T∕HPCIA 005-2022 化妆品 美白功效的测定 斑马鱼胚法.pdf

ICS：71.100.70Y40团体标准团体标准T/HPCIA005-2022代替 T/HPCIA 005-2021化妆品 美白功效的测定 斑马鱼胚法Cosmetics-Determination of whitening-Zebrafish(Danio rerio) embryoassay2022 年 05 月 05 日发布2022 年 05 月 05 日实施广州开发区黄埔化妆品产业协会广州开发区黄埔化妆品产业协会发布全国团体标准信息平台目录化妆品 美白功效的测定 斑马鱼胚法. 51. 范围.52. 术语和定义.53. 规范性引用文件.5(一) 黑色素生成灰度检测法.54. 方法原理.55. 生物模型.55.1成鱼.55.2鱼胚.66. 材料与试剂.66.1. 材料.66.2. 试剂.67. 仪器与设备.68. 实验过程.78.1. 胚胎准备.78.2. 样品前处理.78.3. 实验方法.79. 质量控制.710. 结果判定.711. 废弃物处置.8(二) 黑色素生成抑制检测法.812. 方法原理.813. 生物模型.813.1成鱼.813.2鱼胚.814. 材料与试剂.814.1. 材料.814.2. 试剂.815. 仪器与设备.916. 实验过程.916.1. 胚胎准备.916.2. 样品前处理.916.3. 实验方法.917. 质量控制.1018. 结果判定.1019. 废弃物处置.10(三) 酪氨酸酶活性抑制检测法.1020. 方法原理.1121. 生物模型.1121.1成鱼.1122.2鱼胚.1122. 材料与试剂.1122.1. 材料.1122.2. 试剂.1123. 仪器与设备.1224. 实验过程.1224.1. 胚胎准备.1224.2. 样品前处理.12全国团体标准信息平台24.3. 实验方法.1225. 质量控制.1326. 结果判定.1327. 废弃物处置.13附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图.15附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图.16附录 C（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法.17附录 D（资料性附录）数据记录表.18附录 E（资料性附录）斑马鱼养鱼及维护.错误！未定义书签。全国团体标准信息平台前言本标准是GB/T 1.1-2020给出规则起草。本标准代替T/HPCIA 005-2021 化妆品 美白功效的测定 斑马鱼胚法本标准与T/HPCIA 005-2021 相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：规范性文件增加了 T/SHRH 0212019 化妆品美白功效功效测试 体外重组 3D 黑色素模型 测试方法规范性文件增加了 T/ZHCA 0012018 化妆品美白功效祛斑功效测试方法删减了第一法 定性方法修改了黑色素生成灰度检测法方法原理的观察要求删减了黑色素生成灰度检测法的孔板选用修改了胚胎缓冲水的材料以及配制方法修改了阳性对照组的溶液浓度以及配制方法修改了胚胎准备中的培养皿胚胎密度修改了黑色素生成灰度检测法的实验方法修改了质量控制修改了附录 C 化妆品及原料前处理方法删减了附录 D 数据记录表增加了附录 E 斑马鱼俯视拍照示意图本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会提出。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会归口。本标准起草单位：广东科玮生物技术股份有限公司、广州环亚化妆品科技有限公司、广东袋鼠妈妈生物科技有限公司、广州市科能化妆品科研有限公司、广东创美抗衰老研究有限公司、广州天玺生物科技有限公司、广州红之化妆品有限公司、广州市暨优生物科技有限公司、广州奥蓓斯化妆品有限公司、广东省保化检测中心有限公司、广州保化斑马鱼检测技术有限公司、广东药科大学、广州鲁比生物科技有限公司、广东省人民医院。