抗体的选择.ppt

抗 体 的 选 择其木格2010.10主主 要要 内内 容容基础概念基础概念如何选择二抗如何选择二抗标记物的选择标记物的选择涉及的试验涉及的试验概概 念念1.抗体（抗体（antibody,Ab）功能性概念）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。抗体主要存在血清中，也存能的糖蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。以及乳汁等其它体液中。2.免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）结构性结构性概念概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似相似的的球球蛋白蛋白。抗体的分子结构轻链：轻链：VL、CL重链：重链：VH CH1、CH2、CH3、CH4 IgG IgM IgA IgE IgD 二、免疫球蛋白的功能区二、免疫球蛋白的功能区 功能区：是不连续，紧密折叠的区域，由重链和轻链功能区：是不连续，紧密折叠的区域，由重链和轻链功能区：是不连续，紧密折叠的区域，由重链和轻链功能区：是不连续，紧密折叠的区域，由重链和轻链经链内二硫键连接而成的球状结构。该区具有特殊的经链内二硫键连接而成的球状结构。该区具有特殊的经链内二硫键连接而成的球状结构。该区具有特殊的经链内二硫键连接而成的球状结构。该区具有特殊的功能特性。功能特性。功能特性。功能特性。1.1.类和亚类（根据类和亚类（根据H H链的抗原性不同）链的抗原性不同）IgG IgG(gamma)(gamma)IgA IgA (alpha)(alpha)IgM IgM (mu)(mu)IgD IgD (delta)(delta)IgE IgE (epsilon)(epsilon)(1)(1)类类(2)(2)(2)(2)亚类亚类亚类亚类IgGIgG：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 IgAIgA：IgA1,IgA2IgA1,IgA2主要功能主要功能1.VL和和VH是抗原结合的部位（是抗原结合的部位（FV区）。区）。2.CL和和CH上具有同种异型的遗传标记。上具有同种异型的遗传标记。3.IgG的的CH2和和IgM的的CH3具有补体固有成分具有补体固有成分C1q的结合点，参与激活补体系统。的结合点，参与激活补体系统。4.CH3/CH4具有结合包括单核细胞、巨噬细胞、具有结合包括单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、粒细胞、B细胞、细胞、NK细胞等细胞的细胞等细胞的Fc段受体段受体的功能。的功能。5.IgG的的CH2+CH3 具有介导具有介导IgG通过胎盘的特通过胎盘的特性。性。三三、免疫球蛋白的、免疫球蛋白的水解片段水解片段 1.木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（Papain）（将重链于近氨基端）（将重链于近氨基端切断切断）Fab段（段（fragment of antigen-binding，抗原抗原结合片段结合片段）Fab段可以与抗原结合，具有抗段可以与抗原结合，具有抗体的活性。体的活性。Fc段段（fragment crystalizable，可结晶片段）可结晶片段）Fc段不能与抗原结合，但可执行段不能与抗原结合，但可执行Ig的其的其他生物学功能。他生物学功能。2.胃蛋白酶胃蛋白酶（Pepsin）（将重链于近羧基端）（将重链于近羧基端切断）切断）F(ab)2 ：可结合：可结合2个抗原表位。个抗原表位。pFc：无生物学活性。：无生物学活性。什么是一抗二抗？一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。主要用于检测抗体的存在。利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就有目的蛋白。如何选择二抗？如何选择二抗？检检测测任任何何目目的的靶靶蛋蛋白白都都有有不不止止一一种种抗抗体体可可供供选选择择，同同时时在在后后继继试试验验中中也也会会有有不不同同的的检检测测方方案案，因因此此在在选选择择二二抗抗的的时时候候要要综综合合考考虑虑一一抗抗的的类类型型及及后后继继检检测测方方案案的的要要求求，其其中中如如何何根根据据一一抗抗的的种种属属来来源源和和类类型型选选择择二抗尤为重要。