聚合酶链反应及其应用.ppt

5 2 3 4 1 6 7 8 PCRPCR的原理与反的原理与反应应条件条件PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶酶与与扩扩增的精确性增的精确性PCRPCR的模板及制的模板及制备备PCRPCR的引物的引物设计设计及合成及合成PCRPCR反反应应的其它控制参数的其它控制参数PCRPCR技技术术的衍生与的衍生与发发展展PCRPCR技技术术在生命科学研究中的在生命科学研究中的应应用用PCRPCR技技术术在在临临床医学方面的床医学方面的应应用用聚合聚合酶链酶链反反应应及其及其应应用用PCRPCR技技术术的的诞诞生与生与发发展展1 PCR1 PCR的原理与反的原理与反应应条件条件PCRPCR技技术术的反的反应应条件条件PCRPCR技技术术的基本原理的基本原理PCRPCR反反应应的的质质量指量指标标PCRPCR技技术术的的诞诞生与生与发发展展 聚合聚合酶链酶链反反应应（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction，PCRPCR ）又称又称为为PCRPCR扩扩增技增技术术，是一种高效、快速、特异性的体外，是一种高效、快速、特异性的体外DNADNA聚合程序。聚合程序。19851985年年，美国美国PE-cetusPE-cetus公司人公司人类遗传类遗传研究室的研究室的Kary mullisKary mullis发发明了具有划明了具有划时时代意代意义义的的PCRPCR技技术术；19881988年年，美国美国PE-cetusPE-cetus公司推出世界上第一台公司推出世界上第一台PCRPCR热热循循环仪环仪，从而使，从而使PCRPCR反反应应自自动动化；化；19931993年年，Kary mullisKary mullis因因发发明明PCRPCR技技术获术获得得诺贝诺贝尔尔化学化学奖奖；19951995年年，定量定量PCRPCR仪诞仪诞生，使定量研究生，使定量研究DNADNA靶序列成靶序列成为现实为现实。PCRPCR技技术术的基本原理的基本原理5555待待扩扩增增DNADNA区域区域55变变性性加加热热5555引物引物退火退火5555底物底物聚合聚合55555555加加热热变变性性555555555555555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加加热热变变性性引物引物退火退火底物底物聚合聚合112233555555PCRPCR技技术术的反的反应应条件条件DNADNA或或RNARNA模板模板5555待待扩扩增增DNADNA区域区域559494 5 5 minmin55555555退火退火5555聚合聚合5555555555循循环环25-3025-30次次目目标标DNADNA片段达片段达101066-101077变变性性7070DNADNA引物引物DNADNA聚合聚合酶酶dNTPsdNTPsMgMg2+2+（缓缓冲液）冲液）PCRPCR反反应应的的质质量指量指标标 PCR PCR反反应应的的质质量量标标准有：准有：特异性（序列特异性（序列选择选择）有效性（序列有效性（序列产产量）量）上述三大上述三大标标准并非由准并非由单单一因素所决定，因此在一因素所决定，因此在PCRPCR反反应应中必中必须须准确性（序列准确性（序列对错对错）对对多种参数多种参数进进行行联联合控制和改合控制和改进进，但由于，但由于PCRPCR反反应应中的各参数往往中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数的改是相互影响的，因此任何参数的改进进不可能同不可能同时满时满足特异性、有效足特异性、有效性、准确性。性、准确性。PCRPCR扩扩增反增反应应的精确性的精确性2 PCR2 PCR的的DNADNA聚合聚合酶酶与与扩扩增的精确性增的精确性用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介DNADNA聚合聚合酶对酶对PCRPCR精确性的重要影响精确性的重要影响DNADNA聚合聚合酶酶的使用的使用PCRPCR扩扩增反增反应应的精确性的精确性 利用利用PCRPCR技技术扩术扩增增DNADNA靶序列的一个重要靶序列的一个重要问题问题是是这这种种DNADNA体外聚体外聚合反合反应应的序列忠的序列忠实实程度，即程度，即DNADNA扩扩增增产产物序列的物序列的准确率准确率。