SN∕T 5363-2022 鲤浮肿病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 53632022鲤浮肿病检疫技术规范Quarantine protocol for Carp edema virus disease2022-03-14 发布2022-10-01 实施ICS 11.220CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布中华人民共和国出入境检验检疫中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：[phone]-7530网址 8801230 1/16 印张 0.75 字数 21 千字2022 年 9 月第一版 2022 年 9 月第一次印刷印数 1500书号：155175322 定价：16.00 元鲤浮肿病检疫技术规范行 业 标 准SN/T 53632022*SN/T 53632022I前 言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国杭州海关、河南省水产技术推广站。本文件主要起草人： 温智清、贾鹏、郑晓聪、王津津、徐慧 、杨雪冰、李旭东、何俊强、刘荭、史秀杰、兰文升、于力、刘莹、杨锦舜、王飞。1SN/T 53632022鲤浮肿病检疫技术规范1 范围本文件规定了鲤浮肿病的 Nested PCR 和实时荧光 PCR 检测方法。本文件适用于鲤浮肿病的流行病学调查、监测、诊断和进出境检疫。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。CEVD ：鲤浮肿病（Carp edema virus disease） ；CEV ：鲤浮肿病毒（Carp edema virus） ；PCR ：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） ；Ct ：循环阀值（cycle threshold） ；CTAB ：十六烷基三甲基溴化胺（Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide） ；DNA ：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） ；dNTPs ：脱氧核糖核苷酸（Deoxynucleotide Triphosphates） ；EB ：溴化乙锭（Ethidiumbromide） 。4 设备和器械4.1 普通冰箱和 -80 超低温冰箱。4.2 制冰机。4.3 二级生物安全柜。4.4 无菌组织研磨器。4.5 冷冻高速离心机。4.6 PCR 仪。4.7 实时荧光 PCR 仪。2SN/T 536320224.8 水平电泳仪。4.9 凝胶成像仪。4.10 高压灭菌锅。4.11 不同规格微量移液器，量程包括 0.5 mL10 mL、10 mL100 mL、100 mL1000 mL。4.12 剪刀、镊子、酒精棉球、离心管和 PCR 管等耗材。5 试剂5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。5.2 磷酸盐缓冲液（见附录 A.1） 。5.3 CTAB 溶液（见附录 A.2） 。5.4 抽提液 1（见附录 A.3） 。5.5 抽提液 2（见附录 A.4） 。5.6 无水乙醇，分析纯。5.7 TE 缓冲液（见附录 A.5） 。5.8 10PCR 扩增缓冲液（见附录 A.6） 。5.9 Tap 酶：-20 保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。5.10 dNTPs ：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。5.11 TEB 电泳缓冲液（见附录 A.7） 。5.12 溴化乙啶（见附录 A.8） 。5.13 6 上样缓冲液（见附录 A.9） 。5.14 2 实时荧光 PCR 预混液（见附录 A.10） 。5.15 Nested PCR 用引物，浓度为 20 mol/L，序列如下：CEV For B: 5-ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG-3CEV Rev J2: 5-CCTCATCCAAATTACGTAGTAAAG-3第一步 PCR 扩增产物为 493 bp 大小的片段。