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第 53 卷第 11 期2023 年 11 月Vol.53 No.11Nov.20231345 日 用 化 学 工 业（中英文）China Surfactant Detergent&Cosmetics Received:March 28,2023;Revised:October 25,2023.*Corresponding author.Tel.:[phone],E-mail:.甘肃省自然科学基金项目（21JR1RA275）；甘肃省自然科学基金项目（21JR11RA137）DOI：10.3969/j.issn.2097-2806.2023.11.015Determination of ferulic acid and baicalin content in Gui Qin toothpaste and its pharmacodynamic studyLixiaZheng,HuiqinGao,SaLi,CongjiaGuo,QianyingHao,GuotaiWu*（School of Pharmacy,Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou,Gansu 730000,China）Abstract:A method for determining the content of ferulic acid and baicalein in the toothpaste by high performance liquid chromatography（HPLC）was established,and its pharmacological effects such as anti-inflammatory,analgesic and hemostatic effects were studied.Angelica and Baical skullcap root are the main medicines of Gui Qin toothpaste.The content of ferulic acid and baicalein,the main components of Gui Qin toothpaste,was determined by HPLC.The column was Agilent ZOBAX SB C18（2.1 mm150 mm,5 m）,the mobile phase was acetonitrile-0.2%acetic acid aqueous solution（gradient elutation）,the flow rate was 1.0 mL/min,the detection wavelength was 320 nm,and the column temperature was 35.The anti-inflammatory,analgesic and hemostatic effects of Gui Qin toothpaste were investigated by establishing a model of xylene-induced ear swelling,mouse hot plate method and mouse liver wound bleeding model.The expression of inflammatory factors such as tumor necrosis factor-（TNF-）,interleukin-1（IL-1）and interleukin-6（IL-6）in the mouse ear tissues was detected by ELISA.The injection rates of ferulic acid and baicalin show a good linear relationship between the injection concentration and the peak area in the range of 3.04-304 g/mL and 2.86-286 g/mL,respectively（R20.999 7）.The RSDs of the precision,stability and repeatability tests are less than 3.0%.The average dosing recovery rates are 98.95%and 99.87%,and the RSDs are 1.51%and 0.22%,respectively.The sample should contain no less than 0.54 mg of ferulic acid per 1 g and no less than 16.8 mg of baicalin.The HPLC method has strong specificity,good repeatability and stability,and can be used for quality control of