PCRPCR反反应应的的准确率准确率远远远远低于低于细细胞内的胞内的DNADNA聚合反聚合反应应，除了缺少完善的，除了缺少完善的DNADNA聚合校聚合校正系正系统统外，影响外，影响PCRPCR反反应应准确率的因素准确率的因素还还包括：包括：DNADNA聚合聚合酶酶的保真性能（主要因素）的保真性能（主要因素）DNADNA链链的物理的物理损伤损伤PCRPCR反反应应体系的体系的洁净洁净度度DNADNA聚合聚合酶对酶对PCRPCR精确性的重要影响精确性的重要影响 DNADNA聚合聚合酶酶的保真性主要取决于其的保真性主要取决于其3355 的核酸外切的核酸外切酶酶活性，它活性，它负责对错误掺负责对错误掺入的碱基入的碱基进进行校正。相关研究行校正。相关研究结结果表明，果表明，DNADNA聚合聚合酶酶的的出出错错率在每率在每轮轮延伸每核苷酸延伸每核苷酸1.6 1.6 X 10X 1066-2.1 -2.1 X 10X 1044范范围围内。内。DNADNA聚合聚合酶酶的碱基的碱基掺掺入入错误错误可能可能发发生在其延伸生在其延伸阶阶段的五种活性：段的五种活性：与与dNTPdNTP的的结结合特异性合特异性 磷酸二磷酸二酯键酯键的形成速率的形成速率 焦磷酸的焦磷酸的释释放速率放速率 碱基碱基错误掺错误掺入之后的持入之后的持续续延伸性延伸性 3355 的核酸外切活性的的核酸外切活性的强强弱弱用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 Taq DNA Taq DNA酶酶的聚合出的聚合出错错率率较较高（高（2.12.1X10X10-4-4-4-4），因），因为为它没有它没有3355 的的的核酸外切的核酸外切酶酶活性和校正功能。然而通活性和校正功能。然而通过优过优化反化反应应条件，可使条件，可使TaqTaq酶酶的的聚合出聚合出错错率降低到原来的率降低到原来的1/31/3。Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶催化的聚合反催化的聚合反应应的普遍的普遍则则Taq DNATaq DNA酶还酶还常常常常导导致致扩扩增增产产物的缺失突物的缺失突变变。Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶（Thermus aquaticusThermus aquaticus）错误类错误类型是由型是由ATAT转换为转换为GCGC；如果模板如果模板DNADNA具有形成二具有形成二级结级结构的可能性构的可能性避免稀避免稀释释保存保存Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶在室温下也具有延伸引物的活性在室温下也具有延伸引物的活性 Taq DNA Taq DNA酶酶在使用在使用时应时应注意：注意：用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 KlenTaq DNA KlenTaq DNA聚合聚合酶酶是一种是一种NN端缺失了端缺失了的的Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶，因而，因而没有没有5 5 的核酸外切的核酸外切酶酶活性；活性；KlenTaq DNA KlenTaq DNA聚合聚合酶酶的的MgMg2+2+最佳最佳浓浓度范度范围围很很宽宽，因此很容易，因此很容易优优化化KlenTaq DNAKlenTaq DNA聚合聚合酶酶（Thermus aquaticusThermus aquaticus）在最佳反在最佳反应应条件下，条件下，KlenTaq DNAKlenTaq DNA聚合聚合酶酶出出错错率率为为 5.1 5.1 X 10X 1055，性能略性能略优优于于Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶。反反应应条件；条件；用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 Tth DNA Tth DNA聚合聚合酶酶在在MnMn2+2+的存在下，能有效地反的存在下，能有效地反转录长转录长度在度在10001000碱碱基以下的基以下的RNARNA；Tth DNA Tth DNA聚合聚合酶酶在在MgMg2+2+的存在下，能由的存在下，能由DNADNA模板合成模板合成DNADNA；Tth DNATth DNA聚合聚合酶酶（Thermus thermophilusThermus thermophilus）好地克服好地克服RNARNA链链中普遍存在二中普遍存在二级结级结构的构的难题难题。