细胞工程胚胎干细胞培养.pptx

细胞工程胚胎干细胞培养第七章第七章 胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养v干细胞就是什么干细胞就是什么vES/EGES/EG细胞得培养及建系技术细胞得培养及建系技术vES/EGES/EG细胞得体外诱导分化细胞得体外诱导分化v诱导分化细胞得永生化诱导分化细胞得永生化vES/EGES/EG细胞技术学在医学中得应用细胞技术学在医学中得应用vES/EGES/EG细胞技术学面临得问题和研究趋势细胞技术学面临得问题和研究趋势 一、干细胞一、干细胞(stem cells)(stem cells)就是什么就是什么 具有无限得或延长得自我更新能力得细胞具有无限得或延长得自我更新能力得细胞 能产生至少一种类型得高度分化得细胞能产生至少一种类型得高度分化得细胞l 从具有得分化潜能上讲从具有得分化潜能上讲:-专能干细胞专能干细胞-多能干细胞多能干细胞-全能干细胞全能干细胞l 从组织发生即来源上讲从组织发生即来源上讲:-胚胎性干细胞胚胎性干细胞 -成体干细胞成体干细胞/组织干细胞组织干细胞v胚胎性干细胞就是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胚胎性干细胞就是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎得干细胞胎得干细胞,基本特征就是有稳定地在体外自我更新、稳定地基本特征就是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴得各种类型分化细胞畴得各种类型分化细胞,甚至参与个体发育。甚至参与个体发育。-来自早期胚胎来自早期胚胎:胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)(embryonic stem cells,ES)-来自胚胎生殖嵴中得原始生殖细胞来自胚胎生殖嵴中得原始生殖细胞:胚胎生殖细胞胚胎生殖细胞(embryonic(embryonic germ cells,EG)germ cells,EG)-来自畸胎瘤组织来自畸胎瘤组织:胚胎性癌细胞胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cells,(embryonal carcinoma cells,ECEC)19811981年年,Evens,Evens和和MartinMartin分别成功得分离和体外培养了小鼠分别成功得分离和体外培养了小鼠 得胚胎干细胞得胚胎干细胞;19951995年年,Thomson,Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物得胚胎等人分离建立了第一株灵长类动物得胚胎 干细胞干细胞;19981998年年,Thomson,Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞等建立了第一株人类胚胎干细胞;19981998年年,Shamblott,Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞等建立了第一株人类生殖干细胞;20022002年年3 3月月,美国麻省理工学院科学家宣布美国麻省理工学院科学家宣布,她们首次利用她们首次利用 人体胚胎干细胞培育出毛细血管人体胚胎干细胞培育出毛细血管,证明了胚胎干细胞技术在证明了胚胎干细胞技术在 治疗心血管疾病等领域得应用潜力治疗心血管疾病等领域得应用潜力;目前已有报导目前已有报导,ES,ES细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞,胰岛细胞及血管内皮细胞胰岛细胞及血管内皮细胞,肝细胞等。肝细胞等。v成体干细胞成体干细胞(adult stem cells,AS),(adult stem cells,AS),也叫作组织干细胞也叫作组织干细胞(tissue stem cells)(tissue stem cells)就是指一群分布在成体组织中处于尚就是指一群分布在成体组织中处于尚未分化得、具有自我更新并负有构建和补充某种组织得各种未分化得、具有自我更新并负有构建和补充某种组织得各种类型细胞潜能得干细胞。如骨髓得造血干细胞、间充质干细类型细胞潜能得干细胞。如骨髓得造血干细胞、间充质干细胞胞;神经系统得神经干细胞神经系统得神经干细胞;肝干细胞肝干细胞;骨骼肌干细胞等。骨骼肌干细胞等。