二抗尤为重要。1 1、一抗的种属来源：、一抗的种属来源：二二抗抗应应选选用用与与使使用用的的一一抗抗相相同同的的物物种种来来源源，例例如如：如如果果你你的的一一抗抗是是小小鼠鼠源源的的单单克克隆隆抗抗体体，二二抗抗则则选选抗抗小小鼠鼠的的二二抗抗（山山羊羊抗抗小小鼠鼠或或者者兔兔抗抗小小鼠鼠等等均均可可）；如如果果一一抗抗是是从从兔兔血血清清里里制制备备的的兔兔源源多多克克隆隆抗抗体体，则则相相应应的的二二抗抗需需要要选选择择抗抗兔兔的的二二抗抗。即即根根据据一一抗抗的的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。物种来源选择相应的抗该物种的二抗。1 1、一抗的种属来源：、一抗的种属来源：常用的二抗产品包括：常用的二抗产品包括：抗抗 小小 鼠鼠 二二 抗抗（anti-mouseanti-mouse）、抗抗 兔兔 二二 抗抗（anti-rabbitanti-rabbit）、）、抗抗 山山 羊羊 二二 抗抗（anti-goatanti-goat）、抗抗 绵绵 羊羊 二二 抗抗（anti-sheepanti-sheep）、）、抗抗 人人 二二 抗抗（anti-humananti-human）、抗抗 豚豚 鼠鼠 二二 抗抗（anti-guinea piganti-guinea pig）抗抗大大鼠鼠二二抗抗（anti-ratanti-rat）、抗抗猪猪二二抗抗（anti-anti-swineswine）、）、抗抗马马二二抗抗（anti-horseanti-horse）、抗抗牛牛二二抗抗（anti-anti-bovinebovine）、）、抗抗 鸡鸡 二二 抗抗（anti-anti-chickenchicken）、抗抗 鸭鸭 二二 抗抗（anti-duckanti-duck）等。）等。2 2、一抗的类别亚型：、一抗的类别亚型：除除了了要要与与一一抗抗的的种种属属来来源源相相一一致致，二二抗抗还还需需与与一一抗抗的的类类别别或或亚亚类类相相匹匹配配，这这通通常常是是针针对对单单克克隆隆抗抗体体而而言言。一一般般来来说说多多克克隆隆抗抗体体主主要要是是IgGIgG类类免免疫疫球球蛋蛋白白，因因此此相相应应的的二二抗抗就就是是抗抗IgGIgG抗抗体体。而而单单克克隆隆抗抗体体则则相相对对复复杂杂些些，由由于于单单克克隆隆抗抗体体有有不不同同的的类类别别和和亚亚型型，因因此此相相应应的的二二抗抗也也需需要要根根据据这这些些亚型进行选择。亚型进行选择。2 2、一抗的类别亚型：、一抗的类别亚型：单单克克隆隆抗抗体体的的类类别别及及亚亚类类通通常常会会在在产产品品说说明明书书中中都都会会有有描描述述，如如果果一一抗抗是是小小鼠鼠IgMIgM，那那么么相相应应的的二二抗抗就就应应当当是是抗抗小小鼠鼠IgMIgM。如如果果单单克克隆隆一一抗抗是是小小鼠鼠IgGIgG的的某某一一亚亚类类（IgG1IgG1，IgG2aIgG2a，IgG2bIgG2b，IgG3IgG3），那那么么几几乎乎所所有有的的抗抗小小鼠鼠IgGIgG都都可可以以与与之之结结合合，或或者者您您也也可可以以选选择择专专门门针针对对这这一一亚亚类类的的二二抗抗，例例如如，如如果果一一抗抗是是小小鼠鼠IgG1IgG1，那那么么可可以以选选择择抗抗IgG1IgG1的的二二抗抗，此此种种抗抗体体在在双双标标记记实实验验中尤其适合。中尤其适合。2 2、一抗的类别亚型：、一抗的类别亚型：在在不不清清楚楚一一抗抗为为何何种种类类/亚亚类类的的情情况况下下，可可以以选选用用抗抗相相应应物物种种IgGIgG。这这类类型型的的二二抗抗有有通通用用的的IgGIgG（H+LH+L）二二抗抗，或或者者特特异异性性只只结结合合IgMIgM的的Anti Anti IgM IgM（mumu）AntibodyAntibody、IgAIgA的的Anti Anti IgA IgA（alphaalpha）AntibodyAntibody、IgEIgE的的Anti IgE Anti IgE（epsilonepsilon）Antibody Antibody等等。由由于于在在选选择择二二抗抗的的时时候候要要综综合合考考虑虑一一抗抗的的类类型型及及后后继继检检测测方方案案的的要要求求，因因此此除除了了需需要要考考虑虑一一抗抗的的种种属属及及类类型型外外，还还需需要要根根据据后后继继的的检检测测方方案案选选择择不不同同标标记记的的二二抗抗，因此需要对二抗的标记物进行选择。因此需要对二抗的标记物进行选择。