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分子克隆技术分子克隆技术限制性内切酶限制性内切酶v特定的识别序列，特定的识别序列，46个碱基对个碱基对v在识别序列内固定位置切割，在识别序列内固定位置切割，5-端磷酸端磷酸基因，基因，3-端羟基基团端羟基基团v切割后形成粘性或平滑末端切割后形成粘性或平滑末端C A T C G A C G A A T T CG T A G C T G C T T A A GG A A T T C T G C C A G G TEcoRI酶切位酶切位点点双双链链切切开开C T T A A G A C G G T C C AC A T C G A C GA A T T CGC T T A AG A C G G T C C AA A T T C T G C C A G G TGDNA连连接接酶酶形成新的形成新的DNA双链双链G T A G C T G C T T A A A A T T C T G C C A G G T.C A T C G A C GG A C G G T C C A.G T A G C T G C T T A A 限制性内切酶和限制性内切酶和DNA连接酶连接酶质质 粒粒v细胞内独立于染色体外的环状细胞内独立于染色体外的环状DNA，能能自我复制自我复制v其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达系统得以表达v分子分子200050000bppGEM-T vector mapSub-cloning construction of recombinant pCIA-P insertion of A-P DNA fragment into plasmid pCI构建质粒的特点构建质粒的特点vOri区：复制起点区：复制起点vPar区：保证质粒均匀分布于子细胞区：保证质粒均匀分布于子细胞v多克隆区：人为构建，便于克隆操作多克隆区：人为构建，便于克隆操作v选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑选使克隆后便于挑选接接 合合在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时形成配对的雄性形成配对的雄性-雌性菌，并有遗传物质的雌性菌，并有遗传物质的单向转移。单向转移。雄性菌：含雄性菌：含F性因子，染色体外环状性因子，染色体外环状DNA转转 化化外源外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主能进入细胞内并通过整合至宿主DNA中或独立复制保存于宿主细胞内。中或独立复制保存于宿主细胞内。转转 录录利用噬菌体为媒介，将供体利用噬菌体为媒介，将供体DNA转移到受转移到受体菌内的现象，能在自然状态下发生。体菌内的现象，能在自然状态下发生。分子克隆常用技术分子克隆常用技术vDNA电泳电泳v基因转移基因转移v核酸杂交核酸杂交v聚合酶链反应聚合酶链反应PCRDNA电泳电泳可分离不同分子量的可分离不同分子量的DNA对临床菌株的第二次对临床菌株的第二次PCR 扩增产物电泳图谱分析扩增产物电泳图谱分析 Lane 17:临床菌株临床菌株S.sobrinus;Lane 814:临床菌株临床菌株 S.mutans.Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder (Kb)2.01.0 0.25 0.1 0.750.5MW核酸杂交核酸杂交原理：原理：v在一定条件下（温度、在一定条件下（温度、pH值等）值等）DNA双股螺旋可解开并分离双股螺旋可解开并分离v在一定条件下，两股游离的互补的核苷在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股酸可自行配对形成双股Southern Blotv电泳、转移、杂交电泳、转移、杂交v确定分子量确定分子量斑点杂交斑点杂交v目标序列的存在目标序列的存在v目标序列的量目标序列的量聚合酶链反应聚合酶链反应PCRv细菌形态细菌形态v生化反应生化反应v免疫反应免疫反应v分子生物学方法分子生物学方法 -分子探针杂交分子探针杂交 -RFLP -PCR唾液在与龋病相关微生物检测中的应用唾液在与龋病相关微生物检测中的应用与龋病相关微生物的定量检测方法与龋病相关微生物的定量检测方法在人类口腔中检出率很高在人类口腔中检出率很高茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切活跃性之间的关系更密切变形链球菌和茸毛链球菌变形链球菌和茸毛链球菌唾液在与龋病相关微生物检测中的应用唾液在与龋病相关微生物检测中的应用套式套式PCR快速检测人类唾液中变形链快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌球菌和茸毛链球菌.谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵.中华口腔医学杂志，中华口腔医学杂志，2003，38：223-226唾液在与龋病相关微生物检测中的应用唾液在与龋病相关微生物检测中的应用套式套式PCR（Nested PCR）5 3 TemplateOuter primer2Outer primer1The first PCR5 3 Inter primer2Inter primer 1Next templateThe second PCR 5 3 The second PCR product本套式本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因基因和茸毛链球菌和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物基因设计的内、外两套引物（outer primer,inter primer）gtfB gene of S.mutansOuter primer thp4Outer primer thp3The first PCR Inter primer thp8Inter primer thp7Outer primer thp6gtfI gene of S.sobrinusOuter primer thp5The first PCRInter primer thp10Inter primer thp9The second PCRThe second PCRv抽提细菌染色体抽提细菌染色体DNA（Igarashi et