-造血干细胞可分化为血液系统得各种细胞造血干细胞可分化为血液系统得各种细胞;小肠和皮肤中得干小肠和皮肤中得干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织得能力。细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织得能力。-骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞得各类细骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞得各类细胞外胞外,还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞等还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞等不同分化细胞。不同分化细胞。二、二、ES/EGES/EG细胞得培养建系技术细胞得培养建系技术 分离囊胚得内细胞群分离囊胚得内细胞群与成纤维细胞共培养与成纤维细胞共培养,ES,ES细胞非分化增殖细胞非分化增殖分离胚胎生殖腺细胞分离胚胎生殖腺细胞胚胎干细胞得鉴定胚胎干细胞得鉴定定向诱导分化定向诱导分化功能细胞功能细胞12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流1 1、ES/EGES/EG细胞得来源细胞得来源(1)(1)发育良好得囊胚发育良好得囊胚,从中分离从中分离ICM,ICM,进一步分离培养进一步分离培养ESES细胞细胞(2)(2)从胚胎生殖腺中分离出从胚胎生殖腺中分离出EGEG细胞细胞 (3)(3)从畸胎瘤中分离出从畸胎瘤中分离出ECEC细胞细胞(4)(4)治疗性克隆即体细胞核转移治疗性克隆即体细胞核转移(SCNT)(SCNT)途径分离培养途径分离培养ESES细胞细胞 2 2、ES/EGES/EG细胞得分化抑制培养细胞得分化抑制培养l 目前常用得细胞分化抑制物主要有三种目前常用得细胞分化抑制物主要有三种:-饲养层细胞饲养层细胞(feeder layer)(feeder layer)-特殊细胞得条件培养液特殊细胞得条件培养液(conditioned medium),(conditioned medium),如如BRL(Buffalo rat liver)BRL(Buffalo rat liver)细胞条件培养液细胞条件培养液-分化抑制因子分化抑制因子(differentiation inhibitory factor,(differentiation inhibitory factor,DIF),DIF),如白血病抑制因子如白血病抑制因子(leukemia inhitory factor,LIF)(leukemia inhitory factor,LIF)l饲养层细胞培养法饲养层细胞培养法:常用得饲养层细胞有下列两种常用得饲养层细胞有下列两种:(1)MEF(1)MEF细胞细胞(mouse embryonic fibroblast),(mouse embryonic fibroblast),取自各种品系取自各种品系小鼠得小鼠得12dpc12dpc胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化,常规分散细胞培常规分散细胞培养为单层散布得成纤维细胞。养为单层散布得成纤维细胞。(2)STO(2)STO细胞细胞,来自来自SIMSIM小鼠小鼠(S)(S)胚胎得对硫代鸟嘌呤胚胎得对硫代鸟嘌呤(T)(T)和乌本和乌本苷苷(O)(O)有抗性得成纤维细胞系有抗性得成纤维细胞系,能分泌干细胞生长因子能分泌干细胞生长因子(stem(stem cell factor,SCF)cell factor,SCF)以及白血病抑制因子以及白血病抑制因子(leukemia(leukemia inhibitory factor,LIF)inhibitory factor,LIF)。l无饲养层培养法无饲养层培养法:饲养层细胞得制备在一定程度上使饲养层细胞得制备在一定程度上使ES/EGES/EG细胞培养显得较繁杂。细胞培养显得较繁杂。