了全新得抗生素。我国新构建得生产丁胺卡那霉素得我国新构建得生产丁胺卡那霉素得“工程菌工程菌”,就就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中就就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得得。获得得。新得新得“工程菌工程菌”生产得新抗生素毒副作用小生产得新抗生素毒副作用小,对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。细胞融合技术法细胞融合技术法 对抗生素产生菌采用细胞融合技术得成果更对抗生素产生菌采用细胞融合技术得成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高产率比原菌株提高100倍。倍。目前目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等素等20多种抗生素得育种工作多种抗生素得育种工作,不久将来会有更多不久将来会有更多得由得由“工程菌工程菌”生产得新型抗生素问世生产得新型抗生素问世。27、2、2 化学合成法化学合成法 根据某种抗生素得化学组成与结构根据某种抗生素得化学组成与结构,通过化学通过化学合成得方法合成得方法,可生产部分抗生素。如氯霉素、磷霉可生产部分抗生素。如氯霉素、磷霉素等。素等。经过化学合成方法与控制条件得不断深入研经过化学合成方法与控制条件得不断深入研究究,越来越多得抗生素可用化学合成法生产。越来越多得抗生素可用化学合成法生产。大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静继续保持安静27、2、3 生物合成加化学合成法生物合成加化学合成法 许多细菌逐渐出现了抗药性许多细菌逐渐出现了抗药性,证实某些抗药性证实某些抗药性因子位于细菌内得质粒上因子位于细菌内得质粒上,质粒在细菌之间转移使质粒在细菌之间转移使抗性菌日益增多抗性菌日益增多,抗生素疗效就越来越低。抗生素疗效就越来越低。为对付细菌得抗药性为对付细菌得抗药性,科学家对抗生素进行了科学家对抗生素进行了“整容手术整容手术”,细菌因再无法识别改头换面得抗生细菌因再无法识别改头换面得抗生素而被抑制或杀死。素而被抑制或杀死。现在已能使用克隆了酰化酶基因得现在已能使用克隆了酰化酶基因得“工程菌工程菌”(大肠杆菌大肠杆菌)高效率得生产半合成抗生素。临床高效率得生产半合成抗生素。临床现在使用得特效药物先锋霉素现在使用得特效药物先锋霉素(头孢菌素类头孢菌素类)、氨、氨苄青霉素就就是这类半合成抗生素类药物。苄青霉素就就是这类半合成抗生素类药物。生产前期研究生产前期研究n产生菌得筛选产生菌得筛选n抗菌性试验抗菌性试验n提取、精制、鉴定提取、精制、鉴定n毒性试验毒性试验n药理与临床试验药理与临床试验 Agar diffusion assayagar plate琼脂培养基琼脂培养基lawn of test bacteria测测 试试 菌菌 苔苔filter papers soakedwith test compounds含含 药药 物物 滤滤 纸纸zones of inhibition(no growth)抑菌圈抑菌圈微生物发酵生产抗生素得基本过程微生物发酵生产抗生素得基本过程n菌种菌种孢子制备孢子制备种子准备种子准备发酵发酵发酵发酵液过滤与预处理液过滤与预处理提取及精制提取及精制成品包装成品包装nFleming分离得点青霉分离得点青霉,只能产生只能产生2U/ml青霉素。青霉素。n目前全世界用于生产青霉素得高产菌株目前全世界用于生产青霉素得高产菌株,大都由一大都由一种种产黄青霉菌产黄青霉菌株经不同改良途经得到株经不同改良途经得到;n20世纪世纪70年代前育种年代前育种:诱变与随机筛选方法诱变与随机筛选方法;n现在原生质体融合技术、基因克隆技术青霉素工现在原生质体融合技术、基因克隆技术青霉素工业发酵已达业发酵已达80000U/ml。n生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生孢子孢子,也可用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂也可用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂,在在-70冰冰箱或液氮中保存孢子悬浮液与营养菌丝体。