蛋白质的结构与功能的关系.pptx

一、蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系 前体与活性蛋白质前体与活性蛋白质 分子病分子病蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系 肌红蛋白的结构与功能肌红蛋白的结构与功能 血红蛋白的结构与功能血红蛋白的结构与功能(一一)蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系1.一级结构一级结构是空间构象的基础是空间构象的基础 在在生生物物体体内内，蛋蛋白白质质的的多多肽肽链链一一旦旦被被合合成成后后，即即可可根根据据 一一级级结结构构 的的特特点点自自然然折折叠叠和和盘盘曲曲，形形成成一一定定的的空空间间构构象象，特特定定的的空空间间构构象象主主要要是是由由蛋蛋白白质质分分子子中中多多肽肽链链和和侧侧链链 R R基基团团形形成成的的次次级级键键来来维维持持的的。蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构决决定定了了它它的的二二级级、三三级级结结构构，即即由由一一 级级 结结 构构 可可 以以 自自 动动 地地 发发 展展 到到 二二、三三 级级 结结 构构。、ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY一一级级结结构构二级结构二级结构蛋白质的结构基础蛋白质的结构基础三三 级级 结结 构构四四 级级 结结 构构一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础 牛核糖核酸酶的结牛核糖核酸酶的结构构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶核糖核酸酶核糖核酸酶A变性，酶的三级结变性，酶的三级结构和活性完全丧失，生成含有构和活性完全丧失，生成含有8个巯基的多肽链。个巯基的多肽链。加脲和加脲和巯基乙醇巯基乙醇去除脲和巯基乙醇，去除脲和巯基乙醇，又恢复到天然状态又恢复到天然状态核糖核酸酶核糖核酸酶A变性和复性变性和复性胰岛素（胰岛素（Insulin）首先合成）首先合成108个氨基酸的个氨基酸的前胰岛前胰岛素原素原（pre-proinsulin），），随即切去随即切去N-端的端的24个氨基酸个氨基酸信号肽，形成信号肽，形成84个氨基酸的个氨基酸的胰岛素原胰岛素原（proinsulin），），形成正确的二硫键，形成正确的二硫键，在包装分泌时，在包装分泌时，A、B链之间的链之间的33个氨基酸个氨基酸C肽肽残基被切除，才形成残基被切除，才形成胰岛素。胰岛素。人工合成人工合成的胰岛素，的胰岛素，A、B链分别合成后，等比例混合后就有活链分别合成后，等比例混合后就有活性。性。2.前体前体与与活性蛋白质活性蛋白质一级结构的关系一级结构的关系胰岛素的体内合成胰岛素的体内合成胰岛素基因胰岛素基因mRNA核糖体核糖体SSSSSSB chainSSSSSSA chain胰岛素原胰岛素原 9kDa胰岛素胰岛素 5.5 5.5kDakDaC 肽肽GOLGI分泌颗粒分泌颗粒 血血 液液Zn2+MICROCRYSTALS切割位点切割位点A肽肽B肽肽30 aa33 aa21 aa前胰岛素原前胰岛素原 11.5 kDaRER600600核苷酸核苷酸C肽肽24 aa信号肽信号肽3.蛋白质一级结构的蛋白质一级结构的种属差异种属差异与与分子进化分子进化 对于对于不同种属来源不同种属来源的的同种蛋白质同种蛋白质进行一级结构测定和比较，进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异，这种差异可能是分子进化的结果，但发现存在种属差异，这种差异可能是分子进化的结果，但与与功能相关的结构总是有高度的保守性功能相关的结构总是有高度的保守性。以细胞色素以细胞色素C C为例为例：细胞色素：细胞色素C C广泛存在于真核生物细胞的广泛存在于真核生物细胞的线粒体中，是一种含有血红素辅基的单链蛋白质。在生物氧线粒体中，是一种含有血红素辅基的单链蛋白质。在生物氧化时，细胞色素化时，细胞色素C C在呼吸链的电子传递系统中起传递电子的作在呼吸链的电子传递系统中起传递电子的作用，使血红素上铁原子的价数发生变化。用，使血红素上铁原子的价数发生变化。细胞色素细胞色素c c的一级结构与生物进化的关系的一级结构与生物进化的关系n脊椎动物的细胞色素脊椎动物的细胞色素C C由由l04l04个氨基酸残基组成；昆虫有个氨基酸残基组成；昆虫有108108个个氨基酸残基组成；植物则有氨基酸残基组成；植物则有112112个氨基酸残基组成。