本标准主要起草人：宁雪萍、陈亮、刘芳、孙永、林盛杰、张利春、史学东、王杰、何斌、王芬、郑伟东、梅文杰、黄晓婷、刘宁芝、袁婵龄、邹俊、赵海山、王雅馨、何铭杰、何露露。本标准所代替标准的历次发布情况为：T/HPCIA 005-2021全国团体标准信息平台化妆品 美白功效的测定 斑马鱼胚法1.范围本标准规定了评价化妆品美白功效的斑马鱼胚实验的方法原理及操作。本标准适用于化妆品（膏霜、乳液、凝胶、精华等）及化妆品原料的美白功效评价。2.术语和定义2.1. hpf受精后小时数的英文缩写，即“hours post-fertilization”。2.2. 灰度 Gray level指黑白图像中点的颜色深度，范围一般从 0 到 255，白色为 255，黑色为 0。2.3. 吸光度 Optical density, OD入射光强度与透射光强度比值的常用对数值。 表示被检测物吸收的光学密度。 特定波长下,同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。2.4. 黑色素生成抑制率（%） Inhibition rate of melanin production经样品刺激后，斑马鱼胚胎中因样品对黑色素的抑制而导致的黑色素前后变化的比率。2.5. 酪氨酸酶活性抑制率（%） Inhibition rate of tyrosinase activity经样品刺激后，斑马鱼胚胎中因样品对酪氨酸酶活性的抑制而导致的酪氨酸酶活性前后变化的比率。3.规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。化妆品安全技术规范（2015 版）QB/T 1684-2015 化妆品检验规则T/SHRH 0212019 化妆品美白功效功效测试 体外重组 3D 黑色素模型 测试方法T/ZHCA0012018 化妆品美白功效祛斑功效测试方法DB32T 3979-2021 实验用 斑马鱼 饲育技术条件OECD 236 Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test(一)黑色素生成检测法4.方法原理使用 24 孔板，在空白对照或溶剂对照控制的条件下，将 68 hpf 的斑马鱼胚胎置于不同浓度的样品中，在 280.5 的条件下培养至 48 hpf，根据黑色素在鱼胚体表的沉积分布，观察黑色素颗粒分布的变化。5.生物模型5.1 成鱼全国团体标准信息平台采用性成熟、 健康无畸形、 产卵量高、 产卵质量好的野生型斑马鱼 zebrafish （Danio rerio） 成鱼 （418 个月）进行产卵。成鱼的体长 35 cm，雄鱼体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。5.2 鱼胚实验鱼胚为处于 6-8 hpf 时期发育正常的受精卵（参考附录 A）。胚胎孵育温度：280.5 。6.材料与试剂6.1.材料6.1.1. 斑马鱼交配盒。（参考附录 B）6.1.2. 胚胎收集器：100 mm 培养皿，参考附录 B。6.1.3. 孔板：24 孔板：每孔容积 3.5 ml；6.1.4. 离心管：50 mL。6.1.5. 塑料滴管：3 mL，长约 150 mm。6.1.6. 载玻片6.2.试剂(除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用蒸馏水或去离子水)6.2.1. 二甲基亚砜。6.2.2. 熊果苷标准品（纯度98 %）。6.2.3. 氯化钠（NaCl）。6.2.4. 氯化钾(KCl)。6.2.5. 氯化钙(CaCl22H2O )。6.2.6. 碳酸氢钠（NaHCO3）6.2.7. 胚胎缓冲水。6.3.样品溶液6.3.1. 样品储备液：将已知量的样品溶于一定体积胚胎缓冲水或二甲基亚砜中。6.3.2. 样品稀释液：用胚胎缓冲水将样品储备液稀释成所需要的浓度。6.4.对照组溶液6.4.1. 