DB37∕T 3880—2020 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程(山东省).pdf

ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 38802020 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程 Diagnostic techniques for Riemerella Anatipestifer infection 2020-03-16 发布 2020-04-16 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 38802020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所、山东省动物疫病预防与控制中心、威海市畜牧业发展中心、临沂市畜牧发展促进中心。 本标准主要起草人：黄兵、李玉峰、马秀丽、于可响、宋敏训、赵国清、秦卓明、刘存霞、林树乾、陈静、谭善杰、郭效珍、赵巧雅。 DB37/T 38802020 1 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鸭疫里默氏杆菌病的临床诊断、细菌分离、病原核酸检测和综合判定的技术要求。 本标准适用于鸭疫里默氏杆菌病的诊断与检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 临床诊断 3.1 流行病学 该病一年四季均可发生，鸭、鹅、野生水禽和火鸡均可发病，1周龄8周龄鸭高度敏感，5周龄以下死亡较快，较大的鸭可能存活时间较长，该病在种鸭中少见。 3.2 临床症状 3.2.1 最急性型 很少出现明显症状即突然死亡。 3.2.2 急性型 常见于2周龄3周龄的雏鸭，病程1日3日。患鸭精神沉郁、嗜睡、厌食、离群、不愿走动或行动迟缓，眼鼻分泌物增多，患鸭呼吸困难、缩颈或以喙抵地，濒死期出现神经症状呈角弓反张、抽搐等。 3.2.3 慢性型 常见于4周龄7周龄鸭， 病程可达一周以上。 主要表现为精神沉郁、 厌食、 腿软弱无力、 不愿走动、伏卧或呈犬坐姿势，共济失调、痉挛性点头或头左右摇摆，难以维持躯体平衡，部分病例头颈歪斜，当遇到惊扰时呈转圈运动或倒退，部分患鸭跛行。感染后存活的鸭往往生长迟缓。 3.3 病理变化 特征性病变为病死鸭浆膜出现广泛性的纤维素性渗出，包括心包炎、气囊炎和肝周炎。慢性病例可见脑炎。 DB37/T 38802020 2 3.4 判定标准 若发病鸭符合3.1流行病学特征、 3.2临床症状和3.3病理变化， 可判为鸭疫里默氏杆菌病疑似病例，应进行细菌分离和核酸检测确诊。 4 实验室诊断 除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682二级水的规定；实验室生物安全要求按照GB 19489执行。 4.1 细菌分离 4.1.1 仪器和设备 4.1.1.1 生物安全柜。 4.1.1.2 CO2培养箱。 4.1.1.3 显微镜。 4.1.2 试剂或材料 4.1.2.1 血清琼脂平板（见附录 A.1）。 4.1.2.2 麦康凯琼脂平板（见附录 A.2）。 4.1.2.3 革兰氏染色液。 4.1.2.4 瑞氏染色液。 4.1.3 操作步骤 4.1.3.1 取样 按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的肝脏或脑（有典型纤维素性渗出时采集肝脏，有神经症状时采集脑）。 4.1.3.2 分离培养 将接种环伸入组织内部，然后划线接种于血清琼脂平板和麦康凯琼脂平板，平板的配制根据根据GB 4789.28的规定进行操作，含5%10% CO2 的37 培养箱或烛缸中培养24 h48 h。挑取符合4.1.3.3描述的典型菌落，划线接种于血清琼脂平板进行纯化培养。 4.1.3.3 菌落形态 在血清琼脂平板培养基上见有湿润、 呈露滴样、 圆形隆起、 表面光滑、 边缘整齐的菌落， 直径为1 mm2 mm， 颜色为灰白色； 而麦康凯琼脂平板上无菌落生长。 挑选单个典型菌落进行革兰氏染色和瑞氏染色，并镜检。革兰氏阴性，为无鞭毛、不运动、不形成芽胞的小杆菌。单个、成双或呈短链状排列，菌体形态除杆状外，部分呈椭圆形，偶见呈长丝状。细菌大小宽为0.2 m0.5 m，长为1 m5 m，呈丝状的菌体可长达11 m24 m。瑞氏染色可见大多数菌体呈两极着染。 4.1.4 结果判定 分离的细菌如同时符合4.1.3.3和4.1.3.4，可判定为疑似鸭疫里默氏杆菌。 DB37/T 38802020 3 4.2 病原核酸检测 4.2.1 PCR 方法 4.2.1.1 仪器和设备 4.2.1.1.1 高速冷冻离心机。 4.2.1.1.2 PCR 扩增仪。 4.2.1.1.3 电泳仪。 4.2.1.1.4 紫外分析仪。 