个氨基酸残基组成。n对不同生物的细胞色素对不同生物的细胞色素C C的一级结构分析表明，大约有的一级结构分析表明，大约有2828个氨个氨基酸残基是各种生物共有的，表明这些氨基酸残基是规定细基酸残基是各种生物共有的，表明这些氨基酸残基是规定细胞色素胞色素C C的生物功能所必需的。其中包括的生物功能所必需的。其中包括第第1414和和1717位上两个半位上两个半胱氨酸残基胱氨酸残基是细胞色素是细胞色素C C与辅基血红素共价相连的位置；与辅基血红素共价相连的位置；第第70-8070-80位上成串的不变氨基酸残基位上成串的不变氨基酸残基可能是细胞色素可能是细胞色素C C与酶结合与酶结合的部位。的部位。在分子进化过程中，细胞色素在分子进化过程中，细胞色素C C分子中保持氨基酸残分子中保持氨基酸残基不变的区域称为基不变的区域称为保守部位保守部位。保守部位的氨基酸都保守部位的氨基酸都是细胞色素是细胞色素C C完成其生物学功能所必需的完成其生物学功能所必需的。同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质同源蛋白质：在生物体中行使相同或相似功能在生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。的蛋白质。不变残基不变残基 可变残基可变残基来自两个物种的同源蛋白质，其序列之间的氨来自两个物种的同源蛋白质，其序列之间的氨基酸差异数目与这些物种间的系统差异成比例。基酸差异数目与这些物种间的系统差异成比例。即在进化位置上相差愈远，其氨基酸序列差别即在进化位置上相差愈远，其氨基酸序列差别愈大。愈大。4.蛋白质的一级结构与蛋白质的一级结构与分子病分子病 几乎所有遗传病都与蛋白质几乎所有遗传病都与蛋白质分子结构改变分子结构改变有关，称之为有关，称之为分子病分子病。在蛋白质的一级结构中，参与在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基功能活性部位的残基或或处于特定构处于特定构象关键部位的残基象关键部位的残基，即使在整个分子中发生，即使在整个分子中发生一个残基的异常一个残基的异常，那，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响，导致疾病的发生。么该蛋白质的功能也会受到明显的影响，导致疾病的发生。这种这种变异来源于基因上遗传信息的突变，所以是可变异来源于基因上遗传信息的突变，所以是可遗传遗传的的。与血红蛋白相与血红蛋白相与血红蛋白相与血红蛋白相关的分子病关的分子病关的分子病关的分子病镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病-血红蛋白血红蛋白 或或 链突变链突变地中海贫血地中海贫血-血红蛋白血红蛋白 或或 链缺失链缺失 被称之为被称之为“分子病分子病”的的镰刀状细胞贫血镰刀状细胞贫血仅仅是血红蛋白仅仅是血红蛋白（HbHb）亚基亚基574574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即N N端的第端的第6 6位的谷氨酸被缬氨酸取代，发生了变异所造成的。突变导致本位的谷氨酸被缬氨酸取代，发生了变异所造成的。突变导致本是可溶性的血红蛋白聚集成丝，相互粘着，导致红细胞变形而是可溶性的血红蛋白聚集成丝，相互粘着，导致红细胞变形而成镰刀状，极易破碎导致贫血。成镰刀状，极易破碎导致贫血。镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病血红蛋白分子病血红蛋白分子病地中海贫血地中海贫血产生原因：产生原因：v 缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因；缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因；v 一个或多个基因无义突变缩短的蛋白链；发生移码突一个或多个基因无义突变缩短的蛋白链；发生移码突变不能合成正确的多肽链；变不能合成正确的多肽链；v 编码区外突变转录阻断或编码区外突变转录阻断或mRNA不能正确加工。不能正确加工。类型：类型：-地中海贫血地中海贫血-地中海贫血地中海贫血(二二)蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质多种多样的蛋白质多种多样的功能功能与各种蛋白质特定的与各种蛋白质特定的空间构象空间构象密切密切相关，蛋白质的相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。