CEV ForB-int: 5-GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG-3CEV RevJ-int3: 5-GTTGATACAATTCCAGAGCAAG-3第二步 PCR 扩增产物为 426 bp 大小的片段。5.16 实时荧光 PCR 用引物和探针：浓度为 10 mol/L，序列如下：CEV-qf ：5-AGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC-3CEV-qr ：5-GATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA-3探针 : 5-FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ-36 临床症状发病鱼游动迟缓，在水面漫游或在池塘边缘静置不动，游动时失去平衡或沉于池底侧睡，当受到惊吓等刺激时，病鱼立即游动，但很快又处于昏睡状态（其他参见附录 B） 。7 采样采样对象包括健康的、发病的和濒死的锦鲤和鲤等鲤科鱼类，采样数量按照 GB/T 18088 规定执行。鳃是 CEV 的靶器官，脑、脾、肾、心脏和肠道也可作为采样组织器官，但肝脏除外。体长 4 cm 的鱼苗取整条鱼；4 cm6 cm 的鱼苗取所有内脏（含肾脏和鳃） ；体长 6 cm 的鱼取鳃 ( 用酒精3SN/T 53632022棉球去除鳃表面黏液 )、脑、肾和脾。样品采集后，应尽快送到检疫实验室，一般不超过 24 h。若条件有限，发病鱼可取靶器官并浸泡至 80 %100 % 乙醇中保存，运送至检疫实验室。8 诊断方法8.1 Nested PCR 方法8.1.1 设立对照从提取样品 DNA 起，均需设立阳性对照、阴性对照和空白对照。取已知含有 CEV 的病鱼组织作为阳性对照；取健康鱼组织作为阴性对照；取等体积的无菌去离子水作为空白对照。8.1.2 核酸提取（CTAB 法）无菌条件下，将取得的组织在无菌研钵进行匀浆，计重后用预冷的磷酸盐缓冲液以 15（w/v）将组织重悬，4 、8 000 r/min 离心 5 min，取上清液待检。取 450 L 组织悬液加入 1.5 mL 的离心管，加 450 L CTAB 溶液，充分混匀，25 水浴作用 2.5 h。向离心管中加 600 L 抽提液 1，剧烈震荡混匀 30 s 以上，12 000 r/min 离心 5 min。取上层水相（约800 L） 至新的离心管，加700 L抽提液2，震荡混匀30 s。 12 000 r/min离心5 min。 小心取上层水相 （约600 L）至新的离心管，加入 1.5 倍体积的预冷无水乙醇（约 900 L） ，上下颠倒混匀后，-20 沉淀核酸 2 h 以上。12 000 r/min 离心 30 min，弃上清液。将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥 30 min。向DNA 沉淀中加 50 mL TE 缓冲液，-20 保存备用。可使用同等效果的商品化核酸提取试剂盒代替以上方法。8.1.3 第一步 PCR 反应在反应管中加入 10PCR 扩增缓冲液 5 L、上下游引物（20 mol/L） 各 1 L、dNTP（10 mmol/L）1 L、Taq 酶（5 U/L）1 L，DNA 模板 5 L，加双蒸水至总体积 50 L。将反应管瞬时离心后，置于 PCR 仪。反应条件为：95 预变性 5 min ；95 变性 1 min，55 退火 1 min，72 延伸 30 s，35 次循环；72 再延伸 10 min。第一步反应结束后可先将 PCR 产物进行电泳分析，若出现 493 bp 大小目的条带，可直接进行测序分析，否则需进行第二步 PCR 反应。8.1.4 第二步 PCR 反应在反应管中加入 10PCR 扩增缓冲液 5 L、上下游引物（20 mol/L） 各 1 L、dNTP（10 mmol/L） 1 L、Taq 酶（5 U/L） 1 L，第一步扩增产物 5 L，加双蒸水至总体积 50 L。将反应管瞬时离心后，置于 PCR 仪。反应条件为：95 预变性 5 min ；95 变性 1 min，55 退火 1 min，72 延伸 30 s，35 次循环；72 再延伸 10 min。8.1.5 琼脂糖凝胶电泳用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5 % 的琼脂糖（含 0.5 g/mL EB）凝胶板。将其放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚盖过胶面。