空白对照组：胚胎缓冲水胚胎缓冲水配置方法：称取 7.000 g 氯化钠，0.400 g 碳酸氢钠，0.100 g 氯化钾，0.235 g 无水氯化钙溶于 2 L 水配制而成。6.4.2. 溶剂（阴性）对照组：二甲基亚砜溶液（1 %），水溶性样品无溶剂对照组。6.4.3. 阳性对照组：熊果苷标准工作溶液（100 mmol/L）。精密称取熊果苷标准品（纯度98 %）272.25 mg，用胚胎缓冲水溶解并定容至 10 mL，于室温保存。7.仪器与设备7.1.斑马鱼养殖系统：包括制水、储水、供水、排水及水循坏系统。7.2.连续变倍体视显微镜（带拍照功能）：最小放大倍数为目镜 230，物镜 1。7.3.恒温培养箱：温度调至 280.5 。7.4.冰箱：冷藏室 2 8 ；冰冻室 -18 。7.5.电子天平：精度 0.1 mg。7.6.pH 计：测量范围 014,最小分度为 0.01 pH 单位。7.7.移液枪：0.5 l10 l、10 l100 l、100 l1000 l、1000 l5000 l。全国团体标准信息平台7.8.温度计：0 50 。7.9.实验室一般常规器材。8.实验过程8.1.胚胎准备斑马鱼配种时，产卵盒外缸预先加入 2/3 的养殖水，接着套入带有胚胎分离作用的内缸，插入挡板，隔开雌雄两鱼。 于实验前一天晚上选取大于 4 个月的性成熟的待配种斑马鱼按照 1:1 或 1:2 的雌雄比置于带有挡板的产卵盒中过夜，避光。次日早晨打开光源，抽出产卵盒的挡板使之进行交配产卵。交配 1 h 后，检查各缸成鱼产卵情况，用漏网勺收集斑马鱼交配产生的胚胎,养殖水冲洗至 100 mm 培养皿中， 平均每个培养皿胚胎数量不超过150 枚。清除培养皿中的异物后，放入恒温培养箱里孵育。8.2.样品前处理参考附录 C 化妆品及原料前处理方法。8.3.实验方法在体视显微镜下用塑料滴管随机挑选 6-8 hpf 发育正常的胚胎用于实验。使用 24 孔板为实验载体，每孔加入胚胎 10 枚。用塑料吸管吸干养殖水后，每孔加入 1.0 ml 配制好的受试样品稀释液于上述 24 孔细胞培养板中，设置 3 个平行组，盖上盖板随后置于 280.5 恒温孵化箱中静置。同时设置空白对照组或溶液对照组及阳性对照组。于体视显微镜下观察和记录胚胎 48 hpf 时的黑色素颗粒分布。8.4.结果记录48 hpf 时在体式显微镜下观察拍照记录。其中，每组实验取不少于 3 尾鱼胚用于拍照，拍照时固定拍照参数，将鱼胚正立固定，聚焦鱼胚头部俯视位进行拍照，观察各组斑马鱼体表黑色素颗粒的分布面积和数量。拍照图片使用图形分析软件（如 ImageJ）进行分析，统计黑色素含量，并计算斑马鱼相对黑色素含量：相对斑马鱼黑色素含量（%）= 100式中：Ve样品组黑色素含量平均值；Vc空白对照组黑色素含量平均值；9.质量控制受试物组和阳性对照试验结果符合下列要求，结果方为有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）阳性对照的体表黑色素含量与空白组相比有显著性差异；b）受试物组培养 48 hpf 后，受试物组鱼胚存活率90%；c）阳性对照培养 48 hpf 后，阳性对照组鱼胚存活率90%。10. 结果判定以下条件说明待测物具有美白功效:与空白和溶剂(阴性)对照组相比,待测物处理的斑马鱼胚黑色素含量与空白组相比显著性减少。全国团体标准信息平台11.废弃物处置试验用斑马鱼胚于 28 冷水中灭活处理后按一般废弃物处置。(二)黑色素生成抑制检测法12. 方法原理使用 6 孔细胞培养板，在空白对照或溶剂对照控制的条件下，将 68 hpf 的斑马鱼胚胎置于不同浓度的样品中，在 280.5 的条件下培养至 72 hpf。受试样品配制成溶液孵育鱼胚 72 hpf 后，通过对鱼胚破碎、离心，提取黑色素沉淀，测试受试样品对鱼胚黑色素生成的抑制率。13. 生物模型19.1 成鱼采用性成熟、 健康无畸形、 产卵量高、 产卵质量好的野生型斑马鱼 zebra fish （Danio rerio） 成鱼 （418 个月）进行产卵。成鱼的体长 35 cm，雄鱼体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。