活性即能恢复。在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应别构效应(allostery)allostery)。蛋白蛋白质质(或酶或酶)的别构效应，在生物体内普遍存在，这对物质代谢的的别构效应，在生物体内普遍存在，这对物质代谢的调节和某些生理功能的变化都是十分重要的。调节和某些生理功能的变化都是十分重要的。1、肌红蛋白、肌红蛋白MyoglobinMyoglobin（MbMb）结构与功能结构与功能肌红蛋白：主要肌红蛋白：主要肌细胞肌细胞贮存和贮存和分配氧分配氧的蛋白质。肌红蛋白是的蛋白质。肌红蛋白是由一由一条多肽链条多肽链和和一个辅基血红一个辅基血红素（原卟啉素（原卟啉IX 和和Fe的络合物）的络合物）组成，除去血红素的脱辅基肌组成，除去血红素的脱辅基肌红蛋白称珠蛋白（红蛋白称珠蛋白（globin），），它和血红蛋白的亚基在氨基酸它和血红蛋白的亚基在氨基酸序列上有明显的同源性，构象序列上有明显的同源性，构象和功能也相似，由和功能也相似，由8个个-螺旋组螺旋组成。成。氧气与肌红蛋白的结合氧气与肌红蛋白的结合nO2与与CO竞争结合血红蛋白和肌红蛋白；竞争结合血红蛋白和肌红蛋白；n空气中空气中CO的含量达到的含量达到0.06-0.08%即有中毒即有中毒的危险，达到的危险，达到0.1%时则能窒息死亡；时则能窒息死亡；nO2的结合改变肌红蛋白的构象，但对肌红的结合改变肌红蛋白的构象，但对肌红蛋白的功能影响不大。蛋白的功能影响不大。构型（构型（configurationconfiguration）：）：分分L L、D D型，改变时有共价型，改变时有共价键的断裂。键的断裂。构象（构象（conformationconformation）：）：改变无须有共价键的断裂，改变无须有共价键的断裂，只是次级键断裂。只是次级键断裂。2、血红蛋白、血红蛋白(hemoglobin,Hb)结构结构与功能与功能 4 4个亚基个亚基组成，组成，两两相同，每个亚两两相同，每个亚基都有一个血红素基都有一个血红素基和一个氧结合部基和一个氧结合部位。位。Hb Hb分子分子近似球形近似球形，4 4个亚基占据相当个亚基占据相当于四面体的四个顶于四面体的四个顶角。角。辅基血红素（辅基血红素（heme）n氧与蛋白不能直接结合；氧与蛋白不能直接结合；n借助过渡金属的低氧态（借助过渡金属的低氧态（Fe2）和有机分子原卟啉）和有机分子原卟啉IX；n卟啉化合物着色力强，血红蛋白的铁卟啉使血液呈卟啉化合物着色力强，血红蛋白的铁卟啉使血液呈红色；红色；n原卟啉原卟啉IX和和Fe的络合物成为血红素（的络合物成为血红素（heme）。）。O2 血血红红素素与与氧氧结结合合后后，铁铁原原子子半半径径变变小小，就就能能进进入入卟卟啉啉环环的的小小孔孔中中，继继而而引引起起肽肽链链位位置置的的变变动。动。卟啉平面卟啉平面卟啉平面卟啉平面FeFenHbHb与与MbMb一一样样能能可可逆逆地地与与O O2 2结结合合，HbHb与与O O2 2结结合合后后称称为为氧氧合合HbHb。氧氧合合HbHb占占总总HbHb的的百百分分数数（称称百百分分饱饱和和度度）随随O O2 2浓浓度度变变化化而而改改变。变。n血血红红蛋蛋白白存存在在两两种种主主要要构构象象态态：T T态态（tense tense statestate）和和R R态态（relaxed relaxed statestate），T T态态和和R R态态之之间间能能互互换换，而而且且均均能能结结合合氧，但氧，但R R态的结合能力要强。态的结合能力要强。n作作为为T T态态的的去去氧氧血血红红蛋蛋白白有有专专一一性性的的氢氢键键和和盐盐桥桥起起着着稳稳定定作作用，用，4 4个亚基的个亚基的C C末端处于受束缚的状态。末端处于受束缚的状态。n血红蛋白除运输氧外，还运输血红蛋白除运输氧外，还运输H和和CO2。血红蛋白的构象变化与结合氧血红蛋白的构象变化与结合氧 肌红蛋白与血红蛋白结构和功能的比较肌红蛋白与血红蛋白结构和功能的比较结构 共同点 差异：肌红蛋白只有三级结构，具有一条多肽链，血红蛋白具有四 级结构，含有四个亚基功能共同点：均可与氧可逆结合差异：肌红蛋白只能贮备氧，而血红蛋白可以运输氧，此外也可运输H+和CO2球状蛋白质球状蛋白质肌红蛋白的一级结构与血红蛋白的肌红蛋白的一级结构与血红蛋白的 亚基或亚基或 亚基极为相似亚基极为相似肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白氧血红蛋白氧合曲线为合曲线为S形形肌红蛋白肌红蛋白氧合曲线为氧合曲线为双双曲线形曲线形Hb THb T态和态和R R态互变态互变HbHb氧合与脱氧构象转换示意氧合与脱氧构象转换示意Hb与与O2的结合或解离曲线呈的结合或解离曲线呈S型与型与Hb的的变构效应有关。