Gui Qin toothpaste.Pharmacodynamic experiments have shown that Gui Qin toothpaste has good anti-inflammatory,analgesic and hemostatic effects.This study provides an experimental basis for the development and clinical application of Gui Qin toothpaste in the later stage.Key words:Gui Qin toothpaste;ferulic acid;baicalein;content determination;high performance liquid chromatography1346第 53 卷分析与检测日 用 化 学 工 业（中英文）牙龈红肿、出血、疼痛是牙龈炎症的标志，是口腔常见病，也是牙周疾病的早期症状，如不能得到有效控制，炎症扩延到深部牙周组织引起牙槽骨吸收和牙周袋形成时即发展为牙周炎。因此，预防和消除牙龈炎症是预防牙周疾病的关键。归芩牙膏以当归、黄芩为主药，具有清热凉血、止血、消肿止痛等功效，能有效预防和改善牙龈出血及肿痛、牙菌斑、牙本质过敏等口腔疾病。当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diel s的干燥根1，归心、肝、脾经，味甘辛，性温，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。现代药理研究表明，当归中水溶性成分阿魏酸具有抗菌、消炎、镇痛的作用2,3。黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根1，归肺、胆、脾、大肠、小肠经，味苦，性寒。现代药理研究发现，黄芩素和黄芩苷作为黄芩的主要有效成分，具有抗病毒和抗菌的药理作用，能减轻炎症变态反应，消除炎症，促进牙周组织恢复健 康4,5。因此，本实验选取阿魏酸、黄芩苷作为指标成分，建立HPLC法测定其含量，并验证其抗炎、镇痛、止血功效，以期为控制归芩牙膏质量及二次开发提供参考。1 实验部分1.1 主要材料、试剂与仪器归芩牙膏，牙膏基质，均由甘肃中医药大学药学院归芩牙膏课题组提供；某品牌中草药牙膏（阳性对照品）；阿魏酸对照品、黄芩苷对照品，北京北纳创联生物技术研究院；乙腈（色谱纯），默克公司；其余试剂均为分析纯，水为纯水；TNF-酶联免疫检测试剂盒、IL-1酶联免疫检测试剂盒、IL-6酶联免疫检测试剂盒，江苏泽雨生物科技有限公司。抗炎实验SPF级昆明种小鼠40只，雌雄各半；镇痛实验SPF级昆明种小鼠32只，雌性；止血实验SPF级昆明种小鼠32只，雌雄各半，体重均为（202）g，均由甘肃中医药大学科研实验中心提供，动物许可证：SYXK（甘）2020-0009。本实验由甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理审查批准号：2022-527。SQP型分析天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；Bioruptor型超声波系统，美国Diagenode公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；SpectraMax i3x型酶标仪，美国Molecular Devices公司；JNT-DRQ型打耳器，北京冀诺泰科技发展公司；YSL-6B型热板测痛仪，上海精密仪器仪表有限公司。1.2 实验方法1.2.1 样品制备对照品溶液的制备：精密称阿魏酸对照品15.2 mg，黄芩苷对照品14.3 mg，分别放入同一25 mL棕色容量瓶内，加入无水乙醇，定容至刻度线，得到阿魏酸对照品溶液质量浓度为0.608 mg/mL、黄芩苷对照品溶液归芩牙膏中阿魏酸、黄芩苷含量测定及其药效学研究郑丽霞，高慧琴，李 飒，郭从嘉，郝倩莹，吴国泰*（甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000）摘要：建立高效液相色谱（HPLC）测定归芩牙膏中阿魏酸、黄芩苷含量的方法，研究其抗炎、镇痛、止血等药理作用。通过HPLC对归芩牙膏中君药当归、黄芩的主要成分阿魏酸、黄芩苷进行含量测定，色谱柱为Agilent ZOBAX SB C18（2.1 mm150 mm，5 m），流动相为乙腈-0.2%乙酸水溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为320 nm，柱温为35。通过建立二甲苯致小鼠耳肿胀模型、小鼠热板法和小鼠肝脏创面出血模型考察归芩牙膏抗炎、镇痛及止血作用。并通过ELISA法检测小鼠耳廓组织中肿瘤坏死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）等炎症因子的表达情况。阿魏酸、黄芩苷进样量分别在3.04304 g/mL，2.86286 g/mL范围内进样质量浓度与峰面积均呈现良好的线性关系（R20.999 7）；精密度、稳定性、重复性试验RSD均小于3.0%；平均加样回收率分别为98.95%，99.87%，RSD分别为1.51%，0.22%。