箱或液氮中保存孢子悬浮液与营养菌丝体。27、3 青霉素生产工艺青霉素生产工艺HNONSCH3CH3HCOO-H-内酰胺环内酰胺环R青霉素类得基本结构青霉素类得基本结构:由母核由母核6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanic acid,6-APA)及侧链组及侧链组成成,侧链不同形成不同侧链不同形成不同青霉素青霉素,抗菌能力不同抗菌能力不同6-APA就是由一个噻唑就是由一个噻唑环环(A)连结连结-内酰胺环内酰胺环(B)组成组成BA青霉素得分类青霉素得分类n青霉素青霉素G类类:如青霉素如青霉素G钾、青霉素钾、青霉素G钠、长效西林等钠、长效西林等、n青霉素青霉素V 类类:(别名苯氧甲基青霉素、苯氧乙酰胺基青别名苯氧甲基青霉素、苯氧乙酰胺基青霉烷酸霉烷酸)如青霉素如青霉素V钾等钾等、n耐酶青霉素耐酶青霉素:如苯唑青霉素如苯唑青霉素(新青新青号号)、氯唑青霉素等、氯唑青霉素等、n广谱青霉素广谱青霉素:如氨苄西林、阿莫西林等如氨苄西林、阿莫西林等、n抗绿脓杆菌得广谱青霉素抗绿脓杆菌得广谱青霉素:如羧苄西林、哌拉西林钠、呋如羧苄西林、哌拉西林钠、呋苄青霉素等苄青霉素等、n氮咪青霉素氮咪青霉素:如美西林及其酯匹美西林等如美西林及其酯匹美西林等,其特点为较耐酶其特点为较耐酶,对某些阴性杆菌对某些阴性杆菌(如大肠杆菌、克雷伯菌与沙门菌如大肠杆菌、克雷伯菌与沙门菌)有效有效,但但对绿脓杆菌效果差对绿脓杆菌效果差、青霉素生产流程青霉素生产流程n冷冻干燥孢子冷冻干燥孢子琼脂斜面琼脂斜面米孢子米孢子种子种子罐罐(一、二级一、二级)发酵罐发酵罐预处理预处理过滤过滤乙乙酸丁酯萃取酸丁酯萃取蒸发蒸发(脱水脱色脱水脱色)结晶结晶工工业盐业盐综合利用综合利用27、3、1 菌种菌种:产黄青霉产黄青霉(Penicillium chrysogenum)产绿色、黄色孢子产绿色、黄色孢子)生长发育分生长发育分7个阶段个阶段:期期:分生孢子萌发分生孢子萌发;期期:菌丝繁殖菌丝繁殖;期期:脂肪粒形成脂肪粒形成;期期:脂肪粒减少脂肪粒减少,中、小空孢中、小空孢期期:形成大空孢形成大空孢,脂肪粒消失脂肪粒消失;期期:细胞内没有颗粒细胞内没有颗粒,菌丝体自溶。菌丝体自溶。期期:菌丝生长期菌丝生长期,期适宜做发酵种子期适宜做发酵种子;期期:青霉素分泌期青霉素分泌期;期到来之前结束发酵期到来之前结束发酵n种子制备阶段以生产丰富得孢子种子制备阶段以生产丰富得孢子(斜面与米孢子培斜面与米孢子培养养)或大量健壮得菌丝体或大量健壮得菌丝体(种子罐培养种子罐培养)为目得为目得n所以所以,要在培养基中加入丰富得、容易代谢得碳源要在培养基中加入丰富得、容易代谢得碳源(如葡萄糖或蔗糖如葡萄糖或蔗糖)、氮源、氮源(如玉米浆如玉米浆)、缓冲、缓冲pH得得碳酸钙以及生长所必需得无机盐碳酸钙以及生长所必需得无机盐,并保持最适生长并保持最适生长温度温度(2526)与充分通气、搅拌。与充分通气、搅拌。n种子制备得培养条件及原材料质量均应严格控制种子制备得培养条件及原材料质量均应严格控制以保持种子质量得稳定性。以保持种子质量得稳定性。27、3、2 培养基培养基:碳源碳源:乳糖、蔗糖、葡萄糖等乳糖、蔗糖、葡萄糖等;淀粉水解糖。淀粉水解糖。n通常采用葡萄糖与乳糖。发酵初期通常采用葡萄糖与乳糖。发酵初期,利用葡萄糖利用葡萄糖使菌丝快速生长使菌丝快速生长;当葡萄糖耗竭后当葡萄糖耗竭后,利用乳糖利用乳糖,分分泌青霉素。泌青霉素。氮源氮源:玉米浆、花生饼、棉籽饼、麸皮粉玉米浆、花生饼、棉籽饼、麸皮粉,氯氯 化铵、硫酸铵、硝酸铵。化铵、硫酸铵、硝酸铵。前体前体:苯乙酸或苯乙酰胺苯乙酸或苯乙酰胺;多次流加多次流加,每次每次 0、1 无机盐无机盐:S、P、Ga、Mg、K等。等。铁离子有害铁离子有害,控制在控制在 30g/ml。