按按照照标标记记分分，有有HRPHRP、APAP、生生物物素素等等标标记记二二抗抗，FITCFITC、TRITCTRITC、RhodamineRhodamine、Cy3/5Cy3/5、DylightDylight等等荧荧光光二二抗抗；按按照照检检测测物物种种分分，有有抗抗人人、大大鼠鼠、小小鼠鼠、猪猪、驴驴、绵绵羊羊、山山羊羊、小小鸡鸡、马马、兔兔、仓仓鼠鼠、狗狗、牛牛，以以及及多多种种细细菌菌类类二二抗抗；另另外外，还还有有IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM以以及及IgGIgG（FcFc）、IgGIgG（abab）2 2等等不不同同类类型型抗抗体。体。3 3、二抗的种属来源、二抗的种属来源 一一般般来来说说，不不同同的的种种属属来来源源与与二二抗抗的的质质量量没没有有必必然然的的联联系系，来来源源于于山山羊羊的的二二抗抗与与来来源源于于驴驴的的二二抗抗在在一一般般的的实实验验里里没没有有太太多多的的差差别别。然然而而在在一一些些特特殊殊的的实实验验里里，如如双双标标实实验验里里，如如果果其其中中一一个个一一抗抗是是山山羊羊来来源源的的，一一个个是是小小鼠鼠来来源源的的，则则相相应应的的二二抗抗分分别别要要抗抗山山羊羊和和抗抗小小鼠鼠的的二二抗抗，这这时时候候，二二抗抗就就不不能能选选择择山山羊羊或或者者小小鼠鼠来来源源的的。驴驴来来源源的的二二抗抗，非非常常适适合合做做类类似似双双标标的的免免疫疫实实验。验。4 4、二抗的耦联标记、二抗的耦联标记 一一般般来来讲讲，耦耦联联到到二二抗抗上上的的探探针针主主要要有有酶酶、荧荧光光基基团团、生生物物素素、金金颗颗粒粒。选选用用哪哪种种探探针针的的二二抗抗主主要要取取决决于于具具体体的的实实验验。对对于于Western Western BlotBlot和和ELISAELISA，最最常常用用的的二二抗抗是是酶酶标标二二抗抗；而而细细胞胞或或组组织织标标记记实实验验（细细胞胞免免疫疫化化学学，组组织织免免疫疫化化学学，流流式式细细胞胞术术）中中通通常常使使用用荧荧光光基基团团标标记记的的二二抗抗，免免疫疫组组化化中中也也可可以以使使用用辣辣根根过过氧氧化化酶酶或或碱碱性性磷磷酸酸酶酶标标记记的的二二抗抗。如如果果想想要要更更大大程程度度的的放放大大检检测测信信号号，可可以以使使用用Biotin/AvidinBiotin/Avidin（生生物物素素-亲亲和和素素）检检测测系系统统。在在一一些些荧荧光光检检测测方方案案中中，则则需需要要选选择择不不同同的的荧荧光光标标记记；而而金金颗颗粒粒标标记记的的二二抗抗则则更更多多的的应应用用于于免免疫疫电电镜镜中。中。5、是否经过血清吸附过的二抗 为减少二抗与样本的非特异性结合，需为减少二抗与样本的非特异性结合，需使用不同血清吸附的二抗。如检测样本是使用不同血清吸附的二抗。如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果对二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果对实验的特异性要求很高，推荐经过人血清实验的特异性要求很高，推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织（如经过人血清吸附而排除了与人源组织（如IgGIgG等）可能发生非特异性反应的等）可能发生非特异性反应的IgGIgG，因，因此将非特异性结合降低到最低。此将非特异性结合降低到最低。6、Anti-IgG还是还是Anti-IgG,F（ab）2 fragment在在一一些些如如胸胸腺腺、脾脾脏脏、血血液液的的组组织织以以及及造造血血细细胞胞、淋淋巴巴细细胞胞、B B细细胞胞等等细细胞胞内内，通通常常含含有有较较多多的的FcFc受受体体，这这时时候候选选择择二二抗抗时时最最好好选选择择Anti-IgG,Anti-IgG,F F（abab）2 2 fragmentfragment这这样样的的特特异异性性二二抗抗，这这样样就就消消除除了了由由于于FcFc部部分分与与IgGIgG的的非非特特异异性性结结合合。常常规规的的Anti-IgG Anti-IgG（H+LH+L）二二抗抗与与IgGIgG的的重重链链和和轻轻链链都都有有结结合合反反应应，即即与与IgGIgG的的FcFc的的F F（abab）2 2片片段段都都能能结结合合；由由于于IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA都都有有保保守守的的轻轻链链结结构构域域，因因此此Anti-IgG Anti-IgG（H+LH+L）与与它它们们都都有交叉反应。