DB65∕T 3597-2014 生鲜乳中布鲁氏菌PCR检测技术规程(新疆维吾尔自治区).pdf

ICS 67. 100.01 X16 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准DB 65/ T3597-2014 生鲜乳中布鲁氏菌PCR检测技术规程PCR oftechnical protocol for detection ofBrucella in raw milk 2014一03一01发布2014一05 一01实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布DB65/ T3597-2014 目IJ昌本标准按照GB/T1. 1一2009标准化工作导则第l部分:标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所院提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。本标准起草单位:新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所;新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院;新疆农业大学动物医学学院。本标准起草人:易新萍、钟旗、高帅、姚刚、马晓菁、叶锋、谷文喜、吐尔洪努尔、刘丽娅。I D865/ T3597-2014 生鲜乳中布鲁氏菌PCR检测技术规程范围本标准规定了检测生鲜乳中布鲁氏菌病原分离的术语、定义和缩略语、仪器、设备和试剂、生物安全措施、防污措施、检验方法的要求。本标准适用于生鲜乳中布鲁氏菌的分离及鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489试验室生物安全通用要求NY/T 1467-2007奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术SN/T 1942.1-2007进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法第1部分:分离与计数方法SN/T 1942.2-2007进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法第2部分PCR检验方法WS 269一2007布鲁氏菌病诊断标准WS/T 230-2002临床诊断中聚合酶反应技术的应用3 术语、定义和缩略语3. 1术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1. 1 布鲁氏菌CBrucella)布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、细胞内寄生菌，为小球杆状菌，革兰氏染色阴性，能引起人和多种动物的急性和慢性感染。3.1.2 生鲜乳CRawmilk) 指奶畜乳房中挤出的未经任何处理的乳汁。3. 1. 3 聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction, PCR) 聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断。3.1.4 D865/ T3597-2014 引物(prirner)应用化学方法合成一对与己知扩增基因片段两侧DNA序列互补的寡核昔酸，作为PCR扩增的片段。3. 1. 5 模板(ternplate)待扩增的靶DNA或RNA链。3.2缩略语下列缩略语适用于本标准。3. 2. 1 PCR:聚合酶链反应3.2.2 DNA:脱氧核糖核酸3.2.3 PCR rnix:聚合酶链反应混合物3.2.4 EB: 澳化乙绽3. 2. 5 ddH20: 灭菌双蒸水3.2.6 TAE:电泳缓冲液4 仪器、设备和试剂4. 1仪器和设备4.1.1 培养皿:直径90mrn 4. 1. 2 L型玻璃涂布棒4.1.3 接种环:直径3rnrn4.1.4 天平:量程2.0kg，感量O.1 g。4. 1. 