27、3、3 发酵工艺发酵工艺过程过程(1)生产孢子得制备生产孢子得制备n保藏得孢子保藏得孢子活化活化(2526,68d)获得获得单菌落单菌落(2526,7d)获得斜面孢子获得斜面孢子制得小米或大米孢子制得小米或大米孢子(优质小米或大米固体优质小米或大米固体培养基培养基25,7d)n每批孢子必须进行严格摇瓶试验每批孢子必须进行严格摇瓶试验,测定效价测定效价及杂菌情况及杂菌情况、(2)种子罐与发酵罐培养工艺种子罐与发酵罐培养工艺 青霉素生产采用三级发酵。青霉素生产采用三级发酵。n一级种子培养一级种子培养:接种小米孢子接种小米孢子萌发形成菌丝。培萌发形成菌丝。培养基成分为葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米浆、碳酸养基成分为葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、消沫剂等。通无菌空气钙、玉米油、消沫剂等。通无菌空气,空气流量空气流量1:3(V/V),300350r/min;培养时间培养时间4050h;pH 自然自然,温度温度,271。n二级种子培养二级种子培养:菌丝体大量繁殖。培养基成分为玉菌丝体大量繁殖。培养基成分为玉米浆、葡萄糖等。通无菌空气米浆、葡萄糖等。通无菌空气,空气流量空气流量1:(11、5)(V/V),250280r/min、pH 自然自然,251,培养培养时间时间1014h。n三级发酵培养三级发酵培养:培养基为花生饼粉培养基为花生饼粉(高温高温)、麸皮、麸皮、玉米浆、葡萄糖、尿素、硫酸铵、硫酸钠、硫代玉米浆、葡萄糖、尿素、硫酸铵、硫酸钠、硫代硫酸钠、磷酸二氢钠、苯乙酰胺、碳酸钙及消泡硫酸钠、磷酸二氢钠、苯乙酰胺、碳酸钙及消泡剂等。接种量为剂等。接种量为12%15%。n青霉素得发酵对溶氧要求极高青霉素得发酵对溶氧要求极高,通气量偏大通气量偏大,通气通气比控制比控制1:(0、71、8)(V/V),150200r/min;100m3得发酵罐搅拌功率为得发酵罐搅拌功率为200300kW,罐压控制罐压控制0、040、05MPa,2526下培养。下培养。n前前60h,pH5、76、3,温度温度26,以后以后pH6、36、6;温度温度24,发酵周期为发酵周期为200h左右。左右。n27、3、4 发酵条件控制发酵条件控制n补糖补糖:残糖降至残糖降至0、6、pH上升时开始加糖上升时开始加糖;n补氮补氮:发酵液氨态氮发酵液氨态氮0、010、05,补硫铵、补硫铵、氨水或尿素氨水或尿素n补前体补前体:发酵液中残存乙酰胺发酵液中残存乙酰胺0、050、08%;npH控制控制:前期前期pH 5、76、3,中后期中后期6、36、6,通过进行调节通过进行调节通过加糖、加酸、加碱通过加糖、加酸、加碱补加补加氨水氨水调节调节;n温度控制温度控制:前期前期,2526;后期后期,23;n通风比通风比:1:0、8vvm(单位培养液体积在单位单位培养液体积在单位时间内通入得空气量时间内通入得空气量)n溶氧溶氧:发酵液中得溶氧发酵液中得溶氧氧饱与溶解度得氧饱与溶解度得30;n消沫剂消沫剂:添加玉米油、豆油或化学消沫剂添加玉米油、豆油或化学消沫剂”泡敌泡敌”,少量多次。少量多次。27、3、5 青霉素得分离纯化青霉素得分离纯化(1)预处理预处理:浓缩目得产物浓缩目得产物,去除大部分杂质去除大部分杂质,改变发酵液得流变学特征改变发酵液得流变学特征,利于后续得分离利于后续得分离纯化过程。纯化过程。(2)过滤过滤:加入絮凝剂加入絮凝剂转鼓式真空转鼓式真空:吸滤、吸滤、洗涤、吸洗液、刮除滤饼。除掉菌丝体及洗涤、吸洗液、刮除滤饼。除掉菌丝体及部分蛋白质。部分蛋白质。(3)萃取萃取:溶媒萃取法溶媒萃取法,二级逆流工艺或二级顺二级逆流工艺或二级顺流工艺流工艺;青霉素游离酸易溶于有机溶剂青霉素游离酸易溶于有机溶剂,而青霉素盐而青霉素盐易溶于水。工业上通常用乙酸丁酯与戊酯易溶于水。工业上通常用乙酸丁酯与戊酯,萃取萃取23次次,浓缩浓缩10倍倍,浓度几乎达到结晶要浓度几乎达到结晶要求。求。