有交叉反应。而而Anti-IgG,Anti-IgG,F F（abab）2 2 fragmentfragment经经过过了了IgG IgG FcFc片片 段段 的的 吸吸 附附，因因 此此 只只 与与 IgGIgG的的F F（abab）2 2片片段段结结合合，然然而而IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA都都有有保保守守的的轻轻链链结结构构域域，因因此此与与它它们们也也有有交叉反应。交叉反应。7、Anti-IgG（H+L）、）、Anti-IgG（gamma）、）、Anti-IgM（mu）、）、Anti-IgA（alpha）在在一一些些特特殊殊的的实实验验里里，只只需需要要检检测测样样本本里里的的IgGIgG或或者者IgMIgM，常常规规的的Anti-IgG Anti-IgG（H+LH+L）由由于于与与IgGIgG的的重重链链和和轻轻链链都都有有结结合合反反应应，而而IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA都都有有保保守守的的轻轻链链结结构构域域，因因此此不不能能特特异异性性的的检检测测某某种种类类型型的的IgGIgG或或者者IgMIgM。这这时时候候就就需需要要针针对对特特殊殊类类型型IgIg分分子子的的二二抗抗。如如KPLKPL的的Anti-IgG Anti-IgG（gammagamma）二二抗抗是是由由Anti-IgGAnti-IgG（H+LH+L）与与IgMIgM、IgAIgA等等吸吸附附后后的的二抗，消除了能与后者结合的部分。二抗，消除了能与后者结合的部分。偶联到二抗上的探针种类二抗二抗探针探针酶酶辣根过氧化酶辣根过氧化酶HRPHRP碱性磷酸酶碱性磷酸酶APAP其衍生物其衍生物APAAPAPAAP，PAPPAP生物素生物素卵白素卵白素荧光基团荧光基团FITC,RRX,TR,PE,RhodamineWestern BlotELISA细胞免疫化学细胞免疫化学组织免疫化学组织免疫化学流式细胞术流式细胞术常见二抗的应用常见二抗的应用Western Blot组织免疫化学组织免疫化学 HRPHRP和和APAP是是酶酶，二二抗抗上上挂挂了了酶酶，要要给给相相应应的的底底物物才才能能显显色色，显显色色方方式式可可以以通通过过发发荧荧光光也也可可以以不不发发荧荧光光（例例如如给给予予ECLECL底底物物，其其中中的的H H2 2O O2 2和和鲁鲁米米诺诺在在HRPHRP的的作作用用下下，能能在在黑黑暗暗中中发发出出荧荧光光；也也可可以以给给予予双双氧氧水水和和DABDAB，反应产生棕色不溶于水的物质）。，反应产生棕色不溶于水的物质）。荧荧光光标标记记物物如如FITCFITC为为异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素，本本身身就就是是黄黄绿绿色色荧荧光光，二二抗抗结结合合后后可可直直接接在在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察；生生物物素素一一般般也也是是挂挂在在二二抗抗上上的的，利利用用卵卵白白素素分分别别连连接接生生物物素素标标记记的的第第二二抗抗体体和和生生物物标标记记的的酶酶，由由酶酶催催化化底底物物，生生成成终终产产物物，这这个个终终产产物物也也是是不不溶于水的。溶于水的。酶 主主要要有有两两种种不不同同的的酶酶耦耦联联物物，HRPHRP和和APAP。比比较较而而言言，前前者者更更经经济济、快快速速、稳稳定定，而而后后者者较较前前者者更更为为灵灵敏敏，通通常常情情况况下下，HRPHRP广广泛泛应应用用于于免免疫疫组组化化、western western blotblot和和ELISAELISA中中，而而碱碱性性磷磷酸酸酶酶（APAP）更更适适合合于于固固相相的的免疫检测实验，如免疫检测实验，如ELISAELISA和和western blot.western blot.异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明菁菁 类类 染染 料料藻红蛋白或藻胆色素蛋白藻红蛋白或藻胆色素蛋白A C M AA C M A荧光基团异硫氰酸荧光素异异 硫硫 氰氰 酸酸 荧荧 光光 素素-Fluorescein-Fluorescein Isothiocyanate Isothiocyanate（FITCFITC）荧光标记二抗）荧光标记二抗 FITCFITC纯纯品品为为黄黄色色或或橙橙黄黄色色结结晶晶粉粉末末，易易溶溶于于水水和和酒酒精精溶溶剂剂。