实验三、血清、红细胞制备.ppt

实验三、实验动物的采血方法、实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法动物血清及红细胞的制备方法指导老师：程燕指导老师：程燕2021/10/101实验目的1、学学习习实实验验动动物物不不同同部部位位的的取取无无菌菌采采血方法；血方法；2、学习动物血清、红细胞的制备；、学习动物血清、红细胞的制备；3、观察兔、豚鼠的免疫器官、观察兔、豚鼠的免疫器官。2021/10/102实验原理免疫系统由免疫器官、免疫组织、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统由免疫器官、免疫组织、免疫细胞和免疫分子组成。免疫细胞免疫细胞 1.1.固有免疫的组成细胞：吞噬细胞、淋巴器官、树突状细胞、固有免疫的组成细胞：吞噬细胞、淋巴器官、树突状细胞、NKNK细胞、细胞、NKTNKT细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；2.2.适应性免疫应答细胞：适应性免疫应答细胞：T T细胞、细胞、B B细胞细胞免疫分子免疫分子 1.1.膜型分子：膜型分子：TCRTCR、BCRBCR、CDCD分子、粘附分子、分子、粘附分子、MHCMHC分子、细胞分子、细胞因子受体。因子受体。2.2.分泌型分子：免疫球蛋白、补体、细胞因子。分泌型分子：免疫球蛋白、补体、细胞因子。2021/10/103实验原理 血液是一种结缔组织（细胞间质）。血液系统是各种重要的血液是一种结缔组织（细胞间质）。血液系统是各种重要的免疫细胞、免疫分子的载体，也是各种免疫事件发生的场所。免疫细胞、免疫分子的载体，也是各种免疫事件发生的场所。组成：组成：1 1、血浆、血浆 血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原）血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原）脂蛋白、无机盐、氧等成分脂蛋白、无机盐、氧等成分 激素、酶、抗体激素、酶、抗体 细胞代谢产物等。细胞代谢产物等。2 2、血细胞、血细胞 红血球、红血球、白血球（有粒白细胞：中性粒白血球（有粒白细胞：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞和无粒白细胞：单核细胞和细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞和无粒白细胞：单核细胞和淋巴细胞淋巴细胞)血小板血小板2021/10/104实验原理实验研究中，要采集实验动物的血液进行检查或实验研究中，要采集实验动物的血液进行检查或分析，故必须掌握血液的正确采集、分离和保存分析，故必须掌握血液的正确采集、分离和保存的操作技术。的操作技术。采血方法的选择，主要决定于实验的目的所需血采血方法的选择，主要决定于实验的目的所需血量以及动物种类。量以及动物种类。用血量较少可刺破组织取毛细血管的血用血量较少可刺破组织取毛细血管的血 当需血量较多时可作静脉采血当需血量较多时可作静脉采血（原则：静脉采血时，若需反复多次，应自远离心（原则：静脉采血时，若需反复多次，应自远离心脏端开始，以免发生栓塞而影响整条静脉脏端开始，以免发生栓塞而影响整条静脉)2021/10/105实验原理现将采用血方法按动物和部位分别加以介绍。现将采用血方法按动物和部位分别加以介绍。