19.2 鱼胚实验鱼胚为处于 68 hpf 时期发育正常的受精卵（参考附录 A）。胚胎孵育温度：280.5 。14. 材料与试剂14.1. 材料14.1.1.斑马鱼交配盒。（参考附录 B）14.1.2.胚胎收集器：100 mm 培养皿，参考附录 B。14.1.3.细胞培养板：24 孔细胞培养板：每孔容积 3.5 ml；6 孔细胞培养板：每孔容积 15.0 ml。14.1.4.离心管：50 ml。14.1.5.塑料滴管：3 ml，长约 150 mm。14.1.6.载玻片14.2. 试剂(除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用蒸馏水或去离子水。)14.2.1.二甲基亚砜。14.2.2.熊果苷标准品（纯度98 %）。14.2.3.氯化钠（NaCl）。14.2.4.氯化钾(KCl)。14.2.5.氯化钙(CaCl22H2O )。14.2.6.碳酸氢钠(NaHCO3)。14.2.7.胚胎缓冲水。14.2.8.黑色素标准品（纯度99 %）。14.2.9.氢氧化钠(NaOH)。14.2.10.脱氧胆酸钠。14.2.11.黑色素标准储备溶液（1.0 mg/mL）：称取黑色素标准品 25 mg（精确至 0.1 mg）,用胚胎缓冲水溶解并定容至 25 mL 容量瓶，于 28 保存。14.2.12.氢氧化钠（1.0 mol/L）溶液：称取氢氧化钠 10.0 g，用胚胎缓冲水溶解并定容至 250 mL 容量瓶，于 28 保存。全国团体标准信息平台14.2.13.脱氧胆酸钠（5.0 mg/mL）溶液配制：称取脱氧胆酸钠 125.0 mg，用胚胎缓冲水溶解并定容至25 mL 容量瓶，于 4 保存。14.3. 样品溶液14.3.1.样品储备液：将已知量的样品溶于一定体积蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜中。14.3.2.样品稀释液：用胚胎缓冲水将样品储备液稀释成所需要的浓度。14.4. 对照组溶液14.4.1.空白对照组：胚胎缓冲水胚胎缓冲水配置方法：称取 7.000 g 氯化钠，0.400 g 碳酸氢钠，0.100 g 氯化钾，0.235 g 无水氯化钙溶于 2 L 水配制而成。14.4.2.溶剂（阴性）对照组：二甲基亚砜溶液（1 %），水溶性样品无溶剂对照组。14.4.3.阳性对照组：熊果苷标准储备溶液（0.8 mg/ml）。精密称取熊果苷标准品（纯度98 %）8.0 mg，用胚胎缓冲水溶解并定容至 10 ml，于 28 保存。15. 仪器与设备15.1. 斑马鱼养殖系统：包括制水、储水、供水、排水及水循坏系统。15.2. 连续变倍体视显微镜（带拍照功能）：最小放大倍数为目镜 230，物镜 1。15.3. 恒温培养箱：温度调至 280.5 。15.4. 冰箱：冷藏室 2 8 ；冰冻室 -18 。15.5. 电子天平：精度 0.1 mg。15.6. pH 计：测量范围 014,最小分度为 0.01 pH 单位。15.7. 移液枪：0.5 l10 l、10 l100 l、100 l1000 l、1000 l5000 l。15.8. 温度计：0 50 。15.9. 超声破碎仪。15.10.冷冻离心机。15.11. 全波长酶标仪。15.12.实验室一般常规器材。16. 实验过程16.1. 胚胎准备斑马鱼配种时，产卵盒外缸预先加入 2/3 的养殖水，接着套入带有胚胎分离作用的内缸，插入挡板，隔开雌雄两鱼。于实验前一天晚上选取大于 4 个月的性成熟的待配种斑马鱼按照 1:1 或 1:2 的雌雄比置于带有挡板的产卵盒中过夜，避光。次日早晨打开光源，抽出产卵盒的挡板使之进行交配产卵。交配 1 h 后，检查各缸成鱼产卵情况，用漏网勺收集斑马鱼交配产生的胚胎,养殖水冲洗至 100 mm 培养皿中， 平均每个培养皿胚胎数量不超过150 枚。清除培养皿中的异物后，放入恒温培养箱里孵育。16.2. 样品前处理参考附录 C 化妆品及原料前处理方法。16.3. 