FITCFITC分分子子量量为为389.4389.4，最最大大吸吸收收光光波波长长为为490490495nm495nm，最最大大发发射射光光波波长长为为520520530nm530nm，呈呈现现明明亮亮的的黄黄绿绿色色荧荧光光。FITCFITC在在冷冷暗暗干干燥燥处处可可保保存存多多年年，是是目目前前应应用用最最广广泛泛的的荧荧光光素素。由由于于FITCFITC是是小小分分子子化化合合物物，每每一一个个抗抗体体可可标标记记几几个个FITCFITC分分子子，IgMIgM通通常常用用小小分分子子的的荧荧光光素素标标记记，如如FITCFITC、Cy3/5Cy3/5、Texas Texas RedRed等等。FITCFITC荧荧光光二二抗抗主主要要优优点点是是人人眼眼对对黄黄绿绿色色较较为为敏敏感感，通通常常切切片片标标本本中中的的绿绿色色荧荧光光少少于于红红色色。然然而而FITCFITC的的最最大大缺缺点点是是淬淬灭灭快快，因因此此要要和和抗抗淬灭剂一起使用。淬灭剂一起使用。四甲基异硫氰酸罗丹明四四 甲甲 基基 异异 硫硫 氰氰 酸酸 罗罗 丹丹 明明-Tetramethyl-Tetramethyl Rhodamin Rhodamin IsothiocyanateIsothiocyanate（TRITCTRITC），Rhodamine Rhodamine Red-XRed-X（RRXRRX）,Texas Texas RedRed（TRTR）荧光标记二抗）荧光标记二抗 这这些些罗罗丹丹明明的的衍衍生生物物耦耦联联基基团团具具有有不不同同的的吸吸收收波波长长 （550,550,570,570,596nm596nm）和和最最大大发发射射波波长长（570,570,590,590,620nm620nm）。尽尽管管TRITCTRITC经经常常和和FITCFITC一一起起在在双双标标记记实实验验中中使使用用，使用使用RRXRRX和和TRTR可以得到更好的颜色区分。可以得到更好的颜色区分。四甲基异硫氰酸罗丹明 在在使使用用装装有有氪氪氩氩灯灯的的激激光光共共聚聚焦焦扫扫描描显显微微镜镜作作三三标标记记的的实实验验时时，RRXRRX尤尤其其有有用用，可可以以和和Cy2Cy2（或或者者FITCFITC）和和Cy5Cy5一一起起使使用用，因因为为RRXRRX的的发发射射波波长长在在Cy2Cy2和和Cy5Cy5中中间间，而而且且和和这这两两者者覆覆盖盖都都很很少少。氪氪氩氩灯灯激激发发光光为为488nm488nm，598nm598nm和和647nm647nm，分分别别是是Cy2Cy2（FITCFITC）,RRX,RRX和和Cy5Cy5的理想激发波长。的理想激发波长。四甲基异硫氰酸罗丹明 因因为为FITCFITC和和PEPE可可以以被被氩氩灯灯的的488nm488nm波波长长激激发发,在在流流式式细细胞胞仪仪中中用用FITCFITC作作双双标标，另另一一种种用用藻藻红红蛋蛋白白（PEPE）耦耦联联基基团团要要比比罗罗丹丹明明好好。TRITCTRITC为为罗罗丹丹明明的的衍衍生生物物，呈呈紫紫红红色色粉粉末末，较较稳稳定定。最最大大吸吸收收光光波波长长为为 550nm550nm，最最大大发发射射光光波波长长为为620nm620nm，呈呈现现橙橙红红色色荧荧光光，与与FITCFITC的的绿绿色色荧荧光光对对比比鲜鲜明明，可可配配合合用用于于双双重重标标记记或或对对比比染染色色。因因其其荧荧光光淬淬灭灭慢，也可用于单独标记染色。慢，也可用于单独标记染色。1Cy22Cy33Cy5菁类染料Cyanine dyes菁类染料菁类染料菁类染料 Cy2Cy2耦耦联联基基团团激激发发波波长长为为492nm492nm，发发光光为为波波长长510nm510nm的的绿绿色色可可见见光光。Cy2Cy2和和FITCFITC使使用用相相同同的的滤滤波波片片。由由于于Cy2Cy2比比FITCFITC在在光光下下更更稳稳定定。要要避避免免使使用用含含有有磷磷酸酸化化的的苯苯二二胺胺的的封封片片剂剂，因因为为这这种种抗抗淬淬灭灭剂剂和和Cy2Cy2反反应应，在在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。菁类染料 Cy3Cy3和和Cy5Cy5比比其其他他的的荧荧光光团团探探针针要要更更亮亮，更更稳稳定定，背背景景更更弱弱。