qPCR流程图.doc

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一、Total RNA的提取：
1. 取出样本，放入灭过菌的研钵中，倒入液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，15min左右，研磨充分后加入1.5ml的EP管，加入1ml Trizol，充分匀浆。（另一种，加入trizol会冻起来，就一直研磨，直到最后化成液体。）
2. 室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中
3. 加入1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移至新管；
4. 加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min
5. 弃上清，留沉淀，加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。重复三次
6. 弃上清留沉淀，自然风干（5~10min），加入32ul DEPC处理过的水，测OD260/280的值，根据结果调整至1μg/μl=1000ng/μl，立即进行反转录，剩余的RNA标好号存放在-80℃下。
附：1OD260=40μg/ml
用样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。（可无）
可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边一条不太明显的5SRNA的条带。证明RNA完整无降解。
二、反转录：
说明书：10 μl 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNA。20/1μg（以前用的40，下次用20）
20ul的体系：先把buffer和RNase Free dH20和enzyme 配成mix
5×PrimeScript Buffer（ for Real Time）：4μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I ：1μl
Oligo dT Primer（ 50 μM）：1μl
Random 6 mers（ 100 μM）：1μl
总RNA ：1μl(1μg/μl)
RNase Free dH2O ：12μl
反转录反应条件如下:
37℃ 15 min （反转录反应）
85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）
4℃
-20℃分装保存（尽量不要反复冻融，avoid freeze-thaw cycles）
三、内参检测 β-actin 50µl体系
试剂
使用量
10*taq buffer
5µl
dNTP
4µl
Primer-F（100µM）
0.5µl
Primer-R（100µM）
0.5µl
Taq E
0.25µl
模板<500 ng
1µl
灭菌蒸馏水
加至50µl

PCR 反应条件:
扩增 1 kb 的 DNA 片段的 PCR 反应条件如下：
预变性：95℃，3min
98℃ 10 sec.
55℃ 30 sec.（下次60℃，去掉非特异性）
72℃ 30 s（对于80bp的内参来说是不是可以省去）
72℃ 5min.
4℃保存
电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。
四、定量PCR

电泳检测，条件同上。增大至50个循环。
五、分析数据
引物
AT1F: GCCCTTCGGCAATCACCTAT
AT1R: TGAGACACGTGAGCAGGAAC

AT2F: CCTGGCAAGCATCTTATGTAGTTC
AT2R: CCGGAAATAAAATGTTGGCAAT
ACTIN FGCAGATGTGGATCAGCAAGC
R GGCGGACTGTTACTGAGCT

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