流式细胞术原理及应用.ppt

流式细胞检测技术n n流式细胞检测技术的原理和方法n n流式细胞检测技术的应用n n流式细胞相关技术流式细胞检测技术的发展n n从本世纪初开始，科学家们就在不断探索细胞从本世纪初开始，科学家们就在不断探索细胞测量技术，测量技术，19681968年斯坦福大学的年斯坦福大学的BillBonnerBillBonner等等研制出第一台以荧光活化的细胞筛选仪研制出第一台以荧光活化的细胞筛选仪(Fluorescence-activatedcellsorter,FACS)Fluorescence-activatedcellsorter,FACS)。19731973年年BDBD公司以公司以FACSFACS的商品名称出品了第一的商品名称出品了第一台商业化的流式细胞仪台商业化的流式细胞仪(FlowFlowCytometerCytometer,FCM),FCM)。随着单克隆抗体技术的发展，流式细胞仪检测随着单克隆抗体技术的发展，流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域，免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域，对各个学科的发展发挥着重要作用。对各个学科的发展发挥着重要作用。流式细胞术及其应用n n流式细胞术的原理和方法n n流式细胞术在生物学和医学研究中的应用n n流式细胞相关技术流式细胞仪工作原理图流式细胞仪的工作原理n n流式细胞仪包括液流系统、光学系统、分选系流式细胞仪包括液流系统、光学系统、分选系统和数据处理系统。待测样本中的细胞或其它统和数据处理系统。待测样本中的细胞或其它生物学颗粒性物质经液流系统单个地流过流式生物学颗粒性物质经液流系统单个地流过流式细胞仪中激光照射的区域，细胞受激光的激发细胞仪中激光照射的区域，细胞受激光的激发产生信号，被仪器中的信号接收器接受并放大，产生信号，被仪器中的信号接收器接受并放大，这些放大了的信号经计算机分析处理，并以图这些放大了的信号经计算机分析处理，并以图表的形式直观地显示出来；通过分选系统还可表的形式直观地显示出来；通过分选系统还可以将某些类型的细胞群体筛选出来。以将某些类型的细胞群体筛选出来。信号分析n n流式细胞仪产生并分析的信号主要有光散射信号和荧光信号。光散射信号的强弱可以反映细胞的大小、形态及胞浆颗粒化的程度等。依荧光素的不同，用不同波长的光激发，发射出不同波长的荧光，可显示不同的颜色，在不同的实验体系中，这些荧光信号就可以反映不同的细胞生物学特性荧光信号分析n n如用荧光染料如用荧光染料(FITCFITC或或PEPE等等)标记的单克隆标记的单克隆抗体抗体 特异性地与细胞表面的抗原、受体或膜糖特异性地与细胞表面的抗原、受体或膜糖蛋白结合，在激光的激发之下，发出一定波长蛋白结合，在激光的激发之下，发出一定波长的荧光。荧光信号的强度反映了膜抗原、受体的荧光。荧光信号的强度反映了膜抗原、受体或糖蛋白的相对数量，对荧光信号进行收集分或糖蛋白的相对数量，对荧光信号进行收集分析，就可以实现对细胞亚群和功能等的分析。析，就可以实现对细胞亚群和功能等的分析。用用DNADNA染料对染料对DNADNA进行染色，染料通过一定方进行染色，染料通过一定方式与式与DNADNA链结合，在激光的激发下，染料发出链结合，在激光的激发下，染料发出荧光，测定荧光的强度，就可得出相对荧光，测定荧光的强度，就可得出相对DNADNA的的含量，进而可对细胞周期时相进行分析。用特含量，进而可对细胞周期时相进行分析。用特定的荧光染料还可对细胞钙离子浓度、细胞内定的荧光染料还可对细胞钙离子浓度、细胞内pHpH值以及细胞膜电位等进行测定。值以及细胞膜电位等进行测定。FCM在细胞生物学中的应用n n11细胞周期分析细胞周期分析 在细胞周期内，在细胞周期内，DNADNA含量随时相发生周期性含量随时相发生周期性的变化。通过荧光探针对细胞进行相对的变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNADNA含量含量测定，可分析细胞周期各时相的百分比，周期动测定，可分析细胞周期各时相的百分比，周期动力学参数以及力学参数以及DNADNA异倍体。异倍体。DNADNA和和RNARNA特异性特异性染料有染料有PIPI、EBMIEBMI、CA3CA3、HO.33258HO.33258、HO.33342HO.33342、DAPIDAPI、7-AAD7-AAD、AOAO和和PYPY等。通过抗溴脱氧脲嘧等。通过抗溴脱氧脲嘧啶核苷啶核苷(BrdUrdBrdUrd)的单克隆抗体也可对的单克隆抗体也可对DNADNA进行染进行染色。色。2细胞内钙离子浓度测定荧光染料(如Quin-2、Indo-1、Fura-2、Fluo-3和Rhod-2等)通过乙酰甲酯(AE)导入细胞后，与钙离子特异性结合。染料的激活或发射特性与钙离子浓度有关，故可用比例法测得或直接测得的荧光强度得到钙离子浓度的相对值，实际浓度需经校对后获得3细胞内pH值测定荧光染料(BCECF、COFDA、DCH和SNARF等)激发光谱或发射光谱是pH值依赖的。在生理pH值范围内，比例荧光与pH值有很好的线性关系，故可用比例荧光测pH值，实际pH值经校正后获得。FCM在肿瘤学中的应用1肿瘤诊断DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标志，细胞的增殖能力大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此，临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。2肿瘤预后估计n n通常，异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移通常，异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道，率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中，异倍体和异倍体和/或较高的或较高的S S期百分比都是不良预后的期百分比都是不良预后的标志。