Cy3Cy3耦耦联联基基团团激激发发光光的的最最大大波波长长为为550nm550nm，最最强强发发射射光光为为570nm570nm。因因为为激激发发光光和和发发射射光光波波长长很很接接近近TRITC,TRITC,在在荧荧光光显显微微镜镜中中，可可使使用用和和TRITCTRITC一一样样的的滤滤波波片。片。Cy3Cy3在在氩氩光光灯灯（514nm514nm或或528nm528nm）下下可可以以被被激激发发出出5050的的光光强强，在在氦氦氖氖灯灯（543nm543nm）或或者者汞汞灯灯（546nm546nm）下下则则约约7575。Cy3Cy3可可以以和和荧荧光光素素一一起起作作双双标标。Cy3Cy3还还可可以以和和Cy5Cy5一一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。起在共聚焦显微镜实验中作多标记。菁类染料 Cy5Cy5耦耦联联基基团团的的激激发发波波长长最最大大650nm650nm，发发光光波波长长最最大大670nm670nm。在在氪氪氩氩灯灯（647nm647nm）下下它它们们可可被被激激发发出出9898的的荧荧光光，在在氦氦氖氖灯灯下（下（633nm633nm）为）为6363。Cy5Cy5可可以以和和很很多多其其他他的的荧荧光光基基团团一一起起用用在在多多标标记记的的实实验验中中。由由于于它它的的最最大大发发射射波波长长在在670nm670nm，Cy5Cy5很很难难用用裸裸眼眼观观察察，而而且且不不能能用用汞汞灯灯作作理理想想的的激激发发。通通常常观观察察Cy5Cy5时时采采用用具具有有合合适适激激发发光光和和远远红红外外检检测测器器的的共共聚聚焦焦显显微微镜镜。在在水水相相封封片片剂剂中中应应当当加加入入抗抗淬淬灭灭剂剂。使使用用传传统统的的表表面面荧荧光光显显微微镜镜时时，不不推荐使用推荐使用Cy5Cy5。藻红蛋白或藻胆色素蛋白藻藻 红红 蛋蛋 白白 或或 藻藻 胆胆 色色 素素 蛋蛋 白白(Phycoerythrin,PE(Phycoerythrin,PE）荧光标记二抗）荧光标记二抗 存存在在于于被被称称为为藻藻红红的的多多聚聚微微粒粒中中，位位于于叶叶绿绿素素的的反反应应中中心心，在在自自然然结结构构中中，藻藻红红蛋蛋白白吸吸收收光光能能，吸吸收收后后转转化化成成能能量量，供供其其发发育育生生长长。当当藻藻红红蛋蛋白白被被分分离离和和纯纯化化后后，其其蛋蛋白白质质变变得得具具有有很很强强的的荧荧光光，能能吸吸收收不不同同波波长长的的光光，发发出出亮亮红红色色的的荧荧光光，此此时时不不再再接接受受任任何何外外来来的的光光，也也不不能能转转移移光光能。能。藻红蛋白或藻胆色素蛋白 藻藻红红蛋蛋白白PEPE的的吸吸收收波波长长范范围围较较广广，最最大大的的吸吸收收波波长长为为566nm566nm，最最大大的的发发射射波波长长为为574nm574nm。藻藻红红蛋蛋白白作作为为荧荧光光标标记记物物具具有有以以下下优优点点：首首先先具具有有强强的的长长波波长长激激发发和和发发射射荧荧光光，可可避避免免来来自自其其他他生生物物材材料料荧荧光光的的干干扰扰；并并且且具具有有极极高高的的发发射射量量子子产产率率；另另外外PEPE具具有有非非常常高高的的水水溶溶性性而而且且与与许许多多生生物物学学或或合合成材料的多位点稳定交联。成材料的多位点稳定交联。AMCAAminomethylcoumarin Acetate Aminomethylcoumarin Acetate（AMCAAMCA）耦耦联联的的AMCAAMCA吸吸收收光光波波长长最最大大为为350nm350nm，发发荧荧光光则则为为450nm450nm。对对于于荧荧光光显显微微镜镜来来说说，AMCAAMCA可可以以用用汞汞灯灯来来激激发发，用用紫紫外外滤滤板板来来观观察察。由由于于AMCAAMCA的的信信号号相相对对较较弱弱，单单标标实实验验中中不不推推荐荐使使用用AMCAAMCA。AMCAAMCA和和荧荧光光素素的的荧荧光光波波长长只只有有很很小小的的重重叠叠范范围围，而而和和发发出出长长波波长长荧荧光光的的荧荧光光基基团团没没有有或或者者只只有有极极少少的的重重叠叠，因因此此它它最最常常用用于于多多标标记记实实验验中中，比比如如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。免疫荧光显微镜和流式细胞仪。AMCA 由由于于人人眼眼不不能能很很好好的的检检测测蓝蓝色色荧荧光光，在在多多标标记记的的实实验验中中，AMCAAMCA耦耦联联的的二二抗抗应应当当被被用用于于检检测测大大量量的的抗抗原原。