(4)脱色脱色:加活性碳加活性碳150-200g/10亿单位亿单位;(5)精制精制:乙酸丁酯萃取液用乙酸丁酯萃取液用0、5mol/L氢氧化钠萃氢氧化钠萃取取调调pH6、46、8 得青霉素钠盐浓缩液得青霉素钠盐浓缩液(5万万单位单位/ml)加加34倍体积得丁醇倍体积得丁醇,1626,5110mmHg下真空蒸馏下真空蒸馏,将水、丁醇共沸物蒸发将水、丁醇共沸物蒸发出去出去浓缩到青霉素钠盐浓缩液得体积、蒸出馏浓缩到青霉素钠盐浓缩液得体积、蒸出馏分中含水量为分中含水量为24%时时,停止蒸馏停止蒸馏青霉素钠盐结青霉素钠盐结晶析出晶析出过滤过滤洗涤得到成品洗涤得到成品(6)溶媒回收溶媒回收:各种有机溶剂回收各种有机溶剂回收,以降低成本、减少以降低成本、减少环境污染环境污染第第28章章 氨基酸生产工艺氨基酸生产工艺28、1 概述概述n氨基酸就是蛋白质得基本结构单位氨基酸就是蛋白质得基本结构单位,在自然界已发在自然界已发现组成各种蛋白质得氨基酸有二十多种现组成各种蛋白质得氨基酸有二十多种,其中苏氨其中苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及色氨酸八种氨基酸就是人类本身酸、苯丙氨酸及色氨酸八种氨基酸就是人类本身不能合成得必需氨基酸不能合成得必需氨基酸,只能从食物中摄取。只能从食物中摄取。n氨基酸在食品、医药、饲料、化工、农业、化妆氨基酸在食品、医药、饲料、化工、农业、化妆品等领域广泛应用。品等领域广泛应用。n氨基酸得生产方法主要有抽提法、化学合成法、氨基酸得生产方法主要有抽提法、化学合成法、微生物发酵法与酶法四种。微生物发酵法与酶法四种。n到目前为止到目前为止,60以上得氨基酸采用微生物发酵法以上得氨基酸采用微生物发酵法进行生产进行生产,其中产量最大得就是谷氨酸其中产量最大得就是谷氨酸,其次就是其次就是赖氨酸。赖氨酸。氨基酸得生产方法氨基酸得生产方法n抽提法抽提法:将蛋白质原料进行水解将蛋白质原料进行水解,然后从水解液中然后从水解液中抽提氨基酸抽提氨基酸,就是生产氨基酸最早采用得方法。水就是生产氨基酸最早采用得方法。水解方法有酸法水解、碱法水解与酶法水解。目前解方法有酸法水解、碱法水解与酶法水解。目前胱氨酸、半胱氨酸与酪氨酸仍用抽提法生产。胱氨酸、半胱氨酸与酪氨酸仍用抽提法生产。n化学合成法化学合成法:用化学合成得方法制造氨基酸。目前用化学合成得方法制造氨基酸。目前用化学合成法制造得氨基酸有用化学合成法制造得氨基酸有DL-蛋氨酸、蛋氨酸、DL-丙丙氨酸、甘氨酸与苯丙氨酸。氨酸、甘氨酸与苯丙氨酸。n微生物发酵法微生物发酵法:就是目前氨基酸生产最常用得方法。就是目前氨基酸生产最常用得方法。根据微生物本身具有合成氨基酸得能力得特点根据微生物本身具有合成氨基酸得能力得特点,通通过菌株得筛选、诱变处理及代谢调节来达到合成过菌株得筛选、诱变处理及代谢调节来达到合成某种氨基酸得目得。某种氨基酸得目得。发酵法分为直接发酵法与添加前体发酵法。发酵法分为直接发酵法与添加前体发酵法。n酶法酶法:利用微生物细胞或微生物产生得酶进行生物利用微生物细胞或微生物产生得酶进行生物催化反应制造氨基酸得方法。赖氨酸、色氨酸、催化反应制造氨基酸得方法。赖氨酸、色氨酸、天门冬氨酸、酪氨酸、丙氨酸等均可用酶法生产。天门冬氨酸、酪氨酸、丙氨酸等均可用酶法生产。采用固定化酶或细胞连续生产采用固定化酶或细胞连续生产,其优点更突出。其优点更突出。28、2 氨基酸发酵工艺控制氨基酸发酵工艺控制28、2、1 菌种菌种:n氨基酸发酵得菌种主要有谷氨酸棒状杆菌、黄色氨基酸发酵得菌种主要有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、短芽孢杆菌、黏质赛短杆菌、乳糖发酵短杆菌、短芽孢杆菌、黏质赛氏杆菌等。下页为一些氨基酸生产菌种及用途。氏杆菌等。下页为一些氨基酸生产菌种及用途。28、2、2 培养基培养基n培养基一般都包括碳源、氮源、无机盐、生长因培养基一般都包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、水等成分。发酵培养基得成分与配比就是决子、水等成分。发酵培养基得成分与配比就是决定氨基酸产生菌生长、代谢得主要因素定氨基酸产生菌生长、代谢得主要因素,与氨基酸与氨基酸得产率、转化率及收率得关系密切。得产率、转化率及收率得关系密切。