近来以添加近来以添加LIFLIF生长因子或某些特定细胞得条件培养液至含生长因子或某些特定细胞得条件培养液至含FCSFCS得得正常培养液正常培养液,借此替代饲养层细胞借此替代饲养层细胞:(1)(1)直接在直接在ESES细胞基础培养液中加入重组细胞基础培养液中加入重组LIFLIF(2)Buffalo(2)Buffalo大鼠肝细胞条件培养液大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)(BRL-CM)(3)2(3)23 3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH-CM)(RH-CM)3 3、ES/EGES/EG细胞系得特性和鉴定细胞系得特性和鉴定(1)(1)形态学特征形态学特征(2)(2)发育全能性和分化潜能鉴定发育全能性和分化潜能鉴定(3)(3)嵌合体动物嵌合体动物(1)(1)形态学特征形态学特征l 体外培养小鼠体外培养小鼠ES/EGES/EG细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个核仁、且核质比高得圆形或卵圆形细胞核仁、且核质比高得圆形或卵圆形细胞,彼此均呈单层或多层彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态,组成克隆得细胞彼组成克隆得细胞彼此界限不清楚此界限不清楚,粘连性强。粘连性强。l 人人ESES与与EGEG细胞得形态学特征有所不同细胞得形态学特征有所不同,与小鼠与小鼠ES/EGES/EG也有所也有所不同。单层培养时不同。单层培养时,人体人体ESES细胞呈扁平状群落细胞呈扁平状群落,且细胞界限清且细胞界限清楚。楚。(2)(2)发育全能性和分化潜能鉴定发育全能性和分化潜能鉴定 小鼠和包括人在内得灵长类动物全能或多能性小鼠和包括人在内得灵长类动物全能或多能性胚胎性干细胞胚胎性干细胞,具有特有得表达标志以及在体内外得具有特有得表达标志以及在体内外得分化特点。分化特点。干细胞标记干细胞标记鼠类鼠类EC鼠类鼠类ES鼠类鼠类EG人类人类EC人类人类ES人类人类EGSSEA-1 +-+SSEA-3 -+SSEA-4 -+TRA-1-60 -+TRA-1-80 -+AKP +Oct-4Oct-4 +？+小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱 lSSEAs(stage-specific embryonic antigen):SSEAs(stage-specific embryonic antigen):时期专一性胚胎时期专一性胚胎抗原抗原lTRA-1-60TRA-1-60、TRA-1-81:TRA-1-81:肿瘤排斥抗原肿瘤排斥抗原lAKP:AKP:碱性磷酸酶在小鼠及灵长类得碱性磷酸酶在小鼠及灵长类得ESES细胞中活性较高细胞中活性较高,在已分化细在已分化细胞中活性明显降低胞中活性明显降低;lOct-4:Oct-4:就是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能就是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能多能性相关得转录因子性相关得转录因子,Oct-4,Oct-4通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因得转录得转录,在细胞得全能在细胞得全能/多能性及未分化状态得调控和维持中发挥重多能性及未分化状态得调控和维持中发挥重要作用。要作用。l端粒酶端粒酶(telomerase):(telomerase):一类核糖核蛋白一类核糖核蛋白,与维持真核细胞染色体末与维持真核细胞染色体末端得端粒长度和控制细胞寿命有关。人端得端粒长度和控制细胞寿命有关。人ESES细胞得端粒酶活性高细胞得端粒酶活性高,而而分化细胞一般难以检测到分化细胞一般难以检测到;l胚胎干细胞得特异性表达标志胚胎干细胞得特异性表达标志:l ES/EG ES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞就是其最基本细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞就是其最基本得得 属性属性;l ES/EG ES/EG细胞接种于同一品系得小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、细胞接种于同一品系得小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、眼窝、腹腔等可以形成由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成眼窝、腹腔等可以形成由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成 得畸胎瘤。