AMCAAMCA和和荧荧光光素素一一样样很很快快淬淬灭灭，使使用用抗抗淬淬灭灭剂剂可可以以减减轻轻。且且由由于于肉肉眼眼不不能能很很好好的的检检测测AMCAAMCA所所激激发发的的蓝蓝色色荧荧光光，因因而而AMCAAMCA耦耦联联的的二二抗抗更更适适用用于于检检测测大大量量存存在在的的抗抗原原。如如果果使使用用在在流流式式细细胞胞仪仪中中，AMCAAMCA可可以以用用汞汞灯灯或或者者水水冷冷却却的的氩氩光光灯灯激激发发，因因为为它它们们发发出出的的光光线线是是在在光光谱谱的的紫外区。紫外区。荧光素根据其发射波长可分为：499nm=700nm=700nm远红外荧光（远红外荧光（Far-Far-RedRed）菁类染料（菁类染料（Cy2,Cy3,Cy5）TRITC,RRX,TRFITC AMCA小 结TRITC经经常常和和FITC一一起起用用于于双双标标记记实实验验中中，也也可可以以使使用用RRX或或TR，但但TR会会产产生生较较高高的的背背景景。在在使使用用装装有有氪氪氢氢灯灯的的激激光光共共聚聚焦焦扫扫描描显显微微镜镜作作三三标标记记实实验验时时，RRX尤尤其其有有用用，可可以以和和Cy2（或或FITC）及及Cy5一一起起使使用用，因因为为RRX的的发发射射波波长长在在Cy2和和Cy5中中间间，且且和和这这两者的重叠很少。两者的重叠很少。常常用用在在多多标标记记实实验验中中（免免疫疫荧荧光光、流流式式细细胞胞术术），其其缺缺点点是是，淬淬灭灭快快，所所激激发发的的蓝蓝色色荧荧光光，肉肉眼眼不不能能很很好好的的检检测测。因因而而更更适适用于检测大量存在的抗原。用于检测大量存在的抗原。Cy2比比FITC更更稳稳定定，且且在在表表面面荧荧光光显显微微镜镜下下，Cy2的的荧荧光光FITC更更强强。Cy3和和Cy5比比大大多多基基团团更更亮亮，更更稳稳定定，背背景景更更弱弱，常常在在共共聚聚焦焦显显微微实实验验中中作作多多标标记记。但但Cy5不不能能用用表表面面荧荧光光显显微微镜镜观观察察，用用有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。FITC是是广广泛泛使使用用的的荧荧光光基基团团但但其其最最大大的的缺缺点点是是淬淬灭灭快快使使用用抗抗淬淬灭灭剂剂可可以以减减轻轻。PE常常和和FITC一一起起用用于于流流式式细细胞胞术术双双标标记实验记实验!NOTE!由由于于观观察察荧荧光光需需要要一一定定波波长长的的激激发发光光，必必须须根根据据实实验验室室已已有有的的仪仪器器可可发发光光的的波波段段进进行行选选择择。另另外外，多多标标记记中中对对探探针针色色彩彩区区分分 程程 度度 的的 要要 求求。例例 如如，若若 丹丹 明明 红红-X-X（RRXRRX）和和德德克克萨萨斯斯红红（TRTR）荧荧光光素素的的区区别别就就比比四四甲甲基基若若丹丹明明（TRITCTRITC）或或者者Cy3Cy3的的区区别别明明显显。如如果果对对灵灵敏敏度度有有更更高高的的要要求求，则则Cy3Cy3和和Cy5Cy5就比其他的荧光团探针要亮。就比其他的荧光团探针要亮。由由于于存存在在货货期期，尽尽量量推推荐荐客客户户在在试试验验设设计计时时就就选选择择好好抗抗体体，如如试试验验中中间间需需要要更更换换，尽尽早早定定货货，以以免免耽耽误误试试验验进进程程、影影响响结果。结果。生物素 生生物物素素（biotinbiotin）可可以以和和抗抗生生素素蛋蛋白白/链链酶酶亲亲和和素素（avidin/streptavidinavidin/streptavidin）发发生生不不可可逆逆反反应应而而紧紧密密结结合合在在一一起起。首首先先加加入入生生物物素素标标记记的的二二抗抗，在在加加入入耦耦联联有有酶酶或或荧荧光光集集团团的的avidinavidin或或streptavidinstreptavidin，后后者者能能够够结结合合于于二二抗抗表表面面的的多多个个位位点点上上，从从而而极极大的放大检测信号。大的放大检测信号。生物素 WBWB最最好好是是HRPHRP标标记记的的二二抗抗（即即辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶），因因为为如如果果用用生生物物素素标标记记二二抗抗的的话话，还还要要再再加加三三抗抗（HRPHRP标标记记），那那样样又又要要洗洗膜膜，又又要要三三抗抗孵孵育育，这这样样时时间间又又要要延延长长将将近近两两个个小小时。时。