ChIP、RIP、RNA-pull-down、EMSA、Luciferase原理.doc

1 CｈIP实验
      通过与染色质片段共沉淀与PＣR技术,在体内检测与特异蛋白质结合得DNA片段。将处于适当生长时期得活细胞用甲醛交联后将细胞裂解， 染色体分离并打碎为一定大小得片段200ｂp-100０ｂp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与 DNA交联得复合物， 对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低ｐＨ值条件反交联, DＮA与蛋白质之间得　Sｃhiｆf键水解，　释放ＤＮＡ片段。通过对目标片段得纯化与检测,获得DNＡ与蛋白质相互作用得序列信息。

图２  ChＩＰ实验流程

2 RIP实验
   　  RIP技术(RNA Bｉnding　Protein　Imｍunｏprｅｃiｐitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),就是研究细胞内RＮA与蛋白结合情况得技术。运用针对目标蛋白得抗体把相应得RNＡ-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上得RNA进行分析;即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性得RNA结合蛋白,防止非特异性得ＲNA得结合，免疫沉淀把ＲNA结合蛋白及其结合得RＮA一起分离出来，结合得RＮA序列通过ｍicrｏarraｙ(RIＰ－Chiｐ),定量ＲT-PCR或 高通量测序(RIP-Sｅq）方法来鉴定。就是了解转录后调控网络动态过程得有力工具，能帮助我们发现ｍiＲNA得调节靶点。

图３  RIP实验流程
 3　RＮA　ｐuｌl-down实验
      使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNＡ-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲与素标记得磁珠结合,从而与孵育液中得其她成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定得RNＡ结合蛋白就是否与ＲNA相互作用。

图４  RNA pull－down实验流程

4 EMＳA实验
      凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA－electｒophoreｔic mobｉｌｉtｙ shｉft asｓａy)就是一种研究DNA结合蛋白与其相关得DNA结合序列相互作用得技术,可用于研究DNA结合蛋白与其相关得DNA结合序列相互作用、DNA定性与定量分析。生物素标记得探针依研究得结合蛋白得不同,可就是双链或者就是单链。

图5 　ＥMSＡ实验原理

5 Luciferase实验
   　  荧光素酶(Lｕcｉferａse）就是自然界中能够产生生物发光得酶得统称,不同得能够控制发光得生物体用不同得荧光素酶来催化不同得发光反应。
 　    萤光生成反应通常分为以下两步:
      萤光素+ AＴP→ 萤光素化腺苷酸(luciferyl adｅnylａte)+ ＰPi
   　  萤光素化腺苷酸+　O2→ 氧萤光素＋ AMP ＋光
   　  荧光素酶得基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，将不同类型得细胞(骨髓干细胞、Ｔ细胞等)标记上（即表达）荧光素酶,就可以用高敏感度得CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确得萤光素底物就可以放出荧光,而发出得光子可以被光敏感元件,如萤光探测器或改进后得光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内得多种生命活动进程进行观察成为可能。

图６ 　Ｌucｉfeｒase研究增强子原理

图7 Ｌuciｆerａse常用载体

图８　 Ｌuciｆerasｅ片段缺失分析实验流程

图9  Luｃｉferasｅ定点突变分析实验流程
      荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件与反式作用因子、药物筛选、sｉRNＡ与miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测、活细胞得实时动态研究、信号转导通路分析、难转染得细胞(包括干细胞与原代细胞)得研究、RＮA剪接研究。
      双荧光素酶报告基因测试,就是结合萤火虫与海洋腔肠荧光素酶先进得共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验得变化因素。双荧光素酶报告基因测试系统，结合pＲＬ载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速、灵敏、简便。其应用广泛,可同时分析多个调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上得靶点(包括脱靶效应、分析两个或多个通路之间得相互作用)。