一一些些氨氨基基酸酸得得生生产产菌菌种种及及用用途途氨基酸氨基酸生产菌种生产菌种用途用途谷氨酸谷氨酸棒杆菌Asl、299、棒杆菌7338、钝齿棒杆菌Asl、542、棒杆菌Dll0、棒杆菌S-914、黄色短杆菌T6-13、黄色短杆菌FM84-415等主要用作制造味精,也用于预防或治疗肝昏迷,对于脑震荡与脑神经损伤也有一定得疗效L-赖氨酸氨酸谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、短芽孢杆菌、黏质赛氏杆菌它就是人类与动物发育必需得氨基酸,饲料添加剂,食品保鲜剂,制备复方氨基酸输液等药物L-谷氨谷氨酰胺胺谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、嗜氨小杆菌等治疗胃溃疡与十二指肠溃疡等L-脯氨酸脯氨酸谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、粘质赛氏杆菌配制氨基酸输液,合成抗高血压药物与治疗帕金森氏症得多肽类药物,食品工业得甜味剂L-精氨酸精氨酸粘质沙雷氏杆菌、钝齿棒杆菌等合成蛋白质与肌酸得重要原料L-天天门冬氨酸冬氨酸黄色短杆菌、大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等生产甜味肽得主要原料L-苏氨酸氨酸大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、黏质赛氏杆菌等得基因工程菌饲料添加剂,氨基酸营养液原料L-蛋氨酸蛋氨酸主要为酶法,发酵法尚在研究中有抗脂肪肝与解毒作用,药物或食品强化剂,饲料添加剂L-色氨酸色氨酸枯草杆菌、黄杆菌、枯草杆菌、基因工程菌等食品强化剂,饲料添加剂L-苯丙氨酸苯丙氨酸大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌等得变异株生产甜味肽L-酪氨酸酪氨酸产气克雷氏菌得重组株、草剩欧文氏菌合成L-多巴等L-丝氨酸氨酸嗜甘氨酸棒状杆菌、基因工程菌食品、药品、化妆品得添加剂L-半胱氨酸半胱氨酸球形芽孢杆菌食品、药品、化妆品得添加剂L-缬氨酸氨酸乙酸钙不动杆菌等 药物,食品强化剂L-亮氨酸亮氨酸谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌 配制复合氨基酸输液L-组氨酸氨酸基因工程菌生化试剂、药物(1)碳源碳源 n氨基酸发酵中可采用淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、氨基酸发酵中可采用淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃等多种碳源。根据微生物菌种得性质、乙醇、烷烃等多种碳源。根据微生物菌种得性质、氨基酸种类与发酵工艺方法氨基酸种类与发酵工艺方法,选择碳源种类与浓度。选择碳源种类与浓度。最常采用得就是淀粉水解糖液或糖蜜。最常采用得就是淀粉水解糖液或糖蜜。(2)氮源氮源 n氨基酸发酵培养基常选用铵盐、尿素、氨水等为氨基酸发酵培养基常选用铵盐、尿素、氨水等为无机氮源。几乎所有得氨基酸产生菌都就是生物无机氮源。几乎所有得氨基酸产生菌都就是生物素缺陷型素缺陷型,同时也就是一些氨基酸得营养缺陷型同时也就是一些氨基酸得营养缺陷型,而且大多数氨基酸产生菌都不能分泌胞外水解蛋而且大多数氨基酸产生菌都不能分泌胞外水解蛋白酶。因此需要添加适量得有机氮源如玉米桨及白酶。因此需要添加适量得有机氮源如玉米桨及精制棉籽饼、麸皮、豆饼等蛋白质原料得水解液。精制棉籽饼、麸皮、豆饼等蛋白质原料得水解液。(3)碳氮比碳氮比 n氨基酸发酵时氨基酸发酵时,不仅菌体生长与氨基酸合成需要氮不仅菌体生长与氨基酸合成需要氮源源,而且氮源还用来调节发酵液得而且氮源还用来调节发酵液得pH值。值。n例如谷氨酸发酵得碳氮比为例如谷氨酸发酵得碳氮比为100:(1521),当碳氮当碳氮比为比为100:11时才开始积累谷氨酸时才开始积累谷氨酸,因此发酵培养基因此发酵培养基氮源得需要量比一般发酵多。氮源得需要量比一般发酵多。n谷氨酸发酵消耗得氮源中谷氨酸发酵消耗得氮源中,合成菌体用得氮源占总合成菌体用得氮源占总氮得氮得36,合成谷氨酸得氮源占合成谷氨酸得氮源占3080。n实际生产中实际生产中,以尿素或氨水为氮源时以尿素或氨水为氮源时,除了一部分除了一部分用于调节发酵液得用于调节发酵液得pH值外值外,还有一部分随空气逸还有一部分随空气逸出出,为此氮源得用量更大。为此氮源得用量更大。n谷氨酸发酵培养基中当糖浓度为谷氨酸发酵培养基中当糖浓度为12、5、总尿素、总尿素量为量为3时时,碳氮比为碳氮比为100:28。