Tth DNA Tth DNA聚合聚合酶酶在在较较高的温度下仍具有逆高的温度下仍具有逆转录酶转录酶活性，因此活性，因此能很能很 用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 Pfu Pfu是一种是一种高保真高保真的的DNADNA聚合聚合酶酶，出，出错错率极低；率极低；Pfu DNA Pfu DNA聚合聚合酶扩酶扩增出的增出的产产物物带带有平有平头头末端；末端；Pfu DNA Pfu DNA聚合聚合酶扩酶扩增速度极快，达增速度极快，达1.5-2 1.5-2 min/kbmin/kb；Pfu DNAPfu DNA聚合聚合酶酶（Pyrococcus furiosusPyrococcus furiosus）Pfu DNA Pfu DNA聚合聚合酶酶的的热稳热稳定性很高。定性很高。7.0 7.0 X 10X 1077-1.6 -1.6 X 10X 1066用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 Vent DNAVent DNA聚合聚合酶酶具有具有3 3 55 的核酸外切的核酸外切酶酶活性和校正功能，活性和校正功能，因此因此与其它与其它DNADNA聚合聚合酶酶（如（如TaqTaq酶酶）相比，具有相）相比，具有相对较对较好的高保真性，其好的高保真性，其出出错错率率为为2.4 2.4 X 10X 1055-5.7 -5.7 X 10X 1055 ；Vent DNAVent DNA聚合聚合酶酶（Thermococcus litoralisThermococcus litoralis）度小于度小于2 2 kbkb时时，扩扩增增产产物的物的长长度与度与MgMg2+2+的的浓浓度并无关度并无关联联；如果如果扩扩增增长长度大于度大于2 2 kbkb，则则需要高于需要高于2 2 mMmM的的MgMg2+2+，而在而在扩扩增增长长 如果模板如果模板链链中存在次黄中存在次黄嘌嘌呤核苷或脱氧尿呤核苷或脱氧尿嘧啶嘧啶核苷，核苷，VentVent DNADNA聚合聚合酶酶不能延伸引物。不能延伸引物。用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 DeepVent DNADeepVent DNA聚合聚合酶酶是一种在低温和高温条件下均极其是一种在低温和高温条件下均极其稳稳定的定的聚合聚合酶酶，且能使用广范，且能使用广范围围的的辅辅助溶助溶剂剂如甲如甲酰酰胺和胺和DMSODMSO等；等；DeepVent DNA DeepVent DNA聚合聚合酶酶能能产产生生长长达达14 14 kbkb的的扩扩增增产产物，其物，其外切外切酶酶DeepVent DNADeepVent DNA聚合聚合酶酶（Pyrococcus species GB-DPyrococcus species GB-D）活性活性比比Vent DNAVent DNA聚合聚合酶酶高高 4 4 倍，聚合活性比倍，聚合活性比Taq DNATaq DNA酶酶高高5-155-15倍，倍，度小于度小于2 2 kbkb时时，扩扩增增产产物的物的长长度与度与MgMg2+2+的的浓浓度并无关度并无关联联；如果如果扩扩增增长长度大于度大于2 2 kbkb，则则需要高于需要高于2 2 mMmM的的MgMg2+2+，而在而在扩扩增增长长 如果模板如果模板链链中存在次黄中存在次黄嘌嘌呤核苷或脱氧尿呤核苷或脱氧尿嘧啶嘧啶核苷，核苷，VentVent DNADNA聚合聚合酶酶不能延伸引物。不能延伸引物。出出错错率率比比Vent DNAVent DNA聚合聚合酶酶低低 2 2 倍；倍；用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 UlTmaUlTma是一种高保真的是一种高保真的DNADNA聚合聚合酶酶，可以，可以较较高的高的产产量量扩扩增小于增小于3 3 kbkb的的DNADNA靶序列，靶序列，产产物呈平物呈平头头末端。末端。UITma DNAUITma DNA聚合聚合酶酶（Thermotoga maritimaThermotoga maritima）DNADNA聚合聚合酶酶的使用的使用DNADNA聚合聚合酶酶的的标标准使用范准使用范围围：1-5 1-5 Units/Units/m mL L特异性的改特异性的改进进：在建在建议议使用的范使用的范围围内尽可能地降低内尽可能地降低酶浓酶浓度。度。聚合聚合酶酶的的浓浓度是决定度是决定PCRPCR反反应应成本的成本的的重要参数，的重要参数，浓浓度度 过过高不高不仅仅能降特异性，同能降特异性，同时时也也导导致不必要的消耗。致不必要的消耗。