5 CO2培养箱及常规恒温培养箱4.1.6 灭菌处理器具1.5 rnL离心管，0.2 rnLPCR反应管，微量移液器Tip头，50 rnL带盖塑料管。4.1.7 PCR扩增仪4.1.8 电泳仪4.1.9 可调微量移液器(10L-1000L)4. 1. 10紫外凝胶成像仪4. 1. 11显微镜4.2试剂4.2.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。4.2.2 布氏琼脂培养基(见附录A)。2 DB65/ T3597-2014 4.2.3 布鲁氏菌选择添加剂(见附录A)0 4.2.4 1XTAE电泳缓忡液(见附录A)。4.2.5 革兰氏染色液。4.2.6 0.85%灭菌生理盐水4. 2. 7 PCR mix (含Taq酶、dNTP、PCRbuffer、Mg2上样缓冲液)4.2.8 鉴定布鲁氏菌引物VirB-8 (F) 5 -ATGTTTGGACGCAAACAATCTC-3 VirB-8 (R) 5 -TCATTGCACCACTCCCATTTCT一3引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成浓度为10口mol/L。预计扩增目的片段719bp。4.2.9 质控菌株(使用以下一种即可):灭活的布鲁氏菌标准株如牛种布鲁氏菌A19、羊种布鲁氏菌M5和16M、猪种布鲁氏菌S2等。4.2.10 琼脂糖5 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测布鲁氏菌，所有培养物和废弃物应小心处置，应按照GB19489中的有关规定进行。6 防污措施参照WS/T230-2002中第6部分进行污染的预防和控制。7 检验方法7.1 样品准备采集哺乳动物新鲜原乳约(10-20)mL置于灭菌的带盖塑料管中。一200C冻存备用。7.2检验程序见图107. 3 检验步骤7.3.1 布鲁氏菌分离培养将冻融的生鲜乳混匀，用移液器取300L生鲜乳接种于含布鲁氏菌添加剂的布氏琼脂平板培养基上，分别置有氧条件和含(5-10)%二氧化碳的培养箱中3TC培养，3d后观察菌落生长情况。按表1观察菌落形态，做革兰氏染色并镜检。7.3.2 染色及镜检在上述平板上挑取疑似布鲁氏菌进行革兰氏染色并镜检。布鲁氏菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，呈红色，无运动性、无鞭毛、无芙膜、一般不形成芽抱，涂片多散在，边缘稍圆或直。3 D865/ T3597-2014 生量季乳 捧布于布即.庭培养基上去富培养j 合(卜10)争在C(13TC培I 1;事氧牵引车37t:培养，养3d:混察毒藩I 13d言观察萄臻可疑菌菇 茎兰泛染色E镜楼 由一部i!|守主I 在研由握主t 图1生鲜乳中布鲁氏菌PCR检测程序表1布鲁氏菌在TSA培养基上菌落特征培养基名称布鲁氏菌落特征布氏琼脂培形成半透明、圆形、表面光滑，边缘整齐、中央隆凸菌落，小的直径有O.5- 1. 0 rnrn，大的可有3-4rnrn，在透射光下平滑型菌落|养基CTSA)呈浅黄色光泽，在折射光下菌落呈蓝白色，略显乳白色。7.3.3 PCR检测在上述平板上挑取2、3个疑似布鲁氏菌分别置于含501生理盐水的灭菌的1.5 rnLEppendorf管中，1000C煮沸10rnin灭活，作为PCR模板备用。7.3.3.1 PCR反应体系:模板2此，引物各1LC 10 11 mol/L) , 2 XPCR rnix 25L，灭菌水H20至5011 L。4 D865/ T3597-2014 7.3.3.2 PCR反应程序:940C预变性10min; 940C变性30s, 550C退火30s, 720C延伸30s, 30个循环720C延伸10mino 7.3.4质控检验过程中要设阳性对照、阴性对照、空白对照。分别以灭活的布鲁氏菌标准菌株作为布鲁氏菌阳性对照，大肠杆菌作为阴性对照，灭菌水作为空白对照。7.3.5 电泳7.3.5.1 制板1%琼脂糖凝胶板的制备。称取1.0 g琼脂糖放入100mL1XTAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至600C左右时加入10mg/mL澳化乙绽(EB)(3，-.，5)L， 均匀铺板，厚度为(3，-.