n氮源得用量对氨基酸生物合成产生显著得影响氮源得用量对氨基酸生物合成产生显著得影响,如如谷氨酸发酵中谷氨酸发酵中,适量得适量得NH 4+可减少可减少-酮戊二酸得酮戊二酸得积累积累,促进谷氨酸得合成促进谷氨酸得合成;过量得过量得NH 4+会使生成得会使生成得谷氨酸转化为谷氨酰胺。谷氨酸转化为谷氨酰胺。(4)无机盐无机盐 n发酵培养基中通常需要加入硫、磷、钙、镁、钾发酵培养基中通常需要加入硫、磷、钙、镁、钾等无机盐类。等无机盐类。n磷酸盐浓度对于氨基酸发酵得影响极为显著。磷酸盐浓度对于氨基酸发酵得影响极为显著。n而镁、钾等离子就是许多酶得激活剂而镁、钾等离子就是许多酶得激活剂,对菌体得生对菌体得生长与氨基酸得积累有重要得作用。长与氨基酸得积累有重要得作用。(5)生长因子生长因子 n生物素就是氨基酸发酵生产中重要得生长因子。影生物素就是氨基酸发酵生产中重要得生长因子。影响细胞膜得通透性与代谢途径响细胞膜得通透性与代谢途径,它得浓度与微生物它得浓度与微生物菌体得生长与氨基酸得合成关系密切。菌体得生长与氨基酸得合成关系密切。n以淀粉水解糖为原料进行谷氨酸发酵时以淀粉水解糖为原料进行谷氨酸发酵时,必须控制必须控制生物素得浓度为亚适量生物素得浓度为亚适量,以以25g/L为宜为宜(实际上就实际上就是控制玉米浆得浓度是控制玉米浆得浓度),保证菌体细胞膜得通透性良保证菌体细胞膜得通透性良好好,谷氨酸才能大量分泌。谷氨酸才能大量分泌。n在天门冬氨酸族氨基酸在天门冬氨酸族氨基酸(如赖氨酸、苏氨酸、蛋氨如赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等酸等)得发酵中期望菌体细胞膜完整得发酵中期望菌体细胞膜完整,要求控制生要求控制生物素过量物素过量,如赖氨酸发酵中添加过量得生物素如赖氨酸发酵中添加过量得生物素(200500g/L),赖氨酸合成显著增加。赖氨酸合成显著增加。n氨基酸发酵一般以玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖氨基酸发酵一般以玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜作为生物素得来源。蜜或甜菜糖蜜作为生物素得来源。28、2、3 发酵条件发酵条件控制控制(1)pH值对氨基酸发酵得影响及控制值对氨基酸发酵得影响及控制n pH值影响酶得活性与菌得代谢值影响酶得活性与菌得代谢;n谷氨酸发酵中谷氨酸发酵中,在中性与微碱性条件下在中性与微碱性条件下(pH7、08、0)积累谷氨酸积累谷氨酸,n在酸性条件下在酸性条件下(pH5、05、8),则易形成谷氨酰胺则易形成谷氨酰胺与与N-乙酰谷氨酰胺。乙酰谷氨酰胺。n发酵前期发酵前期pH值偏高对菌体生长不利值偏高对菌体生长不利,糖耗慢、发糖耗慢、发酵周期延长酵周期延长;反之反之,pH值偏低则菌体生长旺盛值偏低则菌体生长旺盛,糖耗糖耗快快,不利于谷氨酸合成。不利于谷氨酸合成。n但发酵前期但发酵前期pH值偏高值偏高(pH7、58、0)对抑制杂菌对抑制杂菌有利有利,故控制发酵前期得故控制发酵前期得pH值以值以7、5左右为宜。左右为宜。n由于谷氨酸脱氢酶得最适由于谷氨酸脱氢酶得最适pH值为值为7、07、2,氨基氨基转移酶得最适转移酶得最适pH值为值为7、27、4,因此控制发酵中因此控制发酵中后期得后期得pH值为值为7、2左右。左右。n生产上控制生产上控制pH值得方法一般有两种值得方法一般有两种,流加尿素与流加尿素与流加氨水流加氨水(少量多次少量多次,可使可使pH值较稳定值较稳定)。n流加尿素得数量与时间主要根据流加尿素得数量与时间主要根据pH值变化、菌体值变化、菌体生长、糖耗情况与发酵时期等因素来决定。生长、糖耗情况与发酵时期等因素来决定。n如当菌体生长与糖耗均缓慢时如当菌体生长与糖耗均缓慢时,要少量多次地流加要少量多次地流加尿素、避免尿素、避免pH值过高而影响菌体生长值过高而影响菌体生长;n菌体生长与糖耗均较快时菌体生长与糖耗均较快时,流加尿素可多些流加尿素可多些,使使pH值适当高些值适当高些,以抑制生长以抑制生长;n发酵后期残糖很少发酵后期残糖很少,接近放罐时应尽量少加或不加接近放罐时应尽量少加或不加尿素尿素,以免造成浪费与增加氨基酸提取难度。