4.2.1.1.5 微量加样器：0.5 L10 L；2 L20 L；20 L200 L；100 L1 000 L。 4.2.1.2 试剂或材料 4.2.1.2.1 阴性质控。 4.2.1.2.2 阳性质控（灭活细菌培养物）。 4.2.1.2.3 蛋白酶 K。 4.2.1.2.4 PBS（附录 B.1）。 4.2.1.2.5 TE（附录 B.2）。 4.2.1.2.6 SDS（附录 B.3）。 4.2.1.2.7 琼脂糖凝胶（附录 B.4）。 4.2.1.2.8 TAE 电泳液（附录 B.5）。 4.2.1.3 样品处理及核酸提取 4.2.1.3.1 组织样品 无菌取疑似鸭疫里默氏杆菌病的肝脏、脾脏等脏器组织1.0 g5.0 g，按10%（g/mL）加入PBS，研磨匀浆。-20 保存备用。取100 L组织匀浆液加入400 L TE中充分混匀，再加终浓度为1%的SDS和100 g/mL的蛋白酶K，置56 水浴消化2 h，冷至室温后用酚及氯仿各抽提两次，无水乙醇沉淀，75%乙醇洗涤，最后用40 L DEPC水溶解DNA，作为PCR模板，或保存于-20 。或者用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。 4.2.1.3.2 菌落样品 挑取4.1.3.2可疑菌落，加到含20 L灭菌去离子水的PCR离心管中，压紧管盖，煮沸10 min，再冰浴10 min后离心取上清作为PCR模板样品。或者用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。 4.2.1.4 引物 根据GenBank中发表的鸭疫里黙氏杆菌16s RNA基因序列设计引物，扩增片段大小为475 bp。上游引物RA-001F:5-TTA GAT AGT TGG TGA GGT AA-3。下游引物RA-002R:5-ATC GGT GTT CTG AGT AAT-3。 4.2.1.5 PCR 扩增 4.2.1.5.1 反应体系 反应体系为25 L，配制见表1。 DB37/T 38802020 4 表1 PCR 反应体系配制 PCR 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量/L 10PCR buffer 2.5 2.5 mmol/L dNTP 2.0 10 mol/L 引物 F 0.5 10 mol/L 引物 R 0.5 5 U/ L Taq E 0.5 模板 1.0 无 RNA 酶去离子水 18.0 总体积 25.0 4.2.1.5.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：95 5 min； 第二阶段：95 30 s，56 30 s，72 40 s，共进行 30 个循环； 第三阶段：72 10 min。 PCR扩增也可使用商品化的PCR试剂盒，按说明书要求操作。 4.2.1.5.3 电泳 反应结束后取10.0 L PCR产物与1.0 L 10上样缓冲液混合，加到1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时设DNA分子量标准参照，以5 V/cm电压进行电泳20 min40 min，在凝胶成像仪上观察结果。 4.2.1.6 结果判定 4.2.1.6.1 试验成立的条件 在阳性质控出现一条大小475 bp的单一条带，同时阴性质控无此条带的情况下，检测结果成立。 4.2.1.6.2 结果的判定 被检样品出现与阳性质控同样大小的条带时， 判为阳性； 被检样品未出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阴性。如果阴、阳性质控结果不成立，则全部样品应该重做。参见附录C。 4.2.2 实时荧光定量 PCR 方法 4.2.2.1 仪器和设备 4.2.2.1.1 实时荧光定量 PCR 检测仪。 4.2.2.1.2 台式高速冷冻离心机。 4.2.2.1.3 涡旋振荡器。 4.2.2.1.4 可调移液器：0.5 L10 L；2 L20 L；20 L200 L；100 L1 000 L。 4.2.2.1.5 无 RNA 酶的荧光定量 PCR 管。 4.2.2.2 试剂或材料 4.2.2.2.1 阴性质控。 DB37/T 38802020 5 4.2.2.2.2 阳性质控（灭活细菌培养物）。 4.2.2.2.3 蛋白酶 K。 4.2.2.2.4 SDS。 4.2.2.2.5 实时荧光定量 PCR 试剂盒。 4.2.2.3 样品处理及核酸提取 4.2.2.3.1 组织样品 参见4.2.1.3.1。 4.2.2.3.2 菌落样品 参见4.2.1.3.2。 4.2.2.4 引物 根据GenBank中发表的鸭疫里黙氏杆菌16s RNA基因序列设计引物，扩增片段大小为190 bp。上游引物RA-003F:5-GCT GGA ATG AGT AGT GTA G-3。