样品中每1 g含阿魏酸应不低于0.54 mg，含黄芩苷应不低于16.8 mg。HPLC法专属性强，重复性和稳定性良好，可用于归芩牙膏的质量控制。药效学实验表明归芩牙膏具有良好的抗炎、镇痛和止血作用。本研究为后期归芩牙膏的开发及临床应用提供了实验依据。关键词：归芩牙膏；阿魏酸；黄芩苷；含量测定；高效液相色谱中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：2097-2806（2023）11-1345-061347第 11 期分析与检测郑丽霞，等：归芩牙膏中阿魏酸、黄芩苷含量测定及其药效学研究 质量浓度为0.572 mg/mL。供试品溶液的制备：精密称归芩牙膏0.338 0 g，放入25 mL棕色容量瓶内，添加无水乙醇和纯水（体积比11）溶解，定容，摇匀，超声10 min，采用0.45 m滤膜滤过，即得滤液。阴性溶液的制备：按照供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。1.2.2 色谱条件采用Agilent ZOBAX SB C18（2.1 mm150 mm，5 m）色谱柱，流动相：乙腈-0.2%乙酸水溶液，按表1中的比例进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为35，检测波长为320 nm，进样量为20 L6,7。表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure时间/min（流动相A）/%（流动相B）/%0 21387 2181330877018253070252830137087283013871.2.3 抗炎实验将40只小鼠适应性喂养3 d后，按照随机数字表法分为空白组、模型组、阳性对照组、牙膏基质组、归芩牙膏组，共5组，每组8只，雌雄各半。除空白组外，各组小鼠右耳廓均匀涂抹二甲苯0.2 mL/只致炎；左耳作对照，不加处理。致炎30 min后分别在每只小鼠右耳廓内外两面均匀涂抹0.2 mL生理盐水或0.2 g相应牙膏。给药1 h小鼠脱臼处死后，剪下左右两只耳廓，洗净右耳廓，重叠左右两只耳廓，用内径78 mm的打孔器在耳朵同一部位凿取两个相同圆耳片，分别称重。取各组右耳片置于冻存管内，温度-80 保存，采用ELISA法测定耳组织匀浆上清液TNF-、IL-1和IL-6含量。肿胀度=右耳片质量-左耳片质量，肿胀抑制率=（模型组平均肿胀度-用药组平均肿胀度）/模型组平均肿胀度100%8,9。1.2.4 镇痛实验将热板测痛仪温度控制在（550.5）区间内，当待测痛仪的温度逐渐趋于稳定时，小鼠置于热板中，测各小鼠痛阈值，若其痛阈值在5 s以下或者30 s以上以及逃避和跳跃者弃之不用。将32只小鼠适应性喂养3 d后，按照随机数字表法分为空白组、阳性对照组、牙膏基质组、归芩牙膏组，共4组，每组8只，雌性。重复测定2次小鼠痛阈值，最终确定给药前痛阈值为2次痛阈值的平均值。按每只脚0.2 g的剂量，各给药组小鼠的4个足趾分别涂抹相应药物，外用涂予受试物后15，30，45 min按同法分别测定小鼠的痛阈 值。若小鼠60 s后仍无反应，其痛阈值以最高值60 s记录。小鼠给药前平均痛阈值=（第一次正常测量痛阈值+第二次正常测量痛阈值）/2；痛阈值提高百分率=（用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值）/用药前平均痛阈值100%（注：上述公式若分子计算为负数，则按0记）10。1.2.5 止血实验将32只小鼠适应性喂养3 d后，按照随机数字表法分为空白组、阳性对照组、牙膏基质组、归芩牙膏组，共4组，每组8只，雌雄各半。称取2 g归芩牙膏，置于50 mL离心管中，加入20 mL生理盐水，制备成0.1%归芩牙膏药液，置于4冰箱备用。同法制备0.1%市售中草药牙膏药液和牙膏基质药液备用。将小鼠麻醉后，开腹，暴露肝脏，用手术刀在肝脏表面划一块长约1 cm，深约0.2 cm的伤口。将涂有生理盐水或受试药液1 mL的纱布覆盖上去，先每隔10 s，再每隔5 s观察一次。实验过程中记录止血时间，比较各组之间的止血时间差异，计算止血降低率。止血降低 率=（给药组出血时间-空白组出血时间）/空白组出血时间11。2 结果与讨论2.1 HPLC测定结果2.1.1 系统适用性实验色谱条件进样，在该色谱条件下各成分均能很好分离。结果如图1图3。图1 混合对照品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of the mixed control03020100300200100400?t/min1348第 53 卷分析与检测日 用 化 学 工 业（中英文）2.1.2 线性关系考察将混合对照品溶液加入色谱仪中，测定各色谱峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，以进样质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归，分别得到阿魏酸和黄芩苷的回归方程，结果见表2。