DB34∕T 2996-2017 猪链球菌检验操作规程(安徽省).pdf

ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 29962017 猪链球菌检验操作规程 Protocol of examination for Streptococcus suis 文稿版次选择 2017 - 12 - 30 发布 2018 - 01 - 30 实施安徽省质量技术监督局发 布 DB34/T 29962017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、合肥市动物疫病预防控制中心、东至县畜牧兽医局。 本标准主要起草人：李郁、孙裴、高亚飞、黄晓慧、何宗来、吴华健、魏建忠、王希春、郑新勇、钱昌银。 DB34/T 29962017 1 猪链球菌检验操作规程 1 范围 本标准规定了猪链球菌检验的设备和材料、检验程序、操作步骤、结果报告、废弃物无害化处理与人员安全防护。 本标准适用于猪链球菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 2025 动物检疫实验室生物安全操作规范 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 主要设备和材料 3.1 显微镜：物镜 10 倍100 倍。 3.2 电子天平：感量 0.1 g。 3.3 培养箱：361。 3.4 冰箱：210。 3.5 全自动细菌鉴定系统。 3.6 pH 计、pH 比色管或精密 pH 试纸。 3.7 饱和氯化钠溶液：见附录 A 中 A.1。 3.8 30甘油缓冲盐水溶液：见附录 A 中 A.2。 3.9 革兰氏染色液：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.10 姬姆萨染色液：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.11 荚膜染色液：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.12 血液琼脂培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.13 选择性普通绵羊血琼脂培养基：见附录 A 中 A.3。 3.14 选择性 THB 肉汤：见附录 A 中 A.4。 3.15 磷酸盐缓冲液（PBS）：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.16 过氧化氢试剂：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.17 糖发酵培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.18 醇发酵培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.19 七叶苷培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.20 马尿酸钠培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 DB34/T 29962017 2 4 检验程序 猪链球菌检验程序见图1。 图1 猪链球菌检验程序 5 操作步骤 5.1 采样、运输和保存 5.1.1 对病猪，最急性和急性病例可无菌采集死亡猪的心、肝、肺、肾、脾、淋巴结等组织，慢性病例如关节炎型一般采取关节液及周围组织；对活猪，可采取扁桃体拭子、鼻腔拭子。 5.1.2 脏器组织样品采集后需延迟送检的， 可保存于饱和氯化钠溶液或 30甘油缓冲盐水溶液中， 保存时间不超过 72 h。 5.1.3 样品均需采取低温（48）保存和运输。 5.2 显微镜检查 5.2.1 采集的样品制成触片，革兰氏染色，镜检。 5.2.2 猪链球菌形态学特征：革兰氏阳性球菌，菌体直径约 1 m，链状排列，链长短不一，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关，固体培养物以双球菌为多，少量呈 3 个5 个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢，能形成荚膜。 5.3 分离培养 5.3.1 送检菌株的分离 划线接种于血液琼脂平板，361培养 24 h2 h，如菌落生长缓慢，可延长至 48 h2 h，使之形成单个菌落，以供鉴定用。 DB34/T 29962017 3 5.3.2 病料的分离和触片检查 用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于血液琼脂平板，于 361培养 24 h2 h，如菌落生长缓慢，可延长至 48 h2 h 后观察。同时取病料做组织触片，姬姆萨染色后镜检，如见球菌则表明病料中可能含有链球菌。 5.3.3 扁挑体和鼻腔拭子的分离 扁桃体和鼻腔拭子样品加入到含有 5 mL 灭菌选择性 THB 增菌液的试管中，于 361培养 24 h2 h 后，划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板。 