取 5 L PCR 产物和 1 L 6上样缓冲液混匀后加入样品孔，5 V/cm 电泳约 30 min，将凝胶置于凝胶成像仪观察结果。可使用同等效果的其他方法，例如毛细管电泳分析仪。4SN/T 536320228.1.6 测序对 PCR 扩增产物出现 493 bp 或者 426 bp 特异性条带进行基因序列测定，并将测序结果与参考序列（参见附录 C）或 Genbank 中 CEV 基因序列进行序列同源性分析。8.1.7 结果判定8.1.7.1 被检样品结果的判定均建立在阳性对照、空白对照和阴性对照成立的基础之上。8.1.7.2 被检样品经 Nested PCR 检测有 493 bp 或者 426 bp 特异性条带，测序结果与参考序列或Genbank 中 CEV 基因序列相符且同源性大于等于 98%，判定为 Nested PCR 检测结果阳性。8.1.7.3 被检样品经 Nested PCR 检测均未扩增出目的条带或者虽有目的条带，但测序结果与参考序列或 Genbank 中 CEV 基因序列同源性低于 98%，则判定 Nested PCR 检测结果阴性。8.2 实时荧光 PCR 方法8.2.1 设立对照同 8.1.1。8.2.2 核酸提取同 8.1.2。8.2.3 反应体系2 实时荧光 PCR 预混液 10 L，上游引物（10 mol/L）0.5 L，下游引物（10 mol/L）0.5 L，探针（10 mol/L）0.5 L，ROX Reference Dye II （50）1 L，模板 DNA 2.5 L，双蒸水 5 L，总体积 20 L。可使用其他等效的荧光 PCR 试剂盒代替以上方法。8.2.4 反应条件将反应管瞬时离心后，置于实时荧光 PCR 仪。条件如下：95 10 min ；95 30 s，60 45 s，40 次循环。8.2.5 结果判断8.2.5.1 被检样品结果的判定均建立在阳性对照、空白对照和阴性对照成立的基础之上。当阳性对照出现典型扩增曲线且 Ct 值 35，空白对照和阴性对照无 Ct 值无扩增曲线，实验成立。若对照组不成立，应更换试剂盒和对照样品重新实验。8.2.5.2 被检样品出现典型扩增曲线且 Ct 值 35，可判定实时荧光 PCR 方法检测结果阳性；被检样品无 Ct 值无扩增曲线，可判定实时荧光 PCR 方法检测结果阴性。8.2.5.3 被检样品 35 Ct 值 40，应增加模板浓度重新实验。重新实验后，若被检样品 Ct 值 35，则判定为实时荧光 PCR 方法检测结果阴性；若被检样品出现典型扩增曲线且 Ct 值 35，则判定为实时荧光 PCR 方法检测结果阳性。9 综合判定实时荧光 PCR 方法或 Nested PCR 方法检测结果阳性，判定为 CEVD 阳性。5SN/T 53632022附 录 A （规范性） 试剂及配制A.1 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2）每升蒸馏水中加入氯化钠 8 g、氯化钾 0.2 g、碳酸氢钠 1.15 g、磷酸二氢钾 0.2 g，经 121 、 15 min 高压灭菌，4 备用。A.2 CTAB 溶液NaCl 8.19 gEDTA 0.744 gTri-HCl 1.12 g超纯水 60 ml充分混匀后，用盐酸调节溶液 pH 值至 7.58.0，加入 CTAB 2 g，充分搅拌溶解，用超纯水定容至终体积 100 mL。使用前加巯基乙醇至终浓度为 0.25 %。A.3 抽提液 1酚 / 氯仿 / 异戊醇，用 1.0 mol/L pH（7.90.2）Tris 过饱和酚氯仿异戊醇按 25241 的比例混合，密闭避光保存。A.4 抽提液 2氯仿 / 异戊醇，将氯仿和异戊醇按 241 的比例混合，密闭避光保存。A.5 TE 缓冲液（pH 8.0）1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0） 10 ml0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 2 ml加入约 800 mL 的去离子水，均匀混合。溶液定容至 1 000 mL。高温高压灭菌后，4 保存。A.6 10PCR 扩增缓冲液KCl 500 mmol/LTrisCl（pH 8.3，室温） 100 mmol/LMgCl2 15 mmol/L明胶 0.1 %A.7 TBE 电泳缓冲液（10 倍浓缩液，pH 8.3）Tris 108 g硼酸 55 gNa2EDTA.2H2O 2.9 g加水定容至 1 000 mL用 5.00 mol/L 的 HCl 调 pH 至 8.3。