准确性的改准确性的改进进：建建议议使用高保真的使用高保真的DNADNA聚合聚合酶酶 PCRPCR模板制模板制备备与与纯纯化化3 PCR3 PCR的模板与制的模板与制备备PCRPCR模板的使用模板的使用粗粗样样品中的品中的PCRPCR抑制抑制剂剂PCRPCR模板制模板制备备与与纯纯化化 DNA DNA和和RNARNA均可作均可作为为PCRPCR扩扩增反增反应应的模板，但一般情况下，的模板，但一般情况下，mRNAmRNA先逆先逆转录转录成成cDNAcDNA再再进进行行扩扩增。增。PCRPCR模板的来源主要有两大模板的来源主要有两大类类：纯净纯净物物 如重如重组质组质粒、制粒、制备备的染色体的染色体DNADNA、回收的回收的DNADNA片片段段粗粗样样品品 如如粪粪便、便、脑脑脊髓液、血液、食物、脊髓液、血液、食物、动动物物贝贝壳、土壤、壳、土壤、尿液、唾液、福尿液、唾液、福尔马尔马林固定林固定剂剂、组织组织切片、切片、脓脓汁、汁、喷喷 嚏液、痰液等嚏液、痰液等 上述粗上述粗样样品品含有大量的含有大量的PCRPCR反反应应抑制物抑制物质质，因此如何，因此如何去除去除这这些种些种类类繁多的繁多的抑制抑制剂剂或者或者添加添加必要的必要的PCRPCR反反应应增增强剂强剂显显得十分重要。得十分重要。PCRPCR模板制模板制备备与与纯纯化化 从各种从各种粗粗样样品中去除品中去除PCRPCR反反应应抑制抑制剂剂的程序不尽相同，但常用的的程序不尽相同，但常用的手段包括：手段包括：样样品稀品稀释释溶溶剂剂萃取（萃取（氯氯仿仿异戊基乙醇异戊基乙醇 491 491 ）乙醇沉淀乙醇沉淀高速离心高速离心超超滤滤粗粗样样品中的品中的PCRPCR抑制抑制剂剂粪粪便便 胆胆盐盐、胆、胆红红素（抑制素（抑制浓浓度度5050m mg/mLg/mL）血液血液 亚铁亚铁血血红红素、聚乙醇磺酸素、聚乙醇磺酸钠钠、heparinheparin（抗凝抗凝剂剂）土壤土壤 腐殖物腐殖物质质、含、含铁铁化合化合物物植物植物 硫酸右旋糖苷硫酸右旋糖苷 食品食品 未未鉴鉴定的抑制定的抑制剂剂痰液痰液 未未鉴鉴定的抑制定的抑制剂剂PCRPCR模板的使用模板的使用PCRPCR模板模板的的标标准使用范准使用范围围：101022-10-1055 拷拷贝贝 特异性的改特异性的改进进：增加模板增加模板DNADNA的量、降低引物与模板的分子比的量、降低引物与模板的分子比 有效性的改有效性的改进进：增加引物与模板的分子比增加引物与模板的分子比 模板模板浓浓度的度的变变化很大程度上取决于待化很大程度上取决于待扩扩增的碱基序列，但一般增的碱基序列，但一般而言，模板而言，模板DNADNA长长度小，度小，PCRPCR扩扩增增产产物的量就大，因此物的量就大，因此对对于大分子于大分子量的模板量的模板DNADNA（尤其是真核生物基因尤其是真核生物基因组组DNADNA），），在在扩扩增之前最好先增之前最好先用超声波用超声波处处理或限制性理或限制性酶酶消化消化。PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则4 4 PCRPCR的引物的引物设计设计及合成及合成PCRPCR引物的使用引物的使用引物的在引物的在线设计线设计工具及免工具及免费软费软件件简简介介PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则 选择选择合适的引物是合适的引物是PCRPCR实验设计实验设计的重要步的重要步骤骤，合适引物最基本的，合适引物最基本的引物的引物的长长度度标标准就是与靶序列的准就是与靶序列的高特异性高特异性杂杂交交。为为达到此目的，引物达到此目的，引物设计应设计应注意注意下列几点：下列几点：理想的引物理想的引物长长度度应该应该在在18-3018-30个碱基之个碱基之间间，常，常见见的是的是20-2720-27个碱基个碱基PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则引物的引物的GCGC含量含量 引物序列中的引物序列中的GCGC含量含量应应在在35%-65%35%-65%之之间间，最好在，最好在45%-55%45%-55%范范围围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有过过高高的的GCGC碱基，那么就碱基，那么就在其在其55端端设计设计一串一串A A或或T T；同同样样，如果引物中的，如果引物中的ATAT含量含量过过高，就在其高，就在其 55 端端设计设计一串一串GG或或CC，以便将整条引物的以便将整条引物的GCGC含量控制在合适的范含量控制在合适的范围围内。