变构效应有关。n Hb与与O2结合盐键断裂，结合盐键断裂，R型型n Hb与与O2解离盐键形成，解离盐键形成，T型型n T型对型对O2亲和力小。亲和力小。n R型对型对O2亲和力大。亲和力大。协同效应协同效应(cooperativity)(cooperativity)u一个一个寡聚体蛋白质寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效协同效应应。如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应(positive cooperativity)(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应(negative cooperativity)(negative cooperativity)u血红蛋白的氧合具有血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应正协同性同促效应，也即一个，也即一个O2的结的结合增加同一合增加同一Hb分子中其余空的氧结合部位对分子中其余空的氧结合部位对O2的亲和力。的亲和力。变构效应变构效应(allostericeffect)蛋蛋白白质质空空间间结结构构的的改改变变伴伴随随其其功功能能的的变变化化，称称为为变构效应变构效应。HbHb与与O O2 2结结合合后后，HbHb的的构构象象发发生生变变化化，这这类类变变化化称称为为变变构构效效应应，即即通通过过构构象象变变化化影影响响蛋蛋白白质质的的功功能能，HbHb称为称为变构蛋白变构蛋白（allosteric proteinallosteric protein）。）。(R)relaxed state(T)tense state血液中血液中O2的的运输运输 (Hb R/T(Hb R/T态的互换态的互换)Lung氧氧分分子子HemoglobinHemoglobinMyoglobinMyoglobinMuscle静脉静脉动脉动脉环境氧浓度高时环境氧浓度高时Hb快速吸收氧分子快速吸收氧分子环境氧浓度低时环境氧浓度低时Hb迅速释放氧气迅速释放氧气任何一个亚基接受任何一个亚基接受O O2 2后，会增加其他亚基吸收后，会增加其他亚基吸收O O2 2的能力的能力释放氧气后释放氧气后Hb变回变回Tstate2,3BPG的作用的作用2,3BPG是血红蛋白的是血红蛋白的别构效应剂别构效应剂，一分子血红蛋白只有一分子，一分子血红蛋白只有一分子2,3BPG，位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。，位于由四个亚基缔合形成的中央孔穴内。2,3BPG将将两个链交联在一起，有助于去氧血红蛋白的构象，促进氧的释放两个链交联在一起，有助于去氧血红蛋白的构象，促进氧的释放。q2,3-二磷酸二磷酸-D-甘油酸（甘油酸（2,3BPG）是红细）是红细胞内血红蛋白的别构效应剂。胞内血红蛋白的别构效应剂。q2,3BPG的存在，可使氧与全血中成熟的存在，可使氧与全血中成熟的血红蛋白结合的的血红蛋白结合的P50大约提高到大约提高到26torr。q换言之，红细胞中的换言之，红细胞中的2,3BPG实质上是实质上是降低了脱氧血红蛋白对氧的亲和性。降低了脱氧血红蛋白对氧的亲和性。q在红细胞中，在红细胞中，2,3BPG与血红蛋白的浓度与血红蛋白的浓度几乎是等摩尔的。几乎是等摩尔的。肺中肺中pO2（海平面）（海平面）肺中肺中pO2(高原高原4500米米)组织中组织中pO2氧氧饱饱和和度度2,3-二磷酸二磷酸-D-甘油酸甘油酸（2,3BPG）对血红蛋）对血红蛋白氧合曲线的影响白氧合曲线的影响当人从海平面上当人从海平面上到到4500米高原后两天米高原后两天内，内，2,3BPG的浓度的浓度有原来的有原来的5mM增加到增加到8mM，结果对组织的，结果对组织的供氧量又恢复到接近供氧量又恢复到接近正常水平（正常水平（0.38）。）。如果如果BPG仍维持仍维持5mM水平，对组织的水平，对组织的供氧量将减少四分之供氧量将减少四分之一，为一，为0.30。波耳效应波耳效应（Bohreffect）pH对氧饱和曲线的对氧饱和曲线的影响影响 氧氧结结合合血血红红蛋蛋白白的的另另外外调调节节作作用用涉涉及及到到二二氧氧化化碳碳和和质质子子，二二者者都都是是有有氧氧代代谢谢的的产产物物。