下游引物RA-004R:5-GCT TAG TCT CTG AAC CAT ATA G-3。 4.2.2.5 荧光定量 PCR 4.2.2.5.1 反应体系 采用20 L反应体系，组成见表2。 表2 荧光 PCR 反应体系配制 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量/L 2SYBR Premix 10.0 10 mol/L 引物 P3 1.0 10 mol/L 引物 P4 1.0 模板 2.0 无 RNA 酶去离子水 6.0 总体积 20.0 4.2.2.5.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段：95 2 min； 第二阶段：95 20 s，57 1 min，共进行 40 个循环，57 时收集荧光。 反应结束后根据分析软件得出的Ct值和扩增曲线来判定结果。 4.2.2.5.3 结果判定 4.2.2.5.3.1 试验成立的条件 阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整， 以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。阴性质控的检测结果应无特异性扩增；阳性质控的Ct值应28.0，则试验成立。 4.2.2.5.3.2 结果的判定 DB37/T 38802020 6 当被检样品Ct值30且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无Ct值或者Ct值35时，判为阴性；当被检样品在30Ct值35时判为可疑，需重做，再次检测结果的Ct值35，且出现典型扩增曲线，则可判为阳性，否则判为阴性。结果判定见附录E。 5 综合判定 符合3.4临床诊断规定的疑似病例经4.2.1和4.2.2中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定为鸭疫里默氏杆菌病。 DB37/T 38802020 7 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 PBS（0.01 mol/L，pH 7.2） 氯化钠 8.00 g 氯化钾 0.2 mL 磷酸二氢钾 0.2 mL 磷酸氢二钠 2.89 g 硫柳汞 0.1 g 去离子水 加至 1000 mL 100 kPa 15 min灭菌，置4 冰箱保存备用。 A.2 10 TE 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 12.11 g 乙二胺四乙酸二钠 3.72 g 水 800 mL HCl 调 PH 至 8.0 水 加至 1000 mL 100 kPa 15 min灭菌后备用。 A.3 20% SDS 十二烷基硫酸钠 20 g 水 80 mL HCl 调 PH 至 7.2 水 加至 100 mL A.4 1.0% 琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g 1TAE 电泳缓冲液 加至 100 mL 加热完全融化，待冷至50 60 时，加Goodview溶液5 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。 A.5 50TAE 缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242.0 g DB37/T 38802020 8 冰乙酸 57.1 mL 0.5mol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液（PH 8.0） 27.5 mL 灭菌去离子水 加至 1000 mL 2 8 保存。 DB37/T 38802020 9 B B 附 录 B （规范性附录） 培养基的配制 B.1 血清培养基琼脂 牛肉膏 0.5 g 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 0.5 g 琼脂粉 1.0 g 去离子水加至100 mL，100 kPa 20 min灭菌，待冷却到50 60 时加入5 mL无菌鸡血清。置4 冰箱保存备用。 B.2 麦康凯培养基 麦康凯粉末 50 g 琼脂粉 10 g 去离子水加至1000 mL，100 kPa 15 min灭菌，置2 8 冰箱保存备用。 DB37/T 38802020 10 C C 附 录 C （资料性附录） PCR 结果电泳图 说明： 1阳性质控； 2阴性质控； 3空白对照； MDL2000 DNA分子量标准。 图C.1 PCR 结果电泳图 DB37/T 38802020 11 D D 附 录 D （规范性附录） 荧光定量 PCR 扩增示意图 说明： 1阳性质控； 2阴性质控； 3空白对照。 图D.1 荧光定量 PCR 扩增示意图 _