小鼠和大鼠采血方法：割尾采血法、尾静脉穿刺采血、小鼠和大鼠采血方法：割尾采血法、尾静脉穿刺采血、眼眶后静脉丛采血、摘眼球法、断头采血、颈（股）动眼眶后静脉丛采血、摘眼球法、断头采血、颈（股）动静脉采血静脉采血豚鼠采血法：耳缘剪口采血豚鼠采血法：耳缘剪口采血 、心脏采血、心脏采血 、股动脉采血、股动脉采血 、背中足静脉取血、背中足静脉取血 兔采血法：耳静脉采血兔采血法：耳静脉采血 、耳中央动脉采血、耳中央动脉采血 、心脏取血、心脏取血 、后肢胫部皮下静脉取血、后肢胫部皮下静脉取血 、股动静脉、颈动静脉取血、股动静脉、颈动静脉取血 、鸡采血法鸡采血法 ：翼根静脉采血、心脏采血、颈静脉采血：翼根静脉采血、心脏采血、颈静脉采血2021/10/106实验原理家兔采血方法家兔采血方法 （1 1）耳缘静脉采血：）耳缘静脉采血：家兔固定，将耳缘静脉皮肤上的毛拔去或剪去，家兔固定，将耳缘静脉皮肤上的毛拔去或剪去，75%75%酒精消毒，酒精消毒，用左手食指和中指夹住静脉近心端，以使其血管怒张拇指和小指用左手食指和中指夹住静脉近心端，以使其血管怒张拇指和小指夹住耳缘部分，以左手无名指和小指放在耳下作垫，待静脉充盈夹住耳缘部分，以左手无名指和小指放在耳下作垫，待静脉充盈后，右手持注射器使针头由静脉末端刺入，顺血管方向向心端刺后，右手持注射器使针头由静脉末端刺入，顺血管方向向心端刺约约1-1.5cm1-1.5cm，放松左手拇指和食指对血管的压迫，右手缓慢抽吸，放松左手拇指和食指对血管的压迫，右手缓慢抽吸注射器，若注射阻力较大，说明针头没有刺入静脉，应调整针头注射器，若注射阻力较大，说明针头没有刺入静脉，应调整针头或重新穿刺；也可以刀片在血管上切一小口，让血自然流出，滴或重新穿刺；也可以刀片在血管上切一小口，让血自然流出，滴入盛器内，采血完毕，用干棉球按压止血。入盛器内，采血完毕，用干棉球按压止血。2021/10/107（2 2）兔心脏穿刺取血：）兔心脏穿刺取血：家兔背位固定，在左胸第家兔背位固定，在左胸第2 24 4肋间剪毛一块，用肋间剪毛一块，用75%75%酒精和碘伏消毒。然后用酒精和碘伏消毒。然后用5 510ml10ml注射器，在胸骨左缘注射器，在胸骨左缘3-43-4肋间心尖搏动最明显处作垂直穿刺。肋间心尖搏动最明显处作垂直穿刺。注意事项有：注意事项有：动作宜迅速，以缩短在心脏内的留针时间和防止血液凝动作宜迅速，以缩短在心脏内的留针时间和防止血液凝固；固；如针头已进入心脏但抽不出血时，应将针头稍微后退一如针头已进入心脏但抽不出血时，应将针头稍微后退一点。点。在胸腔内针头不应左右摆动以防止伤及心，肺、在胸腔内针头不应左右摆动以防止伤及心，肺、2021/10/108实验原理豚鼠采血方法豚鼠采血方法 （1 1）背中足静脉取血）背中足静脉取血 固定动物，将动物脚背面用酒精消毒，找出背中固定动物，将动物脚背面用酒精消毒，找出背中足静脉后，以左手的拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右足静脉后，以左手的拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手拿的注射针刺入静脉。采血后，用纱布或脱脂棉压手拿的注射针刺入静脉。采血后，用纱布或脱脂棉压迫止血。反复采血时，两后肢交替使用。迫止血。反复采血时，两后肢交替使用。（2 2）心脏采血）心脏采血 通常在胸骨左缘的正中，选心跳最强的部位作穿刺。通常在胸骨左缘的正中，选心跳最强的部位作穿刺。针头宜稍细长些，以免发生手术后穿刺孔出血，其操针头宜稍细长些，以免发生手术后穿刺孔出血，其操作手法详见兔心脏采血。作手法详见兔心脏采血。2021/10/109实验动物的采血量动物种类最大安全采血量（ml）最大致死采血量（ml）小白鼠0.10.3大白鼠12豚鼠510家兔1040狗50300猴15602021/10/1010血清的制备血清的制备：不加抗凝剂血清的制备：不加抗凝剂无菌静脉采血无菌静脉采血2ml2ml，3737自然凝固，待血清开始出现后，自然凝固，待血清开始出现后，放冰箱内放冰箱内1212小时或小时或2424小时，离心分离血清（小时，离心分离血清（3000rpm3000rpm，5-10min5-10min），得到的上清液即为血清，小心将上清吸出），得到的上清液即为血清，小心将上清吸出（注意切勿吸出细胞成分）。