5.3.4 动物产品的均质、增菌和分离 以无菌操作取检样 25 g，加入装有 225 mL 灭菌选择性THB增菌液的广口瓶内，均质，于 361培养 24 h2 h 后，划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板。 5.3.5 在血液琼脂平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上菌落特征 圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约 0.31.0 mm。 5.4 生化反应试验 经初步鉴定后，做 5乳搪、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验。猪链球菌发酵 5乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶苷，不发酵甘露醇和山梨醇，不水解马尿酸钠。 或应用全自动细菌鉴定系统进行生化反应试验。 5.5 动物试验 5.5.1 猪链球菌对小鼠、斑马鱼最敏感，均有致病力。 5.5.2 小鼠模型：将肺、脑、脾、肝、淋巴结磨碎，用灭菌生理盐水制成 1:5 组织悬液，或将 24 h的肉汤纯培养物用于动物试验。小鼠皮下注射组织悬液 0.2 mL 或纯培养菌液 0.1 mL，接种后小鼠出现精神萎顿、拱背、毛乱、停食，3 d7 d 死亡；死亡的小鼠脾脏肿大，肺脏和肝脏出血。以死亡小鼠内脏组织制成触片，革兰氏染色，镜检，可见猪链球菌；同时在血液琼脂平板或选择性普通琼脂绵羊血平板上作分离培养，可见猪链球菌的典型菌落。 5.5.3 斑马鱼模型：将肺、脑、脾、肝、淋巴结磨碎，用灭菌生理盐水制成 1:5 组织悬液，或将 24 h的肉汤纯培养物用于动物试验。斑马鱼腹腔注射组织悬液 10 L 或纯培养菌液 5 L，接种后观察 4 d，一般 1 d4 d 死亡。以死亡斑马鱼内脏组织制成触片，革兰氏染色，镜检，可见猪链球菌；同时在血液琼脂平板或选择性普通琼脂绵羊血平板上作分离培养，可见猪链球菌的典型菌落。 5.6 猪链球菌 PCR 鉴定 见附录B。 5.7 猪链球菌 PCR 血清型鉴定 见附录B。 6 结果报告 6.1 符合 5.2、5.3、5.4、5.5，可确定为猪链球菌。 DB34/T 29962017 4 6.2 符合 5.3、5.6，可确定为猪链球菌。 6.3 符合 6.1、6.2，且根据 5.7，可确定为某种血清型的猪链球菌。 7 废弃物无害化处理与人员安全防护 7.1 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌， 根据其荚膜多糖的抗原差异， 可分为 134 及 1/2 共 35个血清型。大多数致病性菌株为 19 血清型，其中猪链球菌 2 型为最常见和毒力最强的血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。 7.2 应按照 GB 19489、SN/T 2984 和 SN/T 2025 的规定执行。 DB34/T 29962017 5 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基的配制 A.1 饱和氯化钠溶液 A.1.1 成分 氯化钠 3839 g 蒸馏水 100 mL A.1.2 制法 将 3839 g 氯化钠加入 100 mL 蒸馏水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，分装于采样管，每管510 mL，121高压灭菌 15 min 备用。 A.2 30甘油缓冲盐水溶液 A.2.1 成分 氯化钠 0.5 g 碱性磷酸钠 1.0 g 中性甘油 30 mL 蒸馏水 100 mL A.2.2 制法 先将盐类成分溶于水中，然后加入甘油，混匀，分装于采样管，每管 510 mL，121高压灭菌 15 min 备用。 A.3 选择性普通绵羊血琼脂培养基 A.3.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 将 A.3.1 中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正 pH 至 7.30.2，121灭菌 20 min，待冷却至 50左右时加 50 mL 无菌脱纤维绵羊血，摇匀后倒平板。 A.4 选择性 THB 肉汤 DB34/T 29962017 6 A.4.1 成分 THB培养基 30 g 多粘菌素 10 mg 萘啶酮酸 15 mg 蒸馏水 1000 mL A.4.2 制法 将 A.4.1 中 THB 培养基溶于蒸馏水中，加热溶解，121灭菌 20 min，待冷却至 50左右，加入多粘菌素 10 mg、萘啶酮酸 15 mg，摇匀后倒平板。 DB34/T 29962017 7 B B 附 录 B （规范性附录） 猪链球菌及 1、2、7、9 型聚合酶链式反应（PCR）鉴定 B.1 材料准备 B.1.1 主要仪器 PCR 扩增仪、1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 反应管、水浴锅、高速冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、移液器吸管。 