6SN/T 53632022A.8 溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）用水配制成 10 mg/mL 的浓缩液。每 10 mL 琼脂糖溶液中加 1 L 溴化乙啶。A.9 6 上样缓冲液溴酚蓝 100 mg ，加双蒸水 5 mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖 25 g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50 mL，加入 NaOH 溶液 1 滴，调至蓝色。A.10 2 实时荧光 PCR 预混液为商业试剂。主要成分为 AmpliTaq Gold DNA Polymerase，UNG 酶，含有 dUTP 的 dNTPs，实时荧光 PCR buffer。可采用同等效果的其他试剂。SN/T 53632022附 录 B （资料性） 鲤浮肿病（CEVD）B.1 病原鲤浮肿病（Carp edema virus disease，CEVD） ，也称锦鲤昏睡病（Koi sleepy disease，KSD） ，是一种由鲤浮肿病毒（Carp edema virus，CEV） 引起鲤和锦鲤死亡的一种病毒性传染病。鲤浮肿病毒（Carp edema virus，CEV） ，隶属于痘病毒科（Poxviridae） ，其基因组为线性双链 DNA（dsDNA） 。病毒粒子大小约 200 nm400 nm。基于 CEV P4a 基因片段，将其分为基因型和型，基因型又可分为 a和 b 基因亚型。B.2 易感动物锦鲤和鲤。B.3 临床症状发病鱼游动迟缓，在水面漫游或在池塘边缘静置不动，游动时失去平衡或沉于池底侧睡，当受到惊吓等刺激时，病鱼立即游动，但很快又处于昏睡状态。发病鱼可见眼球凹陷、鳃坏死或溃疡、偶见体表出血。解剖可见病鱼肾脏肿大至鳔间隔、肠道出血、显微镜下可见鳃丝呈棒状。温度大幅下降和拉网等剧烈刺激均可能造成该病爆发或死亡率升高。发病时，锦鲤和鲤在临床症状上略有区别。除上述临床症状外，发病的鲤可见头盖骨凹凸不平、鱼唇和鼻间明显凹陷、体表浮肿。锦鲤主要表现为嗜睡。CEVD 与锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）均具有烂鳃、眼凹陷等相似的症状，且两者的发病水温又略有重叠。KHVD 的发病水温约为 20 30 ，而 CEVD 的发病水温较广，7 27 均可发病，临床上也存在两病共感染的现象。因此当鲤或锦鲤出现烂鳃等症状，并有高死亡率时，可同时进行 CEVD 和 KHVD 的检测，以确定病原。SN/T 53632022附 录 C （资料性） CEV 扩增产物序列C.1 Nested-PCR 扩增产物的参考序列（493 bp） ，CEV P4a 基因片段（5 3）ATGGAGTATCCAAAGTACTTAGATTAATGTTATCAATGAAATTTGTGTATTGTGTTTTTGTTAGTCCA CEV For B CEV For B-intAGAGTTTTCTTCTCATCGTTTGTTACCTTTTGTAGTTGTTTAATATTTGTGATAAGATTTCCATTAGCATAAAATCCTTCCCAAATTTGTGTTGATACATGTTTTAGTGTTTTGTAGATTGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGCAAGAAACAAACTCTCTTTACTGCAACTCCTTGAGGAATTTGATCTAGAATTCCACAGAATGTAATCTCAAATTTGTTTGTAGAGTTTTTGAAGTATACTGTTTCATCACACAATCCTAGAACTAGAGCAAGATTAGAAGTCATTGTCTTATCGAAGACATTCATCTTATTCCAATCATCAATCTGAATTCCTTTCCAGAACATAACATTTGCAATTTTAACTTGCTCTGGAATTGTATCAACATGTCCAATATCTTTCTTTACTACGTAATTTGGATGAGG CEV RevJ-int3 CEV Rev J2C.2 实时荧光 PCR 扩增产物的参考序列（76 bp）CEV P4a 基因片段（5 3）AGTTTTGTATATTGTAGCATTTCCTAGTTTGTATGGCAAGAAACAAACTCTCTTTACTGTAACTCCTT CEV qf 探针 CEV qrGAGGAATCSN/T 53632022书号：155175322定价： 16.00 元