（注意切勿吸出细胞成分）。血浆的制备：需加抗凝剂（抗凝剂：血液血浆的制备：需加抗凝剂（抗凝剂：血液 =1=1：9 9）无菌静脉采血无菌静脉采血2ml2ml（注射器用抗凝剂润洗），（注射器用抗凝剂润洗），将血液将血液加加入到有抗凝剂的离心管中颠倒混匀，离心（入到有抗凝剂的离心管中颠倒混匀，离心（3000rpm3000rpm，5-10min5-10min）后所得的上清液即为血浆。）后所得的上清液即为血浆。注意：血清的保存可以在每注意：血清的保存可以在每50ml50ml血清中加血清中加1 1硫柳汞水溶硫柳汞水溶液液1ml1ml防腐。防腐。2021/10/10112021/10/1012红细胞及悬液制备标准红细胞的制备：标准红细胞的制备：取全血取全血1ml1ml，加等渗盐水，加等渗盐水2 23ml3ml，充分摇匀离心沉淀，充分摇匀离心沉淀，弃去上清液，然后再加生理盐水弃去上清液，然后再加生理盐水2 23ml 3ml 按上述方法洗按上述方法洗涤，共三次，离心去上清，余下的为压积红细胞。涤，共三次，离心去上清，余下的为压积红细胞。红细胞悬液的制备：红细胞悬液的制备：2 2红细胞悬液：压积红细胞红细胞悬液：压积红细胞2 2滴滴+新鲜等渗盐水新鲜等渗盐水4ml 4ml 5 5红细胞悬液：压积红细胞红细胞悬液：压积红细胞5 5滴滴+新鲜等渗盐水新鲜等渗盐水4ml4ml 10 10红细胞悬液：压积红细胞红细胞悬液：压积红细胞5 5滴滴+新鲜等渗盐水新鲜等渗盐水2ml2ml注意：注意：标准红细胞盐水悬液临用前制备，最多存放标准红细胞盐水悬液临用前制备，最多存放3 3天，天，用用柠檬酸葡萄糖溶液（柠檬酸葡萄糖溶液（ACDACD）溶液保存最长可保存溶液保存最长可保存1 1周周2021/10/1013实验器材实验动物：豚鼠、兔实验动物：豚鼠、兔实验试剂：血液抗凝剂（实验试剂：血液抗凝剂（1:500u肝素钠注射液）肝素钠注射液）生理盐水生理盐水实验器材：实验器材：5ml注射器、注射器、一次性离心管（一次性离心管（5、10、15ml规格）、规格）、普通吸管、尖吸管、普通吸管、尖吸管、1ml刻度吸管刻度吸管 75%酒精棉球酒精棉球 水平离心机水平离心机2021/10/1014实验步骤1.1.用用7575酒精棉球消毒采血部位皮肤酒精棉球消毒采血部位皮肤2.2.用用5ml5ml注射器分别抽取豚鼠或兔静脉血注射器分别抽取豚鼠或兔静脉血2 2mlml豚鼠采血法豚鼠采血法 ：背中足静脉取血：背中足静脉取血 心脏采血、心脏采血、兔采血法：耳缘静脉采血兔采血法：耳缘静脉采血 心脏采血心脏采血 3.3.制备血清、红细胞（如上述流程）制备血清、红细胞（如上述流程）2021/10/1015注意事项：1 1、采血部位需要进行消毒、采血部位需要进行消毒2 2、采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥；、采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥；3 3、注意血清与血浆制备的区别：抗凝剂的使用、注意血清与血浆制备的区别：抗凝剂的使用4 4、不同规格离心管的使用、不同规格离心管的使用一次性离心管规格一次性离心管规格用途用途15ml15ml血浆、红细胞制备的离心血浆、红细胞制备的离心10ml放置不同用途的吸管放置不同用途的吸管5ml血清制备、红细胞悬液制备血清制备、红细胞悬液制备2021/10/1016实验作业1 1、血清、血浆的组分的区别？、血清、血浆的组分的区别？2 2、血清、血浆制备方法及操作的区别、血清、血浆制备方法及操作的区别？2021/10/1017