内。PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则退火温度（退火温度（TaTa）引物的退火温度一般要比估引物的退火温度一般要比估计计的相的相应应熔点温度低熔点温度低5 5左右，在很多左右，在很多情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到4-4-6 6，尚尚不至于影响不至于影响RCRRCR扩扩增反增反应应的的产产量，但它量，但它们们的退火温度的退火温度应应在在55-7555-75范范围围 引物碱基引物碱基2020，TaTa =4 X=4 X（G+CG+C）+2 X+2 X（A+TA+T）-5 5（）内。如果两条引物的退火温度差内。如果两条引物的退火温度差别过别过大，可以适当延大，可以适当延长长较较低低TaTa值值的引的引物的物的33端（端（这样这样可以保持可以保持扩扩增增产产物的物的长长度不度不变变）或）或55端。端。引物的引物的TaTa值值估算有多种公式，最好根据估算有多种公式，最好根据RCRRCR试剂试剂盒建盒建议议的的计计算方算方法，例如法，例如Alkami Quick GuideAlkami Quick Guide试剂试剂盒建盒建议议的的计计算方法如下：算方法如下：引物碱基引物碱基2020，TaTa =62.5+0.41 X=62.5+0.41 X（GC%GC%）-500/500/长长度度 -5 5（）PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则杜杜绝绝互互补补区域的存在区域的存在 引物序列和靶序列各自内部引物序列和靶序列各自内部应应杜杜绝绝互互补补区域的存在。区域的存在。为扩为扩增后操作提供便利条件增后操作提供便利条件 在不影响在不影响扩扩增反增反应应特异性的前提下，可在引物的特异性的前提下，可在引物的55端引入端引入诸诸如限如限限制性内切限制性内切酶识别酶识别位点、启位点、启动动子序列等有用的非模板序列，以便于子序列等有用的非模板序列，以便于扩扩增后操作。增后操作。PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则引物与模板的互引物与模板的互补补程度程度 在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到100%100%互互补补，但，但检查检查靶序列上其它可能存在的引物同源区域靶序列上其它可能存在的引物同源区域 为为了减少了减少PCRPCR扩扩增增产产物的物的污污染本底，在染本底，在设计设计引物序列引物序列时应检查时应检查模模板板DNADNA上是否存在潜在的引物同源区域。上是否存在潜在的引物同源区域。尽可能高的互尽可能高的互补补程度是必要的。程度是必要的。PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则选择选择内含子序列作内含子序列作为为引物序列引物序列 在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成在真核生物中，即便是在重复基因的不同家族成员员之之间间，其内含，其内含引物的末端序列引物的末端序列 在引物的两端在引物的两端设设置置1-21-2个个嘌嘌呤碱基呤碱基，最好在引物的，最好在引物的33端端避免避免GG或或CC 这样这样可以在聚合反可以在聚合反应应开始开始时时增加引物后面碱基增加引物后面碱基掺掺入的机会。入的机会。引物引物33端端子序列也是随机多子序列也是随机多样样性的。性的。至少至少应应有有1-21-2个碱基必个碱基必须须是特异性的。是特异性的。引物的在引物的在线设计线设计工具及免工具及免费软费软件件简简介介The Primer GeneratorThe Primer Generator（TPGTPG）http:/www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgihttp:/www.med.jhu.edu/medcenter/primer/primer.cgi TPGTPG是一种基于是一种基于CGICGI数据数据库库便利的用于定点突便利的用于定点突变变的引物的引物设计设计工具。工具。只要在网只要在网页页上相上相应应的位置中的位置中键键入不超入不超过过1515个碱基的短核苷酸序列、所个碱基的短核苷酸序列、所期望的氨基酸序列、以及允期望的氨基酸序列、以及允许许替替换换的最大碱基数，的最大碱基数，设计设计工具便会提供工具便会提供满满足初始要求的所有可能的引物序列，足初始要求的所有可能的引物序列，还还能能显显示示酶酶切位点的消失或增切位点的消失或增加。