如何搭配流式抗体荧光标记流流式式细细胞胞仪仪能能检检测测多多少少个个通通道道是是由由有有多多少少根根激激光光决决定定的的以以及及每每根根激激光光的的功功能能决决定定的的，所以首先需要注意两点：所以首先需要注意两点：流流式式细细胞胞仪仪有有哪哪些些激激光光。比比如如标标配配的的FACSCaliburFACSCalibur只只有有一一根根488nm488nm的的激激光光，能能做做FL1FL1、FL2FL2、FL3FL3三三个个荧荧光光通通道道/三三个个颜颜色色，而而选选配配的的Calibur Calibur(FACSCalibur(FACSCalibur的的简简称称)配配有有488nm488nm和和635nm635nm两两根根激激光光，可可以以检检测测FL1-FL1-FL4FL4四个通道四个通道/4/4个颜色。个颜色。不不同同型型号号的的流流式式细细胞胞仪仪的的同同样样的的一一个个通通道道检检测测荧荧光光素素的的能能力力是是不不一一样样的的，比比如如CaliburCalibur的的FL3FL3（第第3 3通通道道）能能检检测测PE-Texas PE-Texas Red,Red,PE-Cy5,PE-Cy5,PerCP,PerCP,PerCPCy5.5,PE-PerCPCy5.5,PE-Cy7,Cy7,而而 AriaAria的的 第第 3 3通通 道道 只只 能能 检检 测测 PE-PE-TexasRed,TexasRed,PE-Cy5,PE-Cy5,PerCPPerCP。CaliburCalibur第第3 3通通道道能能检检测测的的PerCP-Cy5.5PerCP-Cy5.5在在FACSAriaFACSAria上上是是第第4 4通通道道检检测测。CaliburCalibur和和LSRLSR都都能能检检测测4 4个个颜颜色，但是第色，但是第4 4个通道检测荧光素是不一样的。个通道检测荧光素是不一样的。搭配荧光素原则搭配流式荧光素有搭配流式荧光素有2 2个原则：个原则：1 1、每每个个通通道道只只能能选选择择1 1种种荧荧光光素素；各各个个通通道道之之间间的的荧荧光光素素可可以以随随意意搭搭配配，但但需需注注意意1 1、每每个个通通道道只只能能选选择择1 1种种荧荧光光素素。以以CaliburCalibur为为例例说说明明，CaliburCalibur的的FL1FL1通通道道选选择择了了FITCFITC就就不不能能选选择择AlexaFluro488AlexaFluro488，或或者者选选择择了了Alexa Fluro488Alexa Fluro488就不能选就不能选FITCFITC CaliburCalibur的的FL3FL3通通道道尽尽管管能能检检测测PE-Texas PE-Texas Red,Red,PE-Cy5,PE-Cy5,PerCP,PerCP,PerCP-Cy5.5,PerCP-Cy5.5,PE-PE-Cy7Cy7五五个个荧荧光光素素，但但是是我我们们搭搭配配的的时时候候只只能能选择其中选择其中1 1个。个。2 2、各各个个通通道道之之间间的的荧荧光光素素可可以以随随意意搭搭配配：如如果果客客户户的的流流式式细细胞胞仪仪能能做做4 4个个通通道道，在在第第1 1个个原原则则之之下下，那那么么每每个个通通道道随随便便选选出出1 1个个荧荧光光素素就就可可以以组组合合成成4 4个个颜颜色色。以以2 2跟跟激激光光的的CaliburCalibur为为例例，CaliburCalibur各各个个荧荧光光素素之之间间可可以以搭搭配配出出1616种种组组合合。比比如如常常用用的的搭搭配配是是F F I I T T C(C(F F L L 1 1)P P E E（F F L L 2 2）PerCPPerCP（FL3FL3）+APC(FL4),+APC(FL4),这这个个搭搭配配组组合合可可以以更更改改成成Alex Alex Fluro(FL1)Fluro(FL1)PEPE（FL2FL2）PerCPPerCP（FL3FL3）+APC(FL4),+APC(FL4),或或者者FITC(FL1)FITC(FL1)PEPE（FL2FL2）PerCPPerCP（FL3FL3）+Alex+Alex Fluro(FL4)Fluro(FL4)，或或者者FITC(FL1)FITC(FL1)PEPE（FL2FL2）PE-Cy5PE-Cy5（FL3FL3）+APC(FL4)+APC(FL4)等等等等。总总之之，在在第第1 1原原则则之之下下，我我们们可可以以随随意意搭搭配配和和组组合合各各个个荧荧光光素素。但但是是需需要要注注意意的的是是，APCAPC和和PE-Cy5PE-Cy5一一起起使使用用的的话话，上上流流式式以以后后，容容易易导致补