以免造成浪费与增加氨基酸提取难度。n不同得氨基酸发酵对不同得氨基酸发酵对pH得要求见下页表得要求见下页表不同氨基酸发酵得最适不同氨基酸发酵得最适pH与溶解氧分压与溶解氧分压氨基酸氨基酸最适最适pH溶解氧分压溶解氧分压(105Pa)谷氨谷氨酰胺胺6、50 0、01脯氨酸脯氨酸7、00 0、01精氨酸精氨酸7、00 0、01谷氨酸谷氨酸7、80 0、01赖氨酸氨酸7、00 0、01苏氨酸氨酸7、00 0、01异亮氨酸异亮氨酸7、00 0、01亮氨酸亮氨酸6、25 0缬氨酸氨酸6、50 0苯丙氨酸苯丙氨酸7、25 0(2)温度对氨基酸发酵得影响及控制温度对氨基酸发酵得影响及控制n 氨基酸发酵得最适温度因菌种与所生产得氨基酸发酵得最适温度因菌种与所生产得氨基酸种类不同而异。氨基酸种类不同而异。n氨基酸发酵一般属于氨基酸发酵一般属于Gaden分类得分类得型即型即生长部分偶联型发酵生长部分偶联型发酵,菌体生长到一定程度菌体生长到一定程度后再开始产生氨基酸。后再开始产生氨基酸。n菌体生长最适温度与氨基酸合成得最适温菌体生长最适温度与氨基酸合成得最适温度就是不同得。度就是不同得。n如谷氨酸发酵如谷氨酸发酵,菌体生长最适温度为菌体生长最适温度为3032,谷氨谷氨酸合成得最适温度为酸合成得最适温度为3437。n如果菌体生长阶段温度过高如果菌体生长阶段温度过高,则菌体易衰老则菌体易衰老;在发在发酵中后期酵中后期,菌体生长已基本停止菌体生长已基本停止,需要维持最适得需要维持最适得产酸温度产酸温度,以利谷氨酸得合成。以利谷氨酸得合成。(3)溶氧对氨基酸发酵得影响及控制溶氧对氨基酸发酵得影响及控制n不同得氨基酸发酵对溶氧得要求不同不同得氨基酸发酵对溶氧得要求不同n多数氨基酸发酵就是在供氧充足得条件下进行得多数氨基酸发酵就是在供氧充足得条件下进行得,如谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸与精氨酸等如谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸与精氨酸等;n也有一些氨基酸得发酵过程需要限制供氧也有一些氨基酸得发酵过程需要限制供氧,如亮氨如亮氨酸、苯丙氨酸与缬氨酸等发酵适宜在缺氧条件下酸、苯丙氨酸与缬氨酸等发酵适宜在缺氧条件下进行进行,只有当菌体呼吸在一定程度上受阻时才最适只有当菌体呼吸在一定程度上受阻时才最适合这些氨基酸得生产合这些氨基酸得生产;n而赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等得发酵需氧量介而赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸等得发酵需氧量介于上述两者之间。于上述两者之间。n发酵得不同阶段氧分压得要求也就是不同得发酵得不同阶段氧分压得要求也就是不同得,因此因此在发酵过程中应根据具体情况对供氧进行控制。在发酵过程中应根据具体情况对供氧进行控制。(4)泡沫得控制泡沫得控制n发酵过程中通常产生大量得泡沫发酵过程中通常产生大量得泡沫,可采用豆油、玉可采用豆油、玉米油等天然油脂或环氧丙烯、环氧乙烯、聚醚类米油等天然油脂或环氧丙烯、环氧乙烯、聚醚类等化学消泡剂进行消泡。并控制消泡剂得用量与等化学消泡剂进行消泡。并控制消泡剂得用量与加入得时间与方法加入得时间与方法,否则影响菌体得代谢与产物得否则影响菌体得代谢与产物得提取。提取。28、3 氨基酸分离纯氨基酸分离纯化化n氨基酸得分离与纯化又称为氨基酸发酵液得后处氨基酸得分离与纯化又称为氨基酸发酵液得后处理或下游工程理或下游工程(downstream processing),就是氨就是氨基酸工业生产中得一个重要组成部分。基酸工业生产中得一个重要组成部分。n发酵法生产氨基酸得发酵液就是极其复杂得多相发酵法生产氨基酸得发酵液就是极其复杂得多相体系体系,含有微生物菌体细胞、代谢产物、未消耗尽含有微生物菌体细胞、代谢产物、未消耗尽得培养基等得培养基等,因此要提取高纯度得氨基酸。因此要提取高纯度得氨基酸。n氨基酸得分离纯化氨基酸得分离纯化:对氨基酸发酵液进行预处理对氨基酸发酵液进行预处理菌体分离菌体分离初步纯化初步纯化高度纯化等步骤。高度纯化等步骤。