但加。但TPGTPG的一个明的一个明显显缺陷是不能缺陷是不能计计算引物的算引物的TmTm值值并判断其并判断其稳稳定性。定性。引物的在引物的在线设计线设计工具及免工具及免费软费软件件简简介介Primers!Primers!http:/ WWW GeneFisherWWW GeneFisher http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Web PrimersWeb Primershttp:/alces.med.umn.edu/webprimers.html http:/alces.med.umn.edu/webprimers.html Project DOPE2Project DOPE2http:/dope.interactiva.de/http:/dope.interactiva.de/NetPrimer NetPrimer http:/ Oligos-U-Like Primers3 Oligos-U-Like Primers3 http:/www.path.cam.ac.uk/cgi-bin/primer3.cgi http:/www.path.cam.ac.uk/cgi-bin/primer3.cgi PCRPCR引物的使用引物的使用PCRPCR引物引物的的标标准使用范准使用范围围：0.1-1.0 0.1-1.0 m mMM，最好最好0.2-0.5 0.2-0.5 m mM M 特异性的改特异性的改进进：降低降低引物引物和和dNTPdNTP的的浓浓度可以在很大程度上改度可以在很大程度上改有效性的改有效性的改进进：增加引物与模板的分子比；增加引物与模板的分子比；如果引物中有不配如果引物中有不配善善PCRPCR扩扩增反增反应应的特异性，高的特异性，高浓浓度的引物往往会度的引物往往会导导致非特异性致非特异性的退火及副的退火及副产产物形成，同物形成，同时时也会促也会促进进引物二聚体的引物二聚体的产产生。在模生。在模板量一定的情况下，降低引物板量一定的情况下，降低引物浓浓度度实际实际上也是降低引物与模板上也是降低引物与模板的分子之比。的分子之比。对对的碱基，的碱基，则则适当降低引物的适当降低引物的浓浓度。度。5 5 PCRPCR反反应应的其它控制参数的其它控制参数脱氧三磷酸核苷酸（脱氧三磷酸核苷酸（dNTPsdNTPs）预热变预热变性温度和性温度和时间时间MgMg+2+2离子离子退火退火杂杂交温度和交温度和时间时间延伸聚合温度和延伸聚合温度和时间时间循循环环次数次数反反应应体体积积脱氧三磷酸核苷酸（脱氧三磷酸核苷酸（dNTPsdNTPs）dNTPsdNTPs的的标标准使用范准使用范围围：20-200 20-200 m mMM特异性的改特异性的改进进：降低降低dNTPsdNTPs的的浓浓度，但要注意度，但要注意MgMg+2+2的摩的摩尔浓尔浓度度有效性的改有效性的改进进：对对于于较较大分子量的模板，大分子量的模板，应应适当适当提高提高dNTPsdNTPs的量的量如果一种如果一种dNTPdNTP的的浓浓度度过过高，它就会高，它就会优优先先掺掺入到延入到延长链长链中，造成中，造成扩扩增增产产物的不准确，因此要保持四种物的不准确，因此要保持四种dNTPsdNTPs的的一致一致。此外，保。此外，保持四种持四种dNTPsdNTPs的的浓浓度度略高于略高于DNADNA聚合聚合酶对酶对各种各种dNTPsdNTPs的的KmKm值值也也很重要（很重要（10-15 10-15 m mMM）。）。也也应应同步降低。同步降低。准确性的改准确性的改进进：降低降低dNTPsdNTPs的的浓浓度，但要注意度，但要注意MgMg+2+2的摩的摩尔浓尔浓度度也也应应同步降低。同步降低。MgMg+2+2离子离子MgMg+2+2的的标标准使用范准使用范围围：0.5-10 0.5-10 mMmM特异性的改特异性的改进进：降低降低MgMg+2+2浓浓度，但要注意度，但要注意过过低的低的MgMg+2+2浓浓度又会影度又会影有效性的改有效性的改进进：提高提高MgMg+2+2浓浓度，但度，但过过量量MgMg+2+2将将导导致非特异性致非特异性扩扩增增游离的游离的MgMg+2+2离子离子浓浓度度应应高于高于dNTPsdNTPs总浓总浓度度0.5-3.00.5-3.0mMmM。由于由于MgMg+2+2 能与能与dNTPsdNTPs形成可溶性的复合物，形成可溶性的复合物，过过低低浓浓度的度的MgMg+2+2离子将会影响离子将会影响dNTPsdNTPs的有效的有效浓浓度。