由表2可知，阿魏酸在3.04304 g/mL质量浓度范围内，黄芩苷在2.86286 g/mL质量浓度范围内，进样质量浓度与峰面积均呈现良好的线性关系。表2 线性关系考察结果（n=3）Tab.2 Results of linear relationship investigation（n=3）线性方程R2线性范围/（g/mL）阿魏酸Y=102.44X+94.5450.999 73.04304黄芩苷Y=41.778X-10.7510.999 92.862862.1.3 精密度试验精密吸取阿魏酸和黄芩苷混合对照品溶液20 L，按照色谱条件，连续进样6次，阿魏酸峰面积RSD为1.25%，黄芩苷峰面积RSD为2.68%，说明仪器精密度良好。2.1.4 稳定性试验取同一供试品溶液，室温下放置，按色谱条件图2 供试品HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of the test productst/min03020100400200600?图3 阴性对照HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatogram of the negative controlt/min03020100400200600分别在0，2，4，6，8，24 h进样测定阿魏酸和黄芩苷峰面积，阿魏酸峰面积RSD为1.26%，黄芩苷峰面积RSD为0.98%，表明供试品溶液在制备后的24 h内 稳定。2.1.5 重复性试验取同一批归芩牙膏6份测定含量，结果表明，阿魏酸的平均含量为7.30 g/mL，RSD为1.42%，黄芩苷的平均含量为225.59 g/mL，RSD为0.97%，结果显示测定方法重复性较好。2.1.6 加样回收率取已知的同一归芩牙膏9份，每份0.1 g，分别加入80%，100%，120%阿魏酸对照品和黄芩苷对照品，按上述方法制成供试品溶液，并按色谱条件进样，测定出阿魏酸平均加样回收率为98.95%，RSD为1.51%；黄芩苷平均加样回收率为99.87%，RSD为0.22%，结果见表3。表3 加样回收率实验结果（n=9）Tab.3 Results of dosing recovery experiments（n=9）成分样品含量/mg加入量/mg测得量/mg加样回收率/%平均加样回收率/%RSD/%阿魏酸0.053 60.040.093 098.5098.951.510.054 00.040.092 696.500.054 20.040.093 899.000.052 40.050.102 8100.800.053 60.050.102 096.800.054 20.050.104 099.600.053 60.060.114 0100.670.052 40.060.112 099.330.053 00.060.112 699.33黄芩苷1.685 61.343.026 0100.0399.870.221.680 21.343.016 699.731.690 61.343.022 099.361.680 21.683.359 099.931.690 61.683.369 099.911.679 81.683.360 2100.021.680 22.013.686 099.791.681 42.013.690 099.931.685 62.013.697 4100.092.1.7 样品含量测定按上述方法制备供试品溶液，并按色谱条件进行含量测定。结果见表4。1349第 11 期分析与检测郑丽霞，等：归芩牙膏中阿魏酸、黄芩苷含量测定及其药效学研究 2.2 耳廓肿胀度和炎症因子含量阳性对照组和归芩牙膏均具有良好抗炎作用，对耳肿胀有明显抑制作用（P0.01），但从抑制率来看，归芩牙膏组抑制率较高于阳性对照组。通过ELISA检测技术发现，耳肿胀模型小鼠耳组织中TNF-、IL-1、IL-6含量明显升高（P0.01）。较阳性对照组相比，归芩牙膏组抑制耳组织中TNF-、IL-1、IL-6含量效果明显。结果见表58。表5 各给药组对二甲苯致炎小鼠肿胀度的影响（xs，n=8）Tab.5 Ef fects of each dosing group on the swelling degree of xylene-induced mice（xs,n=8）组别剂量耳廓肿胀度肿胀抑制率/%空白组0.2 mL NS模型组0.2 mL NS8.251.80阳性对照组0.2 g4.631.56*43.94牙膏基质组0.2 g6.090.92*26.21归芩牙膏组0.2 g4.111.54*50.15注：与模型组比较：*P0.05，*P0.01；与牙膏基质组比较：P0.05，P0.01。表6 各组小鼠耳廓组织TNF-含量检测结果（xs,n=8）Tab.6 Re sults of TNF-content detection of ear tissue in each group（xs,n=8）组别剂量（TNF-）/（ng/L）空白组0.2 mL NS932.5 20.41模型组0.2 mL NS1 178.8537.83*阳性对照组0.2 g1 098.6567.75牙膏基质组0.2 g1 158.0294.08归芩牙膏组0.2 g1 068.9648.32注：与空白组比较：*P0.01；与模型组比较：P0.01。