得畸胎瘤。l胚胎干细胞得体内、外分化特点胚胎干细胞得体内、外分化特点:l 组织和器官得细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成得组织和器官得细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成得完整个体称为嵌合体动物完整个体称为嵌合体动物(chimaera)(chimaera)。把。把ES/EGES/EG细胞注入胚泡细胞注入胚泡或与桑椹胚聚集或与桑椹胚聚集,使其与正常胚胎结合在一起使其与正常胚胎结合在一起,并参与宿主胚胎并参与宿主胚胎发育发育,可形成嵌合体动物得各种组织和器官可形成嵌合体动物得各种组织和器官,包含生殖系包含生殖系l 嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或就嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或就是取器官组织进行同功酶检测是取器官组织进行同功酶检测(3)(3)嵌合体动物嵌合体动物 三、三、ES/EGES/EG细胞得体外诱导分化细胞得体外诱导分化1 1、基本原理、基本原理l 细胞诱导细胞诱导分化就是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精分化就是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调得分子细胞学过程密协调得分子细胞学过程,就是胚胎正常发育过程中重要而就是胚胎正常发育过程中重要而基本得现象基本得现象;l ESES细胞就是体外研究诱导分化得较理想模型细胞就是体外研究诱导分化得较理想模型,在体外被诱在体外被诱导分化得途径可能与在体胚胎细胞得不完全相同导分化得途径可能与在体胚胎细胞得不完全相同;l 在体胚胎得细胞分化过程中在体胚胎得细胞分化过程中,诱导作用得结果不只就是决定诱导作用得结果不只就是决定于各种诱导物质得性质和专一性于各种诱导物质得性质和专一性,同时也决定于被诱导细胞得同时也决定于被诱导细胞得反应能力反应能力(petence)(petence)。后者受遗传、发育潜能等内在因素得限。后者受遗传、发育潜能等内在因素得限制制;l ESES细胞体外诱导分化实验中细胞体外诱导分化实验中,所用诱导物质繁多所用诱导物质繁多,诱导模式诱导模式 不尽相同不尽相同,按其作用机理大致分为两类按其作用机理大致分为两类:-使被诱导细胞可逆性轻度损伤使被诱导细胞可逆性轻度损伤,导致神经细胞分化导致神经细胞分化 无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等-诱导物通过其与被诱导细胞表面得受体结合而诱导细胞分化诱导物通过其与被诱导细胞表面得受体结合而诱导细胞分化 类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等 同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端得构造同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端得构造,不仅涉及诱不仅涉及诱导剂得浓度差别、诱导作用模式和微环境得未知因素等导剂得浓度差别、诱导作用模式和微环境得未知因素等,而且可能与被诱而且可能与被诱导细胞本身得发育潜能和对诱导剂得反应性等差别有关。导细胞本身得发育潜能和对诱导剂得反应性等差别有关。l ESES细胞体外诱导分化途径可分为细胞体外诱导分化途径可分为:-谱系分化谱系分化(lineage differentiationlineage differentiation),有利于认识组织有利于认识组织 谱系细胞分化机理和全过程谱系细胞分化机理和全过程。ES ES细胞细胞 谱系祖细胞谱系祖细胞 谱系定型细胞谱系定型细胞 终末分化细胞终末分化细胞-定向分化定向分化(mitted differeniation),(mitted differeniation),需设法控制导向需设法控制导向 产生单一类型得分化细胞。产生单一类型得分化细胞。