度。MgMg+2+2的的浓浓度影响度影响扩扩增增产产物的特异性、引物退物的特异性、引物退火、引物二聚体的形成、熔点温度、火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶酶的活性和准确性。因此，的活性和准确性。因此，PCRPCR反反应应系系统统的的主要主要优优化参数化参数是是MgMg+2+2的的浓浓度，尤其当度，尤其当扩扩增增产产物大物大大于大于1 1kbkb时时，这这个因素个因素显显得更得更为为重要。重要。响响扩扩增增产产物的物的产产量。量。预热变预热变性温度和性温度和时间时间预热预热温度和温度和时间时间的的标标准使用范准使用范围围：92-9692-96 30 30 secs-10 mins secs-10 mins 在在酶酶不存在不存在时时，预热预热能能灭灭活活样样品中有害的蛋白品中有害的蛋白酶酶和核酸和核酸酶酶，同，同时时又能保又能保证证模板的完全模板的完全变变性，尤其是基因性，尤其是基因组组DNADNA直接作直接作为为模板使用模板使用时时，更，更显显得重要。得重要。变变性温度和性温度和时间时间的的标标准使用范准使用范围围：92-9692-96 30 30-120 secs-120 secs 退火退火杂杂交温度和交温度和时间时间退火温度和退火温度和时间时间的的标标准使用范准使用范围围：37-6537-65 10 10-120 secs-120 secs 退火退火时时，引物迅速，引物迅速杂杂交。不同交。不同DNADNA聚合聚合酶酶所所拥拥有的有的TmTm值值的差异的差异会改会改变变有效的引物退火温度。有效的引物退火温度。特异性的改特异性的改进进：提高退火温度（比建提高退火温度（比建议议退火温度提高退火温度提高2-52-5）；）；减少退火减少退火时间时间。过长过长的退火的退火时间时间在正常情况下并不能提高在正常情况下并不能提高产产量，量，只会增加非特异性引物只会增加非特异性引物杂杂交的可能性。交的可能性。延伸聚合温度和延伸聚合温度和时间时间延伸聚合温度和延伸聚合温度和时间时间的的标标准使用范准使用范围围：72 72 60 60-120 secs-120 secs PCRPCR扩扩增反增反应应中普遍使用的中普遍使用的DNADNA聚合聚合酶酶的聚合速度每秒至少的聚合速度每秒至少5050个碱基，所以如果个碱基，所以如果PCRPCR扩扩增增产产物物长长度小于度小于400 400 bpbp，聚合聚合时间时间可以少可以少于于1515秒，特秒，特别别是当退火温度是当退火温度选选得得较较高的高的时时候，在退火候，在退火阶阶段就有一些段就有一些单单体体掺掺入。入。较长较长PCRPCR产产物的物的扩扩增需要相增需要相应应延延长长反反应时间应时间，但最好要，但最好要比理比理论计论计算算时间时间更更长长些，以弥些，以弥补补由于反由于反应应系系统统粘度增大所粘度增大所产产生的反生的反应应滞后作用。滞后作用。循循环环次数次数 在一定的循在一定的循环环次数下，次数下，PCRPCR反反应应的最的最终产终产量可由下式估算：量可由下式估算：由上式可以看出，由上式可以看出，PCRPCR产产物呈指数物呈指数扩扩增，但当然增，但当然产产物拷物拷贝贝数达到数达到10101212（阈值阈值）时时产产物的物的扩扩增速度一般急增速度一般急剧剧下降。达到下降。达到这这个个阶阶段所需要的循段所需要的循环环次数可由下式次数可由下式计计算：算：影响上述影响上述扩扩增增阈值阈值的主要因素包括：的主要因素包括：扩扩增底物（引物和增底物（引物和dNTPsdNTPs）有效有效浓浓度的下降度的下降 N Nff=N=N0 0 X 2 X 2 NN 其中其中NN为为循循环环次数，次数，NN00为为起始拷起始拷贝贝数，数，NN00为为最最终终拷拷贝贝数数 N Nff=N=N0 0（1+Y1+Y）NN非特异性非特异性产产物或引物二聚体物或引物二聚体对对反反应试剂应试剂的的竞竞争作用争作用反反应试剂应试剂的的稳稳定性定性扩扩增增产产物抑制作用物抑制作用高高浓浓度度产产物的退活作用以及不完全物的退活作用以及不完全变变性性 特异性的改特异性的改进进：降低循降低循环环次数，减小次数，减小扩扩增片段增片段长长度。度。有效性的改有效性的改进进：对对于于11kbkb以上片段的以上片段的扩扩增，增加循增，增加循环环中各步中各步骤骤的滞留的滞留时间时间。反反应应体体积积反反应应体体积积的的标标准范准范围围：20-100 20-100 m ml l（0.5 ml0.5 ml的小离心管）的小离心管）有效性的改有效性的改进进：增加反增加反应应体体积积以及保温以及保温时间时间，以充分保，以充分保证热证热平衡；平衡；5 5 m ml l的反的反应应体体积积也有成功的例子。