表7 各组小鼠耳廓组织IL-1含量检测结果（xs,n=8）Tab.7 Re sults of IL-1 content detection of ear tissue in each group（xs,n=8）组别剂量（IL-1）/（ng/L）空白组0.2 mL NS102.3410.10模型组0.2 mL NS164.9516.95*阳性对照组0.2 g131.7319.58牙膏基质组0.2 g152.9814.08归芩牙膏组0.2 g107.1812.23注：与空白组比较：*P0.01；与模型组比较：P0.01；与阳性对照组比较：P0.05，P0.01；与牙膏基质比较：P0.01。表8 各组小鼠耳廓组织IL-6含量检测结果（xs,n=8）Tab.8 Re sults of IL-6 content detection of ear tissue in each group（xs,n=8）组别剂量（IL-6）/（pg/mL）空白组0.2 mL NS124.0418.29模型组0.2 mL NS167.6311.18*阳性对照组0.2 g144.3914.74牙膏基质组0.2 g160.4214.59归芩牙膏组0.2 g134.9411.43注：与空白组比较：*P0.01；与模型组比较：P0.01；与阳性对照组比较：P0.05；与牙膏基质比较：P0.05，P0.01。2.3 痛阈值和痛阈值提高率阳性对照药和归芩牙膏均具有良好镇痛作用，与给药前痛阈值相比，阳性对照组（P0.01）和归芩牙膏组（P0.01或P0.05）给药后三个时间节点痛阈值均提高。结果见表9。表4 归芩牙膏中阿魏酸、黄芩苷含量测定（n=3）Tab.4 Determination of ferulic acid and baicalin in Gui Qin toothpaste（n=3）成分阿魏酸峰面积/（mAU min）（阿魏酸）/（g/mL）阿魏酸含量/%黄芩苷峰面积/（mAU min）（黄芩苷）/（g/mL）黄芩苷含量/%1847.67.350.0549 480.9227.191.682847.07.359 479.6227.163846.47.349 479.5227.16表9 各组给药前后痛阈值及痛阈值提高率（xs,n=8）Tab.9 The pain threshold and pain threshold improvement rate before and after administration in each group（xs,n=8）组别剂量给药前痛阈值/s给药后不同时间痛阈值/s痛阈值提高率/%15 min30 min45 min空白组0.2 mL NS11.113.4311.913.2612.323.3712.313.95 9.67阳性对照组0.2 g11.502.1616.311.61*17.322.24*18.272.54*50.42牙膏基质组0.2 g11.201.6011.521.7611.881.9211.991.75 5.38归芩牙膏组0.2 g11.883.3016.624.25*17.774.35*18.444.67*48.27注：与给药前比较：*P0.05，*P0.01；与空白组比较：P0.05。1350第 53 卷分析与检测日 用 化 学 工 业（中英文）2.4 止血时间和止血降低率止血实验中归芩牙膏能显著降低出血时间，具有良好止血作用。与空白组比较，阳性对照组和归芩牙膏组出血时间显著降低（P0.01）。与牙膏基质组比较，阳性对照组和归芩牙膏组出血时间显著降低（P0.01）。结果见表10。表10 各 组小鼠肝脏创面出血模型止血时间和降低率（xs,n=8）Tab.10 He mostasis time and reduction rate in liver wound bleeding models of mice in each group（xs,n=8）组别剂量止血时间/s止血降低率/%空白组0.1 mL NS72.849.23阳性对照组0.1 mL33.796.88*53.61牙膏基质组0.1 mL66.275.77 9.02归芩牙膏组0.1 mL23.373.21*67.92注：与空白组比较：*P0.01；与牙膏基质组比较：P0.01。3 结论建立了高效液相色谱法测定归芩牙膏中阿魏酸、黄芩苷的含量，采用梯度洗脱能够显著分离两种成分，峰型完好、分离度高。对两种成分的平均加样回收率在98.95%99.87%之间，相对标准偏差（RSD）均3%。该方法快速、准确，可用于归芩牙膏的质量控制。药效学实验表明归芩牙膏能有效降低炎症肿胀度，降低致炎小鼠耳廓组织中炎症因子TNF-、IL-1、IL-6的含量，提高痛阈值并缩短止血时间，说明归芩牙膏具有较显著的抗炎、镇痛及止血作用。研究通过对归芩牙膏有效成分含量测定及抗炎镇痛药效学研究，为后期中草药牙膏开发及临床应用提供了实验依据。参考文献:1 National Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the peoples republic of China Part I M.Beijing:China 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