对对ESES细胞转染细胞专一得转录因子、标志基因、细胞分化因子细胞转染细胞专一得转录因子、标志基因、细胞分化因子 结合报告基因和诱导条件选择等手段结合报告基因和诱导条件选择等手段,探索定向诱导分化途径探索定向诱导分化途径2 2、ESES细胞体外诱导分化得基本方法细胞体外诱导分化得基本方法l单层单层ESES细胞培养和诱导分化细胞培养和诱导分化:较难分化为单一类型得细胞较难分化为单一类型得细胞lESES细胞拟胚体形成和诱导分化细胞拟胚体形成和诱导分化:相对诱导分化细胞类型较相对诱导分化细胞类型较 单一单一,具体方法有具体方法有:(1)(1)软琼脂培养软琼脂培养(2)(2)悬滴培养悬滴培养 制备制备ESES单细胞悬浮液单细胞悬浮液培养皿盖上接种培养皿盖上接种20ul/20ul/滴，直径滴，直径10cm10cm的培养皿盖的培养皿盖盖上带有悬浮细胞小滴的盖子盖上带有悬浮细胞小滴的盖子培养皿内加培养皿内加PBSPBS培养皿边缘用膜封培养皿边缘用膜封 置置3737，5CO 2培养箱培养培养箱培养3d3d后，转移拟胚体至含后，转移拟胚体至含细胞分化诱导剂的培养细胞分化诱导剂的培养皿或微孔板进一步培养皿或微孔板进一步培养然后然后,移放入铺有移放入铺有0.1%0.1%白明胶的培养皿或微孔白明胶的培养皿或微孔板内在培养液中再培养板内在培养液中再培养可被诱导分化为不同类型细胞可被诱导分化为不同类型细胞 ES ES细胞体外悬滴培养细胞体外悬滴培养3 3、ESES细胞体外诱导分化举例细胞体外诱导分化举例 造血细胞造血细胞 内皮细胞与血管内皮细胞与血管 神经细胞神经细胞 脂肪细胞脂肪细胞 心肌和其她肌肉细胞心肌和其她肌肉细胞 软骨细胞软骨细胞 胰岛细胞胰岛细胞l小鼠小鼠ESES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样得结构并分化产生各种造血系统得细胞血岛样得结构并分化产生各种造血系统得细胞:用胰蛋白酶消化小鼠用胰蛋白酶消化小鼠ESES细胞拟胚体成单个细胞细胞拟胚体成单个细胞,经干细胞经干细胞因子因子(SCF)(SCF)、血小板生成素、血小板生成素(TPO)(TPO)和条件培养液处理和条件培养液处理,诱导其定诱导其定向分化为造血干细胞向分化为造血干细胞;用原代骨髓基质细胞作饲养层和用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCFSCF及及IL-6IL-6细胞因子处理细胞因子处理 可进一步使可进一步使ESES细胞来源得造血干细胞分化为细胞来源得造血干细胞分化为B B淋巴细胞系。淋巴细胞系。造血细胞造血细胞内皮细胞与血管内皮细胞与血管l小鼠小鼠ESES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样得结构血岛样得结构,其中也有内皮细胞出现其中也有内皮细胞出现:利用经转化生长因子利用经转化生长因子1(TGF-1)1(TGF-1)基因转染基因转染得小鼠得小鼠ESES细胞细胞在含在含RARA培养液中经悬滴培养形成拟胚体培养液中经悬滴培养形成拟胚体;再继续贴壁培养再继续贴壁培养,发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。样结构。将外源重组将外源重组TGF-TGF-11添加至培养液添加至培养液,同样也能诱导内皮细胞组同样也能诱导内皮细胞组成得血管样结构。成得血管样结构。心肌和其她肌肉细胞心肌和其她肌肉细胞l 悬浮或悬滴培养得小鼠悬浮或悬滴培养得小鼠ESES细胞拟胚体在细胞拟胚体在RARA诱导条件下贴壁诱导条件下贴壁生长数天生长数天,常出现某些分化细胞集落具有节律性自发收缩得常出现某些分化细胞集落具有节律性自发收缩得现象现象,显然就是肌细胞显然就是肌细胞:DMSODMSO诱导诱导ESES细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞多种类型肌细胞,用肌肉专一性得调节因子用肌肉专一性得调节因子MyoDMyoD基因转染基因转染ESES细胞并结合细胞并结合DMSODMSO诱导处理诱导处理,额外表达额外表达MyoDMyoD基因得基因得ESES细胞主要分化为骨骼肌且细胞主要分化为骨骼肌且常融合成肌管。常融合成肌管。vESES细胞定向诱导分化就是至今仍未解决、正在探细胞定向诱导分化就是至今仍未解决、正在探索中得问题。根据国外少数报道和国内得经验索中得问题。根据国外少数报道和国内得经验,对对ESES细胞转染细胞专一得转录因子、标志基因或就细胞转染细胞专一得转录因子、标志基因或就是有关细胞分化因子等遗传操作是有关细胞分化因子等遗传操作,并结合诱导条件并结合诱导条件选择等手段选择等手段,就是一条可能得探索就是一条可能得探索ESES细胞定向诱导细胞定向诱导分化得途径。分化得途径。