反也有成功的例子。反应应体体积过积过大会影响加大会影响加热热和冷和冷却，而却，而过过小的反小的反应应体体积积又容易又容易导导致温度致温度变变化不化不稳稳定，定，进进而降低而降低产产量，甚至反量，甚至反应应管的几何尺寸、管壁厚薄、管的几何尺寸、管壁厚薄、扩扩增增仪仪的加的加热热冷却装置冷却装置也能影响各循也能影响各循环环步步骤骤所需的所需的时间时间。对对于于100100m ml l以下的反以下的反应应体体积还应该积还应该用油封用油封顶顶，以减少反，以减少反应应体系的体系的蒸蒸发浓缩发浓缩效效应应。6 6 PCRPCR技技术术的衍生与的衍生与发发展展LA PCRLA PCR（Long and Accurate PCRLong and Accurate PCR）RT PCRRT PCR（Reverse TranscriptaseReverse Transcriptase）原位原位PCRPCR（In Situ PCRIn Situ PCR）定量定量PCRPCR（Quantitative PCRQuantitative PCR）锚锚定定PCRPCR（Anchored PCRAnchored PCR）多重多重PCRPCR（Multi PCRMulti PCR）反向反向PCRPCR（InvertedInverted PCR PCR）不不对对称称PCRPCR（AsymmetricAsymmetric PCR PCR）LA PCRLA PCR（Long and Accurate PCRLong and Accurate PCR）LA PCRLA PCR是一种是一种专门专门用于精确用于精确扩扩增增较长较长DNADNA片段的特种片段的特种PCRPCR程程序，其关序，其关键键的技的技术术是是结结合使用两种合使用两种热稳热稳定的定的DNADNA聚合聚合酶酶，可以，可以扩扩增增出出5-40 5-40 kbkb的的DNADNA大片段。两种大片段。两种酶酶的配比如下：的配比如下：其中，其中，PfuPfu和和DeepVentDeepVent起着二次校起着二次校对对的作用。的作用。KlenTaqKlenTaq Pfu =16Pfu =16 1 1KlenTaqKlenTaq DeepVent =50DeepVent =50 1 1RT PCRRT PCR（Reverse TranscriptaseReverse Transcriptase）RT-PCRRT-PCR是一种以是一种以mRNAmRNA为为模板，模板，经经cDNAcDNA扩扩增出增出DNADNA的技的技术术，能极其灵敏地能极其灵敏地检测检测到任何基因的到任何基因的转录转录物，而与物，而与mRNAmRNA的相的相对对量无关。量无关。标标准的准的RT-PCRRT-PCR程序包括：程序包括：mRNAmRNA的分离的分离cDNAcDNA反反应应的引物退火的引物退火mRNAmRNA反反转录为转录为cDNAcDNAcDNAcDNA的的PCRPCR扩扩增增 引物引物选择选择有三种有三种战战略：略：基因特异性引物化（基因特异性引物化（GSPGSP），），最精确最灵敏最精确最灵敏寡聚寡聚dTdT引物化引物化随机六聚体引物化随机六聚体引物化反向反向PCRPCR（InvertedInverted PCR PCR）通常通常，PCRPCR反反应应是是对对两条引物之两条引物之间间的序列的序列进进行行扩扩增，但如果将模板增，但如果将模板DNADNA稍稍酶酶切切环环化化酶酶切切扩扩增增做做处处理，即可理，即可实现对实现对已知序列两已知序列两侧侧的片的片段段进进行行扩扩增，增，这这种种战战略称略称为为反向反向PCRPCR技技术术。不不对对称称PCRPCR（AsymmetricAsymmetric PCR PCR）在在PCRPCR扩扩增循增循环环中引入不同中引入不同的引物的引物浓浓度，使得由两条引物介度，使得由两条引物介导扩导扩增反增反应应呈不呈不对对称状称状态态，这这种种战战略称略称为为不不对对称称PCRPCR技技术术。不不对对称称PCRPCR中的两条引物中的两条引物浓浓度一般采用度一般采用50-10050-100 1 1的配比，的配比，在最初的在最初的10-1510-15个循个循环环中，主要中，主要产产物物还还是双是双链链DNADNA，但当低但当低浓浓度度的引物耗尽后，高的引物耗尽后，高浓浓度引物引度引物引导导的的PCRPCR反反应应便会便会产产生大量的生大量的单链单链原位原位PCRPCR（In Situ PCRIn Situ PCR）原位原位PCRPCR是是PCRPCR技技术术与原位与原位杂杂交技交技术结术结合的合的产产物