蛋白质工程考试复习资料.doc

名解蛋白质工程：蛋白质工程是以蛋白质的结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。蛋白质超二级结构：相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合体称为超二级结构，或结构模体。结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。分子伴侣：是一类相互之间有关系的蛋白分子，能识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽并与多肽的一定部位相结合，帮助这些多肽转运、折叠或组装，但其本身并不参与最终产物的形成。定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤-突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。这种策略只针对特定蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，人们称之为第二遗传密码或折叠密码。蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程统称为蛋白质的化学修饰。基因突变的概念：基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化。蛋白质组学：蛋白质组学定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为(如疾病过程和药物效应)，以及基因表达调控的机制的学科。双向电泳：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。细菌表面展示技术：结合荧光激活细胞筛选仪或流式细胞筛选仪是非常有效的高通量筛选方法。此方法能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。因为，细菌表面有许多单一性状能显示保留在细胞表面的酶反应产物，因而展示在细菌表面的蛋白很容易通过荧光探针显示出来，荧光产物和细胞表面酶反应产物之间的物理连接是筛选蛋白质库的一个非常有价值的特性，同时也是定量检测单细胞酶催化活力的关键。这种技术是当前唯一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。噬菌体表面展示技术：噬菌体展示技术是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬产菌体表面的技术。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体的表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。蛋白质打靶技术：蛋白质打靶是一种研究蛋白质功能的新方法。由于其高度的特异性和可控性，正越来越广泛地应用于神经功能的研究中。它采用了一种被称为免疫外源凝集素的新工具，这是一种通过DNA重组技术而获得的IgG的Fc片段和目标受体胞外域的融合蛋白。这使其保持了天然的与配体结合的特异性和亲和力，正是通过这种结合而发挥影响受体功能的作用。蛋白质的分子设计：蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。单克隆抗体：由单个B细胞克隆或其杂交瘤细胞克隆产生的，只针对一种抗原决定簇的抗体。抗体酶：又称催化性抗体，是一类具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性，它既具有抗体的高度选择性，又具有酶的高效亲和层析：亲和层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。等电聚焦：等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线形pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。激光捕获显微切割技术：LCM是直接从冰冻或石蜡包埋肿瘤组织切片中获取细胞。它是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目的细胞留在膜上。简答1、 什么是蛋白质的变性？哪些因素能引起蛋白质变性？蛋白质分子受到某些物理因素和化学因素的影响时，会引起蛋白质天然构象的破坏，导致生物活性的降低或完全丧失，这一过程称为变性。引起蛋白质变性的因素：物理因素：热、紫外线、高压； 化学因素：有机溶剂、脲、胍、酸、碱。2、 什么是蛋白质的分子设计及分子设计的分类和目标？蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。主要目的有两个：一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信；二是探索蛋白质的折叠机理。分子设计的分类：定点突变或化学修饰法、拼接组装设计法、从头设计全新蛋白质。3、蛋白质修饰的反应类型及修饰部位？