CO2能能降降低低血血红红蛋蛋白白对对氧氧的的亲亲和和性性。在在红红细细胞胞内内碳碳酸酸酐酐酶酶催催化化CO2生生成成一一个个碳碳酸酸（H2CO3），碳碳酸酸容容易易解解离离形形成碳酸氢根离子和一个质子：成碳酸氢根离子和一个质子：CO2H2OHHCO3结结果果使使得得细细胞胞内内的的pH降降低低。低低pH导导致致血血红红蛋蛋白白中中的的几几个个基基团团的的质质子化，子化，质子化的基团可以形成有助于脱氧构象稳定的离子对质子化的基团可以形成有助于脱氧构象稳定的离子对。CO2浓浓度度增增加加以以及及相相应应的的pH降降低低使使得得血血红红蛋蛋白白的的P50升升高高，这这一一现现象象称称之之波波耳耳效效应应（Bohreffect），它它提提高高了了氧氧转转运运系系统统的的效效率率。在在肺肺部部，CO2水水平平低低，氧氧很很容容易易被被血血红红蛋蛋白白占占有有，同同时时释释放放出出质质子子；而而在在代代谢谢的的组组织织中中，CO2水水平平相相对对来来说说比比较较高高，pH较较低低，O2容容易易从从氧合血红蛋白中卸载。氧合血红蛋白中卸载。3 3、蛋白质构象改变与疾病、蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋白白质质构构象象疾疾病病：若若蛋蛋白白质质的的折折叠叠发发生生错错误误，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，但但蛋蛋白白质质的的构构象象发发生生改改变变，仍仍可可影影响响其其功功能能，严严重重时时可可导导致疾病发生。致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的引起的一组人和动物神经退行性病变。一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折折叠的叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病 一条肽链对应一个一条肽链对应一个特定的空间结构。特定的空间结构。这条法则的破坏是这条法则的破坏是灾难性的。疯牛病的灾难性的。疯牛病的prion就是一个例子就是一个例子。正常正常prion异常异常prion蛋白质构象改变与疾病老年性痴呆老年性痴呆（AD,Alzheimeis disease）老年性痴呆老年性痴呆:即阿尔茨海默病，是一种大即阿尔茨海默病，是一种大脑细胞退化萎缩，细胞密度降低的器质性脑细胞退化萎缩，细胞密度降低的器质性疾病。疾病。主要症状：主要症状：部分或者全部的丧失记忆能部分或者全部的丧失记忆能力和认识能力。力和认识能力。同样是蛋白质构象变化引起的疾病，与淀同样是蛋白质构象变化引起的疾病，与淀粉样纤维沉积有关。现在已知，这种纤维粉样纤维沉积有关。现在已知，这种纤维的形成是由于一种特征性交联的的形成是由于一种特征性交联的-Sheet-Sheet结构的有序排列，且结构的有序排列，且-Sheet-Sheet结构的每一结构的每一条链与纤维的长轴垂直。条链与纤维的长轴垂直。根据分子外形的对称程度分根据分子外形的对称程度分l球状蛋白（球状蛋白（globularprotein）：亲水基团位于分子表面，：亲水基团位于分子表面，疏水基团位于分子内部，形状接近球形或椭球形，易溶于疏水基团位于分子内部，形状接近球形或椭球形，易溶于水，如血清球蛋白和肌球蛋白等。水，如血清球蛋白和肌球蛋白等。l纤维状蛋白纤维状蛋白（fibrousprotein）：具有比较简单、有规则：具有比较简单、有规则的线性结构，呈细棒或纤维状，难溶于水和稀盐溶液，如的线性结构，呈细棒或纤维状，难溶于水和稀盐溶液，如胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和角蛋白等。胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白和角蛋白等。根据蛋白质的生物学功能分根据蛋白质的生物学功能分 酶、运输蛋白质、营养和贮存蛋白质、收缩蛋白质和结构酶、运输蛋白质、营养和贮存蛋白质、收缩蛋白质和结构蛋白质等。蛋白质等。一、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活总目标：增加制品纯度或比活1.1.前处理：因动前处理：因动/植物植物/细菌而异细菌而异2.2.粗分级分离：采用盐析粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀等电点沉淀/有有机溶剂分级分离等方法机溶剂分级分离等方法3.3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等层析、吸附层析以及亲和层析等4.4.