al.1996）-细菌细菌 -唾液唾液vPCR反应过程反应过程 第一次第一次PCR反应反应 预变性预变性:94 4min 变性变性:94 1min 退火退火:51 1min 30 cycles 延伸延伸:72 2min 最后延伸最后延伸:72 5min 第二次第二次PCR反应反应 a b c d e f g hLadder 1 2 3 4 5 6 7 8 选择外引物行第一次选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析后扩增产物电泳图谱分析以变链菌组以变链菌组(Mutans Streptococci)染色体染色体 DNA为模板为模板 Lane 1:S.cricetus AHT;2.S.rattus BHT;3.S.mutans Ingbritt;4.S.sobrinus OMZ176;5.S.mutans LM-7;6.S.mutans OMZ175;7.S.sobrinus 6715;8.S.downei Mfe28.MW (Kb)2.0 1.0 0.25 0.1 0.75 0.5 a b c d e f g h Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 选择内引物行第二次选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析后扩增产物电泳图谱分析 Lane 1:S.cricetus AHT;2.S.rattus BHT;3.S.mutans Ingbritt;4.S.sobrinus OMZ176;5.S.mutans LM-7:6.S.mutans OMZ175;7.S.sobrinus 6715;8.S.downei Mfe28.Marker:DL2,000 Ladder MW (Kb)2.0 0.75 0.51.0 0.25 0.1 Ladder 1 2 3 4 5 6 第一次第一次PCR的灵敏度的灵敏度 变形链球菌变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量的数量 Lane1:108 CFU;Lane 2:107 CFU;Lane3:106CFU;Lane 4:105 CFUMW (Kb)2.00.75 0.51.0 0.25 2.0 0.5 Ladder 1 2 3 4 5 6 1.0 0.75 0.25MW(Kb)第二次第二次PCR的灵敏度的灵敏度 变形链球菌变形链球菌S.mutans Ingbritt 的数量的数量 Lane 1:104 CFU,Lane 2:103 CFU Lane1.chromosomal DNA from S.mutans Ingbritt;2.chromosomal DNA from S.sobrinus 6715;3.saliva sample from subject A;4.saliva sample from subject B;5.saliva sample from subject C.利用利用PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌直接从唾液样本中检测变形链球菌S.mutans和茸毛和茸毛链球菌链球菌S.sobrinus(图图A)利用外引物利用外引物(图图B)利用内引物利用内引物Ladder 1 2 3 4 5 LadderMW(Kb)2.01.00.750.5A0.250.1BLadder 1 2 3 4 5 LadderMW(Kb)1.00.750.50.250.1Real Time PCRv在在PCR反应体系中加入能结合到扩增产物反应体系中加入能结合到扩增产物上的荧光物质，并通过上的荧光物质，并通过Real Time PCR检检测系统对测系统对PCR反应过程中的荧光信号强度反应过程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法处理的方法v适应于定量适应于定量Real Time PCR应用应用v基因表达分析（基因表达分析（mRNA）vSNP分型分型v基因拷贝数变化（基因拷贝数变化（DNA）v转基因食物的定量分析转基因食物的定量分析vReal Time PCR原理（一）原理（一）vPCR每进行每进行1个循环，个循环，DNA呈呈2倍的指数关系增长，倍的指数关系增长，不久到达平台期。起始不久到达平台期。起始 的的DNA量越多扩增产物便越量越多扩增产物便越早达到阈值，也就是扩增曲线越早起峰。将已知浓度早达到阈值，也就是扩增曲线越早起峰。将已知浓度的标准品梯度稀释进行的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，就会按照起，就会按照起始始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列曲线。量由多到少的顺序等间隔得到一系列曲线。Ct值值Real Time PCR原理（二）原理（二）v再由再由Ct值（达到阈值时的循环次数）与起始模板量的值（达到阈值时的循环次数）与起始模板量的对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图所示对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图所示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，也可以的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，也可以得到得到Ct值，将值，将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量。度样品的起始模板量。未知样品浓度未知样品浓度分子克隆的主要步骤分子克隆的主要步骤v基因文库的建立基因文库的建立v目的基因的筛选目的基因的筛选v目的基因的分析目的基因的分析原核生物基因文库的建立原核生物基因文库的建立v提取细胞提取细胞DNAv限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切vDNA片段连接至质粒或噬菌体片段连接至质粒或噬菌体v转化宿主细胞（大肠杆菌）转化宿主细胞（大肠杆菌）目的基因的筛选目的基因的筛选v核酸杂交核酸杂交v免疫学检测免疫学检测目的基因的分析目的基因的分析vDNA序列序列v启动子分析启动子分析v推测蛋白质一级结构推测蛋白质一级结构v推测蛋白质二级结构推测蛋白质二级结构