蛋白质修饰的反应类型：烷基化反应、酰化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应。修饰部位：巯基的化学修饰、氨基的的化学修饰、羧基的化学修饰、二硫键的化学修饰、其他侧链基团的修饰。4、蛋白质分离纯化的一般步骤？ （1）选择实验材料（2）实验材料的预处理（3）蛋白质的提取（4）蛋白质粗分级（5）蛋白质细分级（6）蛋白质的鉴定5、离子交换层析的主要原理？原理：蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不同的蛋白质所带有电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。这样，当蛋白质混合物流经带电凝胶时，电荷吸引作用小的蛋白质先流过，而电荷吸引作用大的蛋白质后流过凝胶，从而把不同的蛋白质分开。6、SDS-PAGE的原理？双向电泳的原理？SDS-PAGE的原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳常用垂直板电泳装置，即将聚丙烯酰胺凝胶灌装在双层玻璃板之间，在凝胶顶端丄样，然后分别在凝胶的底部和顶端接上正负电极，在凝胶中形成电场，在电场的作用下，蛋白质由凝胶顶端向下移动，移动的速度与蛋白质所带电荷、分子大小和分子形状有关，从而把不同的蛋白质分开。在SDS-PAGE中，大量的SDS与蛋白质结合，由于SDS带有负电，导致蛋白质带有大量负电荷，掩盖了蛋白质本身所带电荷的差异，在电场作用下，SDS-蛋白质复合物由负极像正极移动，移动速度与蛋白质本身电荷差异无关。这样的SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子质量有关系。双向电泳的原理：双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。7、什么是蛋白质组学？它的研究技术有哪些？蛋白质组学：蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。即定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为(如疾病过程和药物效应)，以及基因表达调控的机制的学科。研究技术：蛋白质分离技术：激光捕获显微切割技术、二维凝胶电泳技术。蛋白质分析和鉴定技术：图谱分析技术、生物质谱技术。生物信息学技术8、重叠延伸PCR技术的主要原理重叠延伸PCR技术由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起。该方法必须在特定的待突变位点和上下游分别设计引物，引物A、B为上下游引物，且分别与模板链互补，引物C、D为突变引物。先以引物B、C在一定条件下进行PCR，得产物BC，再以引物A、D进行PCR得产物AD，混合这两个扩增产物，以A、B为引物进行PCR，即可得到带突变点的DNA片段。将其装入特定的载体中，转化人相应的宿主菌，扩增后经鉴定得到目的DNA。9、生物信息学在蛋白质工程中的主要应用生物信息学在蛋白质的序列分析、结构预测、功能预测、分子设计等方面具有重要应用10、酵母双杂交技术的原理及应用？酵母双杂交技术原理：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域与转录激活域，这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达，基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共同表达于同一个酵母细胞内。酵母双杂交技术主要应用在以下几方面： 检验一对功能已知蛋白间的相互作用； 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域，通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展；用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径；分析新基因的生物学功能。即用功能未知的新基因去筛选文库，然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。问答题1、 实施蛋白质设计遵循的原则活性设计、对专一性的设计、Scaffold、疏水基团与亲水基团需合理分布、最优的氨基酸侧链几何排布2、 蛋白质设计的基本程序（1）收集相关蛋白质的结构信息（2）建立所研究蛋白质的结构模型（3）结构模型的生物信息分析（4）选择设计目标 （5）序列设计 （6）预测结果 （7）获得新蛋白质 （8）新蛋白质的检验（9）完成新蛋白质设计3、 为什么要发展基因融合技术？ 通过与一特异性蛋白质或其特异的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到有效的回收、纯。 通过与具有不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白；与报告分子，如-半乳糖苷酶(LatZ)、-葡萄糖苷酸酶(GUS)、分泌型胎盘磷酸酯酶(SSEAP)、萤火虫荧光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，应用于蛋白定位及转基因动物； 外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解，有时可以通过产生融合蛋白避免目的产物被快速降解，从而稳定表达产物的产率。