，5) mm。7.3.5.2 加样:PCR反应结束，取PCR扩增产物各5L(包括被检样品、阳性对照、空白对照、DL2000DNA分子质量标准5L、上样缓冲液111L进行琼脂糖凝胶电泳。7.3.5.3 电泳条件:电压为(5080)V，电泳30min。7.3.5.4 凝胶成像仪观察:扩增产物电泳结束后，用凝胶成像仪观察检测结果，拍照、记录实验结果。7.4 PCR实验结果判定7.4.1 将PCR扩增产物电泳后用凝胶成像仪观察，DNA分子质量标准、阳性对照、阴性对照、空白对照为如下结果时试验方成立，否则应重新试验。DL2000DNA分子质量标准电泳道，从上到下依次出现2000 bp、1000bp、750bp、500bp、250 bp、100bp6条清晰的带。阳性对照电泳道出现一条719bp清晰的带。空白对照和阴性对照电泳道均不出现任何带。7.4.2 被检样品PCR检测结果判定在同一块凝胶板上电泳后，当DNA分子质量标准、各组对照同时成立时，被检样品电泳道出现一条719bp的带，判为布鲁氏菌阳性(+);被检样品电泳道未出现大小为719bp的带，则判为阴性(一。结果判定参见附录C图1。7. 5报告结果表述当阴性对照、阳性对照和空白对照PCR反应均成立条件下，被检样品分离的菌革兰氏染色为阴性菌，PCR扩增产物电泳检测结果为阳性，报告该生鲜乳中检出布鲁氏菌。被检样品分离的菌革兰氏染色为阳性或革兰氏染色为阴性菌的PCR扩增产物电泳检测结果为阴性，报告该生鲜乳中未检出布鲁氏菌。5 DB65/ T3597-2014 附录A(资料性附录)培养基与试剂A. 1 布氏琼脂培养基bubboo b。AUAUnu-nu-nu nu-O白FbnunHU才l牛才44分成hm L乞LVJ白膏膏酸J蛋浸糖浸钙硫酶肉萄母化亚膜牛葡酵氯重琼脂蒸馆水定容至A.1.2 制法将上述各成分加入800mL蒸馆水中，加热并不断搅拌，煮沸1mi丑，使琼脂完全溶解，定容至15.0 g 1000 mL 1000此，1210C高压灭菌15min，最终pH7.3士0.20A.2 布鲁氏菌选择添加剂(OXOID)硫酸多粘菌素B2500 IU 杆菌肤12500 IU 那他霉素25. 0 mg 茶月定酸2.5 mg 制霉菌素50000 IU 万古霉素10.0 mg 使用时于500C每500mL布氏琼脂培养基中加入布鲁氏菌选择添加剂。A.3 50X TAE电泳缓冲液A. 3. 1 成分Tris碱242.3 g Na2EDTA 2H20 37.2 g 冰乙酸57. 1 mL 蒸馆水定容至1000 mL A.3.2 制法6 D865/ T3597-2014 称量Tris碱242.3 g, Na2EDTA. 2H20 37.2 g于1L烧杯中，加入约800mL蒸馆水，充分搅拌均匀，加入57.1 rnL的冰乙酸，充分溶解:用NaOH调pH值至8.3，加去离子水定容至1L，室温保存。A.3.3 使用液使用时将50XTAE电泳缓冲液稀释为lXTAEBuffer。7 DB65/ T3597-2014 附录B(资料性附录)样品采集及注意事项B. 1 法律依据:(中华人民共和国动物防疫法、病原微生物实验室生物安全管理条理、动物检疫管理办法、国家动物疫情测报体系管理规范。B. 2 现场采样的工作人员要穿工作服和胶鞋、戴上口罩、防风眼镜和一次性塑料手套或乳胶手套，作好个人安全防护。B. 3 乳样采集:准备好灭菌的加盖塑料管。将泌乳奶畜挤出的头2把乳废弃，再将挤出的乳汁置于一个衬有灭菌塑料袋的小桶内，摇动容器，使奶样混合均匀，取混匀的奶样约20mL于一个灭菌的塑料管内，加盖，胶布封口并标号记录，置于一200C冷冻备检。B. 4 现场采集样品的废弃物必须焚烧或深埋处理。采集样品区域进行化学试剂消毒(如2%烧碱溶液或其它有效的消毒剂进行消毒。8.5 用本方法分离培养生鲜乳中的布鲁氏菌要在生物安全实验室内操作完成，专业人员要注意作好自身安全防护。所有培养物和废弃物应小心处置，应按照GB19489中的有关规定进行。8 D865/ T3597-2014 附录G(资料性附录样品检测l结果判定图图C.1 生鲜乳分离的布鲁氏菌PCR检测电泳图M: DL2000 DNA Marker; 空白H201-4:检出的阳性样品:阴性:大肠杆菌;A19:布鲁氏菌阳性对照9