结晶结晶二、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料透析透析透析透析支持膜的栅板加压蛋白质溶液半透膜超滤液超过滤超过滤超过滤超过滤2 2、密度梯度（区带）离心、密度梯度（区带）离心6000080000转/分重力60万80万倍3、凝胶过滤、凝胶过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法 1.1.等电点沉淀等电点沉淀 调整溶液调整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI处依次沉淀处依次沉淀 2.2.盐溶和盐析盐溶和盐析3.3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法w降低介电常数降低介电常数w争夺水化膜争夺水化膜原理：原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 0分子大小不同，电场中移动速度也不同分子大小不同，电场中移动速度也不同(三三三三)利用电荷差别纯化的方法利用电荷差别纯化的方法利用电荷差别纯化的方法利用电荷差别纯化的方法几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质，常用于蛋白质分子量的测定。分子量的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技是蛋白质组学研究的重要技术。术。十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基磺酸基极性亲水极性亲水烷基烷基亲油亲油（蛋白质疏水区）（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键等电聚焦电泳等电聚焦电泳等电聚焦等电聚焦等电聚焦等电聚焦双向电泳双向电泳双向电泳双向电泳双向电泳双向电泳离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析（四）利用蛋白质选择性吸附的性质（四）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰层析羟磷石灰层析疏水作用层析疏水作用层析（五）利用对配体的特异生物学（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒亲和色谱颗粒具有极强的专一性具有极强的专一性六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（一）测定蛋白质总量（一）测定蛋白质总量1、凯氏定氮法、凯氏定氮法2、双缩脲法、双缩脲法3、Folin-酚试剂法酚试剂法 4、BCA 法（法（4,4-二羧二羧-2,2-二喹啉二喹啉 bicinchoninic acid）5、Bradford法法 6、胶体金法、胶体金法7、紫外吸收法、紫外吸收法 物理性质物理性质物理性质物理性质化学性质化学性质化学性质化学性质（二）测定蛋白质混合物中某一特定（二）测定蛋白质混合物中某一特定 蛋白质的含量蛋白质的含量（三）鉴定蛋白质制品的纯度（三）鉴定蛋白质制品的纯度 1.电泳分析电泳分析 2.沉淀分析沉淀分析 3.扩散分析扩散分析 第七节第七节 蛋白质测序蛋白质测序（1）英国科学家英国科学家Sanger测序测序（20世纪世纪50年代）。年代）。（2）建立色谱技术和定量氨基酸分析技术建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（20世纪世纪50年代）。年代）。（3）Edman降解降解（20世纪世纪70年代出现）。年代出现）。仪仪器器自自动动化化：液液相相自自动动测测序序仪仪和和固固相相蛋蛋白白质质自自动动测测序序仪仪。进进入入20世世纪纪80年年代代，气气相相测测序序技技术术出出现现并并实实现现了了仪仪器器自自动动化化。灵灵敏敏度度显显著著提提高高，样样品品量量只只需需10pmol以以下下，一一次次连连续续测测定定的的顺顺序序甚甚至至可可超超过过80个个残残基基。样样品品处理远比固相方法简单和操作方便。处理远比固相方法简单和操作方便。（4）20世世纪纪70年年代代，华华裔裔学学者者张张瑞瑞耀耀提提出出的的有有色色Edman试试剂剂DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠使手工测序技术更加灵敏可靠。