实验方法16.3.1 标准曲线的制定全国团体标准信息平台标准曲线的制定：将黑色素标准储备溶液（1.0 mg/mL）稀释成 0.0625、0.125、0.250、0.500 mg/mL的标准系列工作溶液，在酶标仪 405 nm（波长）下，测试黑色素标准溶液的吸光度。16.3.2 黑色素含量检测在体视显微镜下用塑料滴管随机挑选 68 hpf 发育正常的胚胎用于实验（此时的胚胎为原肠期，参见附录 A）。使用 6 孔细胞培养板为实验载体，每孔加入胚胎 30 枚。用塑料吸管吸干养殖水后，每孔加入 5.0 ml 配制好的受试样品稀释液于上述 6 孔细胞培养板中，设置 3 个平行组，盖上盖板随后置于 280.5 恒温孵化箱中静置。同时设置空白对照组或溶液对照组及阳性对照组。在 48 hpf 于体视显微镜下（物镜 23 倍）观察，48 hpf 时将鱼胚用斑马鱼系统养殖水清洗 2 遍，转移至 1.5 ml 离心管。在 1.5 ml 离心管中，加入 150.0 L 脱氧胆酸钠（5.0 mg/mL）溶液，混匀，在 4 水温下，用超声破碎仪将鱼胚破碎。将破碎的鱼胚混合液，置于超低温离心机（4 ，10000 g）离心5 min。离心后，弃去上层上清液，往沉淀物内加入 150.0 L 氢氧化钠（1.0 mol/L），使沉淀完全溶解。完全溶解后，取 100.0 L 实验溶液，加至 96 孔细胞培养板中，另取 100.0 L 氢氧化钠做为调零对照组，于酶标仪 405 nm（波长）下测试吸光度。16.4. 结果计算以黑色素标准品的浓度为纵坐标, OD 值为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程式,将测定的 OD 值代入回归方程式,计算黑素含量。 计算每组三个重复模型的黑素含量平均值及标准差,结果采用 MeanSD 形式表示。黑色素生成的抑制率公式如下：式中：OD酶标仪下测试样品吸光度。结果保留小数点后三位软件：Excel 统计分析软件、Graphpad Prsim 绘图软件17. 质量控制受试物组和阳性对照试验结果符合下列要求，结果方为有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）阳性对照的黑色素抑制率与空白组相比有显著性差异；b）受试物组：培养 48 hpf 后，受试物组鱼胚存活率90%；c）阳性对照：培养 48 hpf 后，阳性对照组鱼胚存活率90%。18. 结果判定以下条件说明待测物具有美白功效：与空白、溶剂(阴性)对照组相比，待测物处理的斑马鱼胚体表变白，黑色素抑制率显著增加，具有统计学差异。19. 废弃物处置试验用斑马鱼胚于 28 冷水中灭活处理后按一般废弃物处置。(三)酪氨酸酶活性抑制检测法全国团体标准信息平台20. 方法原理酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，左旋多巴在酪氨酸酶的作用下,发生氧化生或棕褐色多巴醌,此颜色变化在 475 nm 处有一明显吸收峰。酪氨酸酶活性大小决定了生成多巴醌的量,影响者规定时间内(10min)在 475mm 处吸光度值的变化(E),根据规定时间内吸光度的变化量即可确定培养斑马鱼胚胎中酪氨酸酶活性的大小。21. 生物模型21.1 成鱼采用性成熟、 健康无畸形、 产卵量高、 产卵质量好的野生型斑马鱼 zebra fish （Danio rerio） 成鱼 （418 个月）进行产卵。成鱼的体长 35 cm，雄鱼体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。21.2 鱼胚实验鱼胚为处于 68 hpf 时期发育正常的受精卵（参考附录 A）。胚胎孵育温度：280.5 。22. 材料与试剂22.1. 材料22.1.1.斑马鱼交配盒。（参考附录 B）22.1.2.胚胎收集器：100 mm 培养皿，参考附录 B。22.1.3.细胞培养板：24 孔细胞培养板：每孔容积 3.5 ml；6 孔细胞培养板：每孔容积 15.0 ml。22.1.4.离心管：50 ml。22.1.5.塑料滴管：3 ml，长约 150 mm。22.1.6.载玻片22.2. 