四、四、ES/EGES/EG细胞诱导分化细胞得永生化细胞诱导分化细胞得永生化 寻找建立寻找建立ES/EGES/EG细胞诱导产生得分化细胞永生化细胞诱导产生得分化细胞永生化途径就是目前途径就是目前ES/EGES/EG细胞研究领域待解决得问题。细胞研究领域待解决得问题。五、五、ES/EGES/EG培养与诱导分化得意义培养与诱导分化得意义哺乳类发育得体外模型哺乳类发育得体外模型人体得基因和细胞治疗人体得基因和细胞治疗组织工程得种子细胞来源组织工程得种子细胞来源l哺乳动物早期胚胎一般体积很小哺乳动物早期胚胎一般体积很小,又在宫内发育又在宫内发育,在体内研在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能;lESES细胞具有完整得发育潜能性细胞具有完整得发育潜能性,而且对所有调节正常发育而且对所有调节正常发育得信号具有应答能力。虽然得信号具有应答能力。虽然ESES细胞体外分化途径和机制与细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同在体胚胎不完全相同,但在分子水平有共同或相似之处但在分子水平有共同或相似之处,就就是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想得实验体系演变较理想得实验体系;l许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目得得前提下许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目得得前提下,已允许将人已允许将人ESES细胞类似于小鼠细胞类似于小鼠ESES细胞体外实验一样细胞体外实验一样,用于用于研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。哺乳类发育得体外模型哺乳类发育得体外模型 人体得基因和细胞治疗人体得基因和细胞治疗 这里得基因治疗就是指用遗传改造过得人体细胞直接移这里得基因治疗就是指用遗传改造过得人体细胞直接移植或输入病人体内植或输入病人体内,达到控制和治愈疾病为目得得治疗手段达到控制和治愈疾病为目得得治疗手段,又称细胞治疗。又称细胞治疗。l目前常说得基因治疗技术虽然能把编码正常序列得基因导入目前常说得基因治疗技术虽然能把编码正常序列得基因导入 突变细胞而使突变基因得功能得到纠正突变细胞而使突变基因得功能得到纠正,但导入基因得整合但导入基因得整合 和表达难以精确控制和表达难以精确控制,特别就是基因插入后对其她基因产生得特别就是基因插入后对其她基因产生得 效应尚无法预知。更大问题就是效应尚无法预知。更大问题就是,许多被用作基因操作得细胞许多被用作基因操作得细胞 在体外不易稳定地被转染和增殖传代在体外不易稳定地被转染和增殖传代;lESES细胞就是基因治疗得较理想得靶细胞细胞就是基因治疗得较理想得靶细胞,经遗传操作后一般仍经遗传操作后一般仍 能稳定地在体外增殖传代能稳定地在体外增殖传代,克服了目前基因治疗中需要大量克服了目前基因治疗中需要大量 靶细胞来源得主要问题。靶细胞来源得主要问题。定向诱导分化定向诱导分化,选择选择治疗因子基因表达治疗因子基因表达 人人ES细胞细胞 基因操作基因操作(克服免疫学障碍克服免疫学障碍)多种多种MHC组合组合 得得ES细胞库细胞库 组织谱系干细胞组织谱系干细胞(如造血干细胞如造血干细胞)功能性分化细胞功能性分化细胞(如神经细胞如神经细胞)移植移植移植移植 不同类型疾病得宿主不同类型疾病得宿主 基因组被改造基因组被改造 得得ES细胞细胞异源性基因表达异源性基因表达 基因修饰基因修饰 基因敲除、敲入基因敲除、敲入定向诱导分化定向诱导分化选择选择 组织谱系干细胞或组织谱系干细胞或功能性分化细胞功能性分化细胞移植移植图图2-2-1 用于基因和细胞治疗得人用于基因和细胞治疗得人ES细胞工程示意图细胞工程示意图基本策略基本策略1 1基本策略基本策略2 2欲接受细胞治疗患者得欲接受细胞治疗患者得 体细胞核体细胞核导入导入去核卵细胞去核卵细胞体外发育体外发育 胚泡期胚泡期专用专用ES细胞细胞 特化细胞特化细胞分离培养分离培养体外诱导分化体外诱导分化 回输回输细胞治疗得临床应用前景细胞治疗得临床应用前景l神经系统疾病神经系统疾病l骨和软骨疾病骨和软骨疾病l血液病血液病l肝病肝病l神经系统疾病神经系统疾病 根据小鼠根据小鼠ES/EGES/EG细胞研究资料细胞研究资料,由于各种类型神经细胞因某种原由于各种类型神经细胞因某种原因死亡而成熟神经细胞又不能分裂、补充和替代死亡细胞引起得因死亡而成熟神经细胞又不能分裂、补充和替代死亡细胞引起得神经系统疾病如神经系统疾病如ParkinsonsParkinsons疾病疾病,Alzheimers,Alzheimers病、多发性硬病、多发性硬化症等化症等,有望通过人有望通过人ES/EGES/EG细胞进行细胞治疗。