B.1.2 主要试剂 2PCR Master Mix、灭菌超纯水、琼脂糖、10 mg/ML 溴化乙锭（EB）、TBE 缓冲液、上样缓冲液（10Loading Buffer）、相对分子质量 Marker（DL-2000）。 B.1.3 引物序列 见表B.1。 表B.1 检测主要毒力基因的引物 检测基因 引物名称 引物序列 (5-3) 产物大小 /bp gdh gdh-1 gdh-2 GCAGCGTATTCTGTCAAACG CCATGGACAGATAAAGATGG 688 cps1I cps1I-1 cps1I-2 GGAATAAAGCGGAGTACAGC GTCCTGCACGGTATTAATTGC 210 cps 2J cps2J-1 cps2J-2 CAAACGCAAGGAATTACGGTATC GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG 675 cps7H cps7H-1 cps7H-2 GGAAAGAGACACGTTGGTATC GGACACGTAAAGACTGACTAG 395 cps 9H cps9H-1 cps9H-2 GGCTACATATAATGGAAGCCC CCGAAGTATCTGGGCTACTG 390 B.2 操作步骤 B.2.1 细菌基因组 DNA 的提取 采用煮沸法。即取 1 mL 过夜培养菌液加入 1.5 mL 离心管中，以 12000 r/min 离心 5 min，弃上清液，加入 30 L 灭菌超纯水混均，置沸水中煮沸 10 min，之后冰浴 5 min，再以 12000 r/min 离心 5 min，取上清液即为 DNA 模板。 B.2.2 PCR 扩增 DB34/T 29962017 8 检测过程应同时做阳性和阴性空白对照。阳性对照模板为猪 1、2、7、9 型链球菌，阴性空白对照为灭菌超纯水。 PCR 反应体系：总体积为 25 L，其中含有 12.5 L 的 PCR Master Mix，10 mol/L 上、下游引物各 1 L，1 g/L DNA 模板 5 L，灭菌超纯水 5.5 L。 PCR 反应条件见表B.2。 表B.2 PCR 反应条件 检测基因 预变性 温度/时间 /min 变性 温度/时间 /s 退火 温度/时间 /s 延伸 温度/时间 /s 循环 数 延伸 温度/时间 /min gdh 94 5 94 60 55 60 72 60 35 72 7 cps1I 95 5 94 40 56 45 72 60 30 72 10 cps 2J 95 5 95 50 56 50 72 50 35 72 10 cps7H 95 5 94 40 56 45 72 60 30 72 10 cps 9H 95 5 94 30 56 30 72 30 35 72 10 B.2.3 PCR扩增产物电泳检测 用 100 ML 1TAE 缓冲液制备 1.0%琼脂糖凝胶，加入5L10mg/ML EB。 取 5 L PCR 扩增产物与 1 L 10Loading Buffer混合后加入点样孔进行电泳，电压 100 V，电流 100 A，电泳 30 min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录电泳结果。 B.2.4 结果判定 猪链球菌的目的基因大小为 688 bp，1、2、7、9 型目的基因大小分别为 210、675、395、390 bp。 阳性对照扩增出目的基因条带的大小，阴性空白对照孔未见有 PCR 扩增条带，表明试验成立，否则应重做。试验成立，被检样品孔如发现有 688、210、675、395、390 bp 大小的扩增条带，则判定阳性（），猪链球菌及 1、2、7、9 型 PCR 检测结果电泳图见图B.1、图B.2、图B.3、图B.4、图B.5；被检样品孔如未发现有目的条带大小的扩增条带，则判为阴性（）。 图中： 1：DNA Marker 2000； 2：阳性对照； 3：阴性对照； 4、5：检测样品。 图B.1 猪链球菌 PCR 检测结果电泳图 1 2 3 4 5 688bp 2000 1000 750 500 250 100 DB34/T 29962017 9 图中： 1：DNA Marker 600； 2：阳性对照； 3：阴性对照； 4、5：检测样品。 图B.2 猪链球菌 1 型 PCR 检测结果电泳图 图中： 1：DNA Marker 2000； 2：阳性对照； 3：阴性对照； 4、5：检测样品。 图B.3 猪链球菌 2 型 PCR 检测结果电泳图 2000 1000 750 500 250 100 675bp 1 2 3 4 5 600 500 400 300 200 100 210bp 1 2 3 4 5DB34/T 29962017 10 1 2 3 4 5 图中： 1：DNA Marker 2000； 4：阴性对照； 5：阳性对照； 1、2：检测样品。 图B.4 猪链球菌 7 型 PCR 检测结果电泳图 图中： 1:DNA Marker 2000； 4: 阴性对照； 5：阳性对照； 1、2：检测样品。 图B.5 猪链球菌 9 型 PCR 检测结果电泳图 _ 2000 1000 750 500 250 100 395bp 1 2 3 4 52000 1000 750 500 250 100 390bp