试剂22.2.1.氯化钠（NaCl）。22.2.2.氯化钾(KCl)。22.2.3.氯化钙(CaCl22H2O )。22.2.4.碳酸氢钠(NaHCO3)。22.2.5.胚胎缓冲水。22.2.6.黑色素标准品（纯度99 %）。22.2.7.氢氧化钠(NaOH)。22.2.8.脱氧胆酸钠。22.2.9.左旋多巴。22.2.10.黑色素标准储备溶液（1.0 mg/mL）：称取黑色素标准品 25 mg（精确至 0.1 mg），用胚胎缓冲水溶解并定容至 25 mL 容量瓶，于 28 保存。22.2.11.氢氧化钠（1.0 mol/L）溶液：称取氢氧化钠 10.0 g，用胚胎缓冲水溶解并定容至 250 mL 容量瓶，于 28 保存。22.2.12.脱氧胆酸钠（5.0 mg/mL）溶液配制：称取脱氧胆酸钠 125.0 mg，用胚胎缓冲水溶解并定容至25 mL 容量瓶，于 4 保存。22.2.13.左旋多巴（5.0 mmol/L）溶液：称取左旋多巴 98.595 mg，用胚胎缓冲水溶解并定容至 100 mL容量瓶，于 28 保存。22.3. 样品溶液全国团体标准信息平台22.3.1.样品储备液：将已知量的样品溶于一定体积蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜中。22.3.2.样品稀释液：用胚胎缓冲水将样品储备液稀释成所需要的浓度。22.4. 对照组溶液22.4.1.空白对照组：胚胎缓冲水胚胎缓冲水配置方法：称取 7.000 g 氯化钠，0.400 g 碳酸氢钠，0.100 g 氯化钾，0.235 g 无水氯化钙溶于 2 L 水配制而成。22.4.2.溶剂（阴性）对照组：二甲基亚砜溶液（1 %），水溶性样品无溶剂对照组。22.4.3.阳性对照组：熊果苷标准工作溶液（100 mmol/L）。精密称取熊果苷标准品（纯度98 %）272.25 mg，用胚胎缓冲水溶解并定容至 10 mL，于室温保存。23. 仪器与设备23.1. 斑马鱼养殖系统：包括制水、储水、供水、排水及水循坏系统。23.2. 连续变倍体视显微镜（带拍照功能）：最小放大倍数为目镜 230，物镜 1。23.3. 恒温培养箱：温度调至 280.5 。23.4. 冰箱：冷藏室 2 8 ；冰冻室 -18 。23.5. 电子天平：精度 0.1 mg。23.6. pH 计：测量范围 014,最小分度为 0.01 pH 单位。23.7. 移液枪：0.5 l10 l、10 l100 l、100 l1000 l、1000 l5000 l。23.8. 温度计：0 50 。23.9. 超声破碎仪。23.10.冷冻离心机。23.11. 全波长酶标仪。23.12.实验室一般常规器材。24. 实验过程24.1. 胚胎准备斑马鱼配种时，产卵盒外缸预先加入 2/3 的养殖水，接着套入带有胚胎分离作用的内缸，插入挡板，隔开雌雄两鱼。于实验前一天晚上选取大于 4 个月的性成熟的待配种斑马鱼按照 1:1 或 1:2 的雌雄比置于带有挡板的产卵盒中过夜，避光。次日早晨打开光源，抽出产卵盒的挡板使之进行交配产卵。交配 1 h 后，检查各缸成鱼产卵情况，用漏网勺收集斑马鱼交配产生的胚胎,养殖水冲洗至 100 mm 培养皿中， 平均每个培养皿胚胎数量不超过150 枚。清除培养皿中的异物后，放入恒温培养箱里孵育。24.2. 样品前处理参考附录 C 化妆品及原料前处理方法。24.3. 实验方法在体视显微镜下用塑料滴管随机挑选 68 hpf 发育正常的胚胎用于实验（此时的胚胎为原肠期，参见附录 A）。使用 6 孔细胞培养板为实验载体，每孔加入胚胎 30 枚。用塑料吸管吸干养殖水后，每孔加入 5.0 ml 配制好的受试样品稀释液于上述 6 孔细胞培养板中，设置 3 个平行组，盖上盖板随后置于 280.5 恒温孵化箱中静置。同时设置空白对照组或溶液对照组及阳性对照组。全国团体标准信息平台在 48 hpf 时于体视显微镜下（物镜 23 倍）观察，48 hpf 时将鱼胚用斑马鱼系统养殖水清洗 2 遍，转移至 1.5 mL 离心管。