同样地，在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、标志。同样地，在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上，用流式细胞仪检测肿瘤期等指标基础上，用流式细胞仪检测肿瘤DNADNA倍体可更客观地预测预后。倍体可更客观地预测预后。3监测癌基因和抑癌基因表达n n在肿瘤发生发展过程中的作用用流式细胞仪可以通过特异性的单克隆抗体监测肿瘤细胞中癌基因表达产物的水平以研究肿瘤调控因素。如有文献报道，p53蛋白在乳腺癌细胞中的表达与肿瘤的预后有关。而ras基因的产物P21蛋白的表达从萎缩性胃炎、癌前病变、胃癌依次增加，证实P21蛋白在癌变过程中参与了重要作用。在细胞凋亡研究中的应用细胞凋亡过程中，由于胞浆和核染色质浓缩，核裂解，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生相应的变化，因此测定细胞的光散射是非常简单的细胞凋亡分析方法。用PI、AO和Rh123等染料染色，还可以将坏死细胞、凋亡细胞和活细胞定量地区分开来。FCM通过对凋亡的检测，可以研究各种调控因素如癌基因、射线及化疗药物对凋亡的影响。FCM在药理学中的应用11多重耐药性多重耐药性(MultidrugMultidrugResistance,MDR)MDRResistance,MDR)MDR指指对几种自然产生细胞毒素的交叉抗性，是成功化疗的一对几种自然产生细胞毒素的交叉抗性，是成功化疗的一种主要障碍。种主要障碍。MDRMDR可能是因为跨可能是因为跨膜膜P-P-糖蛋白糖蛋白(P-P-gpgp)的高的高表达和表达和/或细胞内药物重新分配异常，从而使细胞内药或细胞内药物重新分配异常，从而使细胞内药物在有效作用部位的净摄入量减少所致。物在有效作用部位的净摄入量减少所致。FCMFCM在评价在评价MDRMDR及其调控因素中的作用：及其调控因素中的作用：在结构方面：检测在结构方面：检测P-P-gpgp的高表达，在功能方面，检测抗肿瘤药物的细胞内积聚的高表达，在功能方面，检测抗肿瘤药物的细胞内积聚程度，判断疗效；检测药物在细胞内的重新分配，判断程度，判断疗效；检测药物在细胞内的重新分配，判断是否在药物作用位点。是否在药物作用位点。化疗药物作用机制及疗效评价：化疗药物作用机制及疗效评价：FCMDNAFCMDNA直方图变化分析，可快速显示肿瘤细胞体的直方图变化分析，可快速显示肿瘤细胞体的增殖能力，应用增殖能力，应用BrdUrdBrdUrd掺入技术和抗掺入技术和抗BrdUrdBrdUrd单克隆抗体单克隆抗体免疫荧光，的准确测定免疫荧光，的准确测定DNADNA合成速率，动态观察肿瘤生合成速率，动态观察肿瘤生长状态。因此可根据细胞周期各时期分布情况，研究化长状态。因此可根据细胞周期各时期分布情况，研究化疗药物作用机制疗药物作用机制(是否周期特异性或时相特异性是否周期特异性或时相特异性)，并直，并直观了解化疗药物对癌细胞动力学的干扰和影响。观了解化疗药物对癌细胞动力学的干扰和影响。FCM在血液学中的应用n n不同系列、不同分化阶段血细胞膜表面表达不不同系列、不同分化阶段血细胞膜表面表达不同的分化抗原，故同的分化抗原，故FCMFCM免疫表型分析可为血液免疫表型分析可为血液病的临床诊断和预后观测提供一个有效的工具。病的临床诊断和预后观测提供一个有效的工具。白血病和淋巴瘤：用白血病和淋巴瘤：用FCMFCM进行免疫表型分析，进行免疫表型分析，提高亚型诊断水平；由于白血病细胞免疫分型提高亚型诊断水平；由于白血病细胞免疫分型的特点，反映了其本质上与相应正常骨髓细胞的特点，反映了其本质上与相应正常骨髓细胞的差异，白血病细胞丧失了正常细胞的系列专的差异，白血病细胞丧失了正常细胞的系列专一性和分化阶段规律性，这有利于鉴别诊断和一性和分化阶段规律性，这有利于鉴别诊断和残存白血病鉴别。残存白血病鉴别。血小板疾病诊断：血小板疾病诊断：FCMFCM可用于血小板膜糖蛋白可用于血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断，包括异常所致疾病的诊断，包括先天先天性或获得性血性或获得性血小板疾病；小板疾病；FCMFCM还可用于评价活化血小板程度还可用于评价活化血小板程度在血栓疾病和血栓前状态发生发展中的作用。在血栓疾病和血栓前状态发生发展中的作用。FCM在免疫检测中的应用1 1 在肿瘤学中的应用：对恶性肿瘤在肿瘤学中的应用：对恶性肿瘤DNADNA含量进行分析含量进行分析 对对肿瘤化疗具有重要的意义肿瘤化疗具有重要的意义 2.2.在临床细胞免疫中的作用：在临床细胞免疫中的作用：FCMFCM通过荧光抗原抗体检通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用3.3.在血液病诊断和治疗中的应用：在血液病诊断和治疗中的应用：FCMFCM通过对外周血细通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和胞或骨髓细胞表面抗原和DNADNA的检测分析，对各种血的检测分析，对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用 4.4.在血栓与出血性疾病中的应用：测定血小板相关抗体在血栓与出血性疾病中的应用：测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体，间接法可含量。直接法检测血小板表面的相关抗体，间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备流式细胞仪的相关技术实验n n单克隆抗体制备技术n n抗体的荧光标记n n流式细胞检测标本的荧光抗体标记技术