蛋白质测序的发展：蛋白质测序的发展：（5 5）对对2-2-D D胶胶上上的的点点进进行行测测序序：将将蛋蛋白白质质转转印印到到PVDFPVDF（聚聚偏偏二二氟氟乙乙烯烯）膜膜上上，然然后后将将膜膜片片放放入入测测序序仪仪的的反反应应室室中中进行进行EdmanEdman降解。降解。（6 6）毛毛细细管管电电泳泳技技术术（2020世世纪纪9090年年代代发发展展起起来来的的微微量量分分析析技技术术）的的采采用用，是是蛋蛋白白质质N N端端微微量量顺顺序序测测定定方方法法学学一一个个引引人人注注目目的的发发展展。其其灵灵敏敏度度比比HPLCHPLC高高两两个个数数量量级级。可可在在1010fmolfmol的的水水平平检检测测氨氨基基酸酸。微微型型测测序序仪仪与与毛毛细细管管电电泳泳联联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。（7）蛋蛋白白质质C端端测测序序：C端端测测序序的的重重要要性性：为为PCR扩扩增增出出某某一一蛋蛋白白的的完完整整基基因因提提供供合合成成C端端引引物物的的重重要要依依据据；以以及及为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。等。最最成成功功的的方方法法是是在在Schlack早早年年提提出出的的异异硫硫氰氰酸酸法法的的基基础上发展起来的。础上发展起来的。直直到到20世世纪纪90年年代代初初由由于于发发展展出出一一些些新新的的偶偶联联和和裂裂解解试试剂剂，配配合合用用HPLC对对乙乙酰酰内内硫硫脲脲氨氨基基酸酸（TH）的的鉴鉴定定，该该方方法法才才得得以以较较快快地地发发展展。目目前前已已有有自自动动化化C端端测测序序仪仪，能常规地进行能常规地进行6-8个残基的个残基的C端顺序测定。端顺序测定。（8）质谱法用于蛋白质顺序测定：质谱法用于蛋白质顺序测定：必必要要性性：DNA顺顺序序测测定定解解决决不不了了翻翻译译后后加加工工所所导导致致的的氨氨基基酸酸残残基基的的修修饰饰问问题题，Edman降降解解不不能能解解决决N端端封封闭闭肽肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。20世世纪纪80年年代代初初出出现现快快原原子子轰轰击击质质谱谱（FAB质质谱谱）能能准准确确确确定定的的分分子子量量达达到到数数千千。相相继继发发展展的的串串行行质质谱谱可可以以把把FAB得得到到的的分分子子、离离子子进进行行再再一一次次惰惰性性原原子子轰轰击击，使使肽肽链链在在不不同同部部位位断断裂裂从从而而得得到到一一组组片片段段的的质质谱谱信信息息，使使多多肽顺序测定得以实现。肽顺序测定得以实现。20世世纪纪80年年代代末末出出现现了了电电喷喷雾雾质质谱谱和和基基质质辅辅助助激激光光解解吸吸电电离离-飞行时间质谱飞行时间质谱。电电喷喷雾雾质质谱谱测测定定分分子子量量数数万万的的蛋蛋白白质质准准确确度度可可达达万万分分之之一一，主主要要优优点点是是可可与与HPLC仪仪实实现现液液质质联联用用，因因而而能能使使一一个个蛋蛋白白质质的的酶解产物在得到酶解产物在得到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。飞行时间质谱飞行时间质谱能对分子量达能对分子量达30万道尔顿的分子进行准确质谱分万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质用可成功地进行蛋白质C端与端与N端的顺序测定，该方法一个显端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用著的优点是用样品量极微样品量极微（1-2pmol），），且非常快速，每次质且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。谱分析只需数分钟。（9）质质谱谱技技术术不不能能完完全全取取代代Edman降降解解与与其其他他蛋蛋白白质质分分析析方法。方法。通常是联合运用这些技术。通常是联合运用这些技术。（10）蛋白质测序展望：蛋白质测序展望：N端测序仪在灵敏度上还需提高。端测序仪在灵敏度上还需提高。C端端测测序序技技术术需需要要更更新新型型的的偶偶联联试试剂剂和和更更有有效效的的裂裂解解方方法。法。质谱技术将有令人刮目相看的作为。质谱技术将有令人刮目相看的作为。一一些些新新的的分分析析技技术术很很可可能能进进入入蛋蛋白白质质序序列列分分析析领领域域，如多维核磁共振方法。如多维核磁共振方法。谢 谢！