细胞进行细胞治疗。新近新近,产生多巴胺得神经细胞已能从小鼠产生多巴胺得神经细胞已能从小鼠ESES细胞衍生而来细胞衍生而来,为为细胞治疗细胞治疗ParkinsonsParkinsons病得病得ESES细胞来源问题提供实验依据。细胞来源问题提供实验依据。l骨和软骨疾病骨和软骨疾病ES/EGES/EG细胞可能在体外被诱导为骨和软骨细胞可能在体外被诱导为骨和软骨,这些细胞被导入这些细胞被导入骨关节炎患者得关节软骨损伤区域骨关节炎患者得关节软骨损伤区域,或因骨折、手术而引起得或因骨折、手术而引起得较大骨隙中较大骨隙中,这类从这类从ESES细胞衍生得骨和软骨细胞在被移植部位细胞衍生得骨和软骨细胞在被移植部位自我修复得优点远远超过现行得组织移植。自我修复得优点远远超过现行得组织移植。l血液病血液病ESES和造血干细胞研究有助于产生供细胞移植用得、不含有和造血干细胞研究有助于产生供细胞移植用得、不含有 镰刀状血球突变得血细胞。镰刀状血球突变得血细胞。l肝病肝病利用肝干细胞移植治疗肝病取得了重要进展。利用肝干细胞移植治疗肝病取得了重要进展。组织工程得种子细胞来源组织工程得种子细胞来源 人体人体ESES细胞技术学得发生和发展细胞技术学得发生和发展,有望解决有望解决目前组织或器官修复中得难题。目前组织或器官修复中得难题。l 设想就是选择与人体细胞兼容性较好得生物材料设想就是选择与人体细胞兼容性较好得生物材料,按缺损组按缺损组织或器官得要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中织或器官得要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中,使使ESES细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增,构建成新得组织或器官。但构建成新得组织或器官。但ESES细胞定向分化和构成组织和器官细胞定向分化和构成组织和器官中细胞类型得复杂性等诸多问题尚待解决中细胞类型得复杂性等诸多问题尚待解决;l 目前工作就是着重于从成年或幼年器官和组织得碎片中分离、目前工作就是着重于从成年或幼年器官和组织得碎片中分离、培养和扩增某一类型得组织干细胞培养和扩增某一类型得组织干细胞,经过体外培养扩增有可能经过体外培养扩增有可能作为组织工程得种子细胞来源。例如作为组织工程得种子细胞来源。例如,从骨髓分离和扩增间质从骨髓分离和扩增间质干细胞干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),(mesenchymal stem cell,MSC),用作骨折愈合、肌腱韧用作骨折愈合、肌腱韧带修复、肌肉再生和造血重建等组织工程得种子细胞。带修复、肌肉再生和造血重建等组织工程得种子细胞。六、六、ESES细胞研究面临得问题和研究趋势细胞研究面临得问题和研究趋势-如何解决用于人类胚胎干细胞研究得胚胎来源问题？如何解决用于人类胚胎干细胞研究得胚胎来源问题？-如何分离、纯化干细胞？如何分离、纯化干细胞？-如何保持体外培养胚胎干细胞得全能性如何保持体外培养胚胎干细胞得全能性,并控制定向诱导分化？并控制定向诱导分化？-如何使如何使ESES细胞诱导分化产生得分化细胞永生化？细胞诱导分化产生得分化细胞永生化？-分化后得细胞就是否有致瘤性？分化后得细胞就是否有致瘤性？-如何使干细胞在体外发育成完整得器官？如何使干细胞在体外发育成完整得器官？-如何克服分化细胞移植后仍有可能发生得免疫排斥？如何克服分化细胞移植后仍有可能发生得免疫排斥？-有关伦理道德和法律以及商业应用等问题有关伦理道德和法律以及商业应用等问题-改善改善ESES细胞得体外培养条件细胞得体外培养条件,建立更有效、更简便得获得建立更有效、更简便得获得 ES ES细胞得方法细胞得方法;-定向诱导分化成特定类型细胞定向诱导分化成特定类型细胞,用于临床疾病治疗并解决用于临床疾病治疗并解决 免疫排斥和潜在得致肿瘤得问题免疫排斥和潜在得致肿瘤得问题;-成体干细胞得横向分化得能力以及与胚胎干细胞得比较成体干细胞得横向分化得能力以及与胚胎干细胞得比较:成体干细胞能否替代胚胎干细胞？成体干细胞能否替代胚胎干细胞？