特别是表达一些小肽基因时，这是一个策略； 通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，如与硫氧化还原蛋白形成融合蛋白，改变在细胞内的溶解性，防止包涵体的产生；4、 蛋白质的分离纯化方法（根据蛋白质的性质）理化性质蛋白质的分子大小：透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的； 蛋白质的带电特性：，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是以此为依据来分离纯化蛋白质； 蛋白质的溶解特性：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离等均依据此原理 蛋白质的变性与复性：尿素变性复性 蛋白质的结晶：蛋白质分子表面的特性：吸附层析蛋白质的分子形状：亲和层析蛋白质的紫外吸收：蛋白质中的芳香性氨基酸，主要是苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸，它们的芳香侧链在紫外区域(200300nm)具有较的紫外吸收，据此可以测定蛋白质含量；蛋白质的颜色反应：具有特殊侧链的氨基酸残基与一些化学试剂反应呈现特定的颜色，如精氨酸胍基的坂口反应、酪氨酸酚羟基的米伦反应等。据此可以鉴定蛋白质的存在。5、 原核表达载体需要哪些基本元件？复制起始点、选择性基因、启动子、核糖体结合位点、多克隆位点、转录终止序列6、 蛋白质工程的概念及在不同领域的应用医药领域：蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠，已成为医药产品中的重要组成部分。人胰岛素突变体、尿激酶、-干扰素，白细胞-2、病毒疫苗、嵌合抗体和人源化抗体生物材料设计领域：能源领域：农业领域：工业领域实验设计题1、 蛋白质定位设计的目标及解决方法（书上表格）2、 设计实验（藻胆蛋白的分离纯化）(1) 选择实验材料：藻胆蛋白是藻类的光合作用蛋白，在螺旋藻中含量很高，选用钝顶螺旋藻的一个直线型高产突变株为实验材料，以经典Zarrouk培养基在2530和自然光条件下培养，大约培养2周，OD560达到2.0时进行采收。(2)实验材料预处理：螺旋藻为多细胞蓝藻，形体很小，用110目网膜过滤收集藻体，除去培养基后，用蒸馏水反复冲洗、过滤，最后用蛋白质提取缓冲液冲洗、过滤。2g鲜藻用20mL蛋白质提取缓冲液悬浮，在冰浴上超声破碎，10000g离心30min，去掉沉淀，上清液即为藻胆蛋白粗提取液。(3) 藻胆蛋白粗分级：采用硫酸铵分级沉淀和透析相结合的方法。先将硫酸铵加到30饱和度，根据硫酸铵饱和度表，0条件下需加人固体硫酸铵164gL，4搅拌2h，离心，去沉淀。再将上清的硫酸铵浓度调节到55饱和度，还需加入固体硫酸铵148gL，4搅拌2h，离心，去上清，将沉淀悬浮于5mL蛋白质提取缓冲液中。将此悬浮物装入透析袋，用500mL蛋白质提取缓冲液透析，2h后透析平衡，则硫酸铵的浓度降为原来的百分之一，再换500mL透析液透析，共换两次，透析平衡后，硫酸铵浓度降为原来的百万分之一，不会影响蛋白质的稳定性和后续实验。透析结束，打开透析袋，将透析袋内的蛋白质提取物在4离心，12 500g，30min，除去含有变性蛋白的沉淀，上清液即为藻胆蛋白粗提取物，用于藻胆蛋白的细分级。（4）藻胆蛋白细分级：藻胆蛋白粗提取物先后经过分子筛层析，阴离子交换层析，羟基磷灰石吸附层析，得到藻蓝蛋白。3、设计实验从血浆中分离低密度脂蛋白（参考生化大实验）纯化鉴定实验题1、 western-blotting的主要实验原理，基本步骤及其注意点。实验原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western印迹的基本步骤：1.凝胶电泳（可以是活性聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也可以是等电聚焦电泳） 2. 转膜 3. 抗原抗体显色反应注意事项1选用高纯度的试剂，Acr及Bis中如有丙烯酸，则引起聚焦后pH梯度漂移。需进一步纯Acr及Bis，一般用重结晶法。2、两性电解质载体的选择，根据被测定物大概的pH范围，选择所需要的两性电解质载体。3进行IEFPAGE时样品应预先处理，盐类干扰pH梯度的形成，造成区带扭曲，因此含盐样品应预先透析或用Sephadex G25等脱盐。样品要充分溶解，如有颗粒物存在应离心除去，否则可引起拖尾。4电泳时电流、电压或功率，取决于胶板的面积与厚度。功率不要过大，并应及时冷却，以免热效应高而烧焦超薄凝胶板。电泳时间不要太长，本法以2h左右为宜。电极缓冲液应根据两性电解质pH范围加以选择。5、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。6、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。