n前三步骤称为分离前三步骤称为分离(或提取或提取):处理得体积较大处理得体积较大,着着重于分离与浓缩重于分离与浓缩;n高度纯化称为纯化高度纯化称为纯化(或精制或精制):精细得分离操作精细得分离操作,着着重于纯化。重于纯化。菌体分离菌体分离(离心分离、离心分离、过滤、压滤、超、超滤等等)预处理（加理（加热、调pH、絮凝等）、絮凝等）发酵液酵液初步初步纯化（沉淀、吸附、离子交化（沉淀、吸附、离子交换、萃取等）、萃取等）高度高度纯化化(超超滤、吸附、吸附、结晶、重晶、重结晶等晶等)成品加工成品加工氨基酸得分离纯化工艺流程氨基酸得分离纯化工艺流程28、4 赖氨酸生产工赖氨酸生产工艺艺n赖氨酸就是人体必需得赖氨酸就是人体必需得8种氨基酸之一种氨基酸之一,人人与高等动物体内不能合成。与高等动物体内不能合成。n自自1960年日本用谷氨酸棒状杆菌得高丝氨年日本用谷氨酸棒状杆菌得高丝氨酸营养缺陷型突变株发酵生产赖氨酸获得酸营养缺陷型突变株发酵生产赖氨酸获得成功后成功后,微生物发酵法成为生产赖氨酸得主微生物发酵法成为生产赖氨酸得主要方法。要方法。n赖氨酸有赖氨酸有L型与型与D型种构型。型种构型。n微生物发酵法生产得均为微生物发酵法生产得均为L型。型。28、4、1 赖氨酸得生产菌种与生物合成赖氨酸得生产菌种与生物合成途径途径n(1)细菌细菌:如短杆菌属如短杆菌属(黄色短杆菌、乳糖发酵短杆黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌菌)与棒状杆菌属与棒状杆菌属(谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌)。它们多以谷。它们多以谷氨酸生产菌为出发菌株氨酸生产菌为出发菌株,通过人工诱变获得各种突通过人工诱变获得各种突变株变株(高丝氨酸营养缺陷型兼高丝氨酸营养缺陷型兼AEC抗性突变株抗性突变株)。n(2)酵母菌酵母菌:如产朊假丝酵母、酿酒酵母。如产朊假丝酵母、酿酒酵母。n酵母菌赖氨酸得生物合成产率要低于细菌得酵母菌赖氨酸得生物合成产率要低于细菌得,目前目前赖氨酸得发酵生产都就是以细菌为生产菌种。赖氨酸得发酵生产都就是以细菌为生产菌种。赖氨酸合成途径赖氨酸合成途径n(1)二氨基庚二酸途径二氨基庚二酸途径:存在于细菌、绿藻、存在于细菌、绿藻、原生动物与高等植物中原生动物与高等植物中;P329图图28-2n(2)-氨基己二酸途径氨基己二酸途径:存在于酵母、霉菌存在于酵母、霉菌中。中。P329图图28-328、4、2 赖氨酸得发酵条件控制赖氨酸得发酵条件控制n赖氨酸生产菌多以谷氨酸生产菌为出发菌株赖氨酸生产菌多以谷氨酸生产菌为出发菌株,通过通过选育高丝氨酸营养缺陷型、抗赖氨酸结构类似物选育高丝氨酸营养缺陷型、抗赖氨酸结构类似物(AECr)、抗苏氨酸结构类似物、抗苏氨酸结构类似物(AHVr)得突变株得突变株,以以解除自身得代谢调节来实现得。解除自身得代谢调节来实现得。n赖氨酸发酵就是典型得代谢控制发酵。赖氨酸发酵就是典型得代谢控制发酵。n控制培养物中得生物素、控制培养物中得生物素、L-氨酸与氨酸与L-甲硫氨酸得甲硫氨酸得含量、温度、含量、温度、pH、溶解氧、溶解氧(通风量、搅拌速度通风量、搅拌速度)等等条件条件,赖氨酸大量积累。赖氨酸大量积累。n赖氨酸发酵时间以赖氨酸发酵时间以1620h为界为界,分为前、后分为前、后两个时期。两个时期。n前期前期(生长期生长期):菌体增殖迅速菌体增殖迅速,有少量赖氨有少量赖氨酸生成酸生成,糖与氮得消耗主要就是用于合成细糖与氮得消耗主要就是用于合成细胞物质及供给菌体得能量代谢胞物质及供给菌体得能量代谢;n后期后期(赖氨酸合成期赖氨酸合成期),菌体生长速度明显减菌体生长速度明显减慢慢,L-赖氨酸大量积累赖氨酸大量积累,糖与氮消耗主要用糖与氮消耗主要用于于L-赖氨酸得合成。赖氨酸得合成。n两个阶段在工艺控制上就是不同得。两个阶段在工艺控制上就是不同得。(1)温度对赖氨酸发酵得影响及控制温度对赖氨酸发酵得影响及控制n在低于在低于20时时,氨基酸合成途径得终产物对第一步氨基酸合成途径得终产物对第一步反应得酶得反馈抑制作用比在正常生长温度下更反应得酶得反馈抑制作用比在正常生长温度下更大。大。n发酵前期发酵前期,温度控制在温度控制在3032,如果温度过高如果温度过高,菌菌体容易衰老体容易衰老,发酵液