加入 150.0 L 脱氧胆酸钠（5.0 mg/mL）溶液，混匀，在 4 水温下，物理或化学法将鱼胚破碎（超声破碎仪、组织匀浆机或细胞裂解液等）。胚胎组织匀浆置于超低温离心机（4 ，10000 g）离心 5 min。取上清液 100.0 uL 加至 96 孔细胞培养板中，每孔加入 100.0 L 左旋多巴溶液（5.0 mmol/L）；另取 100 L 脱氧胆酸钠溶液（5.0 mg/mL），100.0 L 左旋多巴溶液（5.0 mmol/L），做为调零对照组。置于 37 恒温培养箱，孵育 1 h。取出，置于酶标仪 475 nm（波长）下测试吸光度。实验过程中注意保持低温，以免酪氨酸酶失活。（可根据实际需要加入酶抑制剂）24.4. 结果计算酪氨酸酶活性抑制率公式如下：式中：OD酶标仪下测试样品吸光度。结果保留小数点后三位软件：Excel 统计分析软件、Graphpad Prsim 绘图软件25. 质量控制受试物组和阳性对照试验结果符合下列要求，结果方为有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）阳性对照的酪氨酸酶活性抑制率与空白组相比有显著性差异；b）受试物组：培养 48 hpf 后，受试物组鱼胚存活率90%；c）阳性对照：培养 48 hpf 后，阳性对照组鱼胚存活率90%。26. 结果判定以下条件说明待测物具有美白功效:与空白、溶剂(阴性)对照组相比,待测物处理的斑马鱼胚体表变白，酪氨酸酶活性抑制率显著增加，具有统计学差异。27. 废弃物处置试验用斑马鱼胚于 28 冷水中灭活处理后按一般废弃物处置。全国团体标准信息平台附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图0 hpf（合子期）68 hpf（原肠期）24 hpf（体节期）48 hpf（孵化期）72 hpf （幼鱼）全国团体标准信息平台附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图外缸：225*115*115 mm内缸 220*110*85 mm挡板、外盖斑马鱼配种胚胎收集培养皿全国团体标准信息平台附录 C（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法C1.水溶性原料可用胚胎缓冲液直接将受试物溶解配制成测试溶液。C2.非水溶性原料可选常用溶剂如甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶。如将受试物和有机溶剂按 1：1（重量 g：体积mL） 混匀， 超声处理 10 min， 然后加入鱼胚胎培养液配制成所需浓度， 震荡 30s 后于 6500g 离心 10 min。取上清液进行测试。C3.化妆品产品水溶性产品：可用鱼胚胎培养液直接将受试物溶解配制成测试溶液。非水溶性产品：可选常用溶剂如甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶。如将受试物和有机溶剂按 1：1（重量 g：体积 mL）混匀，超声处理 10 min，然后加入鱼胚胎培养液配制成所需浓度，震荡 30 s 后于 6500g 离心 10 min。取上清液进行测试。全国团体标准信息平台附录 D（资料性附录）斑马鱼养鱼及维护养殖环境斑马鱼成鱼的养殖及维护的条件（可参考国家斑马鱼资源中心技术）。D1.温度水温适宜范围：2430 ；鱼房室温范围：2527 ；观察胚胎发育最佳温度：280.5 。D2.pH耐受范围：6.09.5；养殖范围：7.08.0。D3.电导率养殖范围：200.01700.0 S/cm；最适范围：500.0800.0 S/cm。D4.光周期和光照强度光周期：14 h 光照和 10h 黑暗；光照强度 54324 lux。D5.活饵以市售丰年虫为种鱼饵料，按所购商品说明孵化丰年虫后喂食。D6.产卵周期三个月龄的斑马鱼可达到性成熟，选择鱼龄 4 月18 月的雌雄成鱼配对，产卵后为保证获取足量的胚胎，应 1 周2 周才能重新配对产卵。全国团体标准信息平台附录 E（资料性附录）斑马鱼俯视拍照示意图全国团体标准信息平台