基因组序列的功能解析.ppt

第一第一节 在基因在基因组中中识别基因基因一、一、一、一、识别识别候候候候选选基因基因基因基因1.1.生物信息分析基因的序列特征生物信息分析基因的序列特征生物信息分析基因的序列特征生物信息分析基因的序列特征双双双双链链DNADNA有有有有6 6个个个个 ORFsORFs阅读阅读方式方式方式方式（1 1）开放开放开放开放阅读阅读框架框架框架框架 (ORF(ORF，o openpen r readingeading f framerame)从起始密从起始密从起始密从起始密码码至至至至终终止密止密止密止密码码1-（2 2）ORFORF的平均的平均的平均的平均长长度度度度大大大大肠肠杆菌：杆菌：杆菌：杆菌：317 317 个密个密个密个密码码,酵母菌：酵母菌：酵母菌：酵母菌：483483个密个密个密个密码码,人：人：人：人：约约 450450个密个密个密个密码码.在原核生物中直接在原核生物中直接在原核生物中直接在原核生物中直接寻寻找找找找ORFORF有效。有效。有效。有效。在真核生物中不能直接在真核生物中不能直接在真核生物中不能直接在真核生物中不能直接寻寻找找找找ORFORF。2-在真核生物中不能直接在真核生物中不能直接在真核生物中不能直接在真核生物中不能直接寻寻找找找找ORFORF的原因：的原因：的原因：的原因：62%62%的人的人的人的人类类基因被基因被基因被基因被间间隔开隔开隔开隔开 有内含子，有内含子，有内含子，有内含子，断裂基因断裂基因断裂基因断裂基因 许许多外多外多外多外显显子短于子短于子短于子短于100 100 个密个密个密个密码码，甚至有些少，甚至有些少，甚至有些少，甚至有些少于于于于5050个密个密个密个密码码 3-（3 3）对对 ORFORF扫扫描描描描软软件的修正件的修正件的修正件的修正1 1）密）密）密）密码码偏偏偏偏爱爱在某种生物中并不是所有密在某种生物中并不是所有密在某种生物中并不是所有密在某种生物中并不是所有密码码都被均等使用。都被均等使用。都被均等使用。都被均等使用。2 2）外）外）外）外显显子子子子-内含子内含子内含子内含子边边界界界界 3 3）上游）上游）上游）上游调调控序列控序列控序列控序列:CpG CpG 岛岛:4050%:4050%的人的人的人的人类类基因和脊椎基因和脊椎基因和脊椎基因和脊椎动动物基因物基因物基因物基因中，中，中，中，55上游的上游的上游的上游的GCGC含量高含量高含量高含量高 4-4 4）寻寻找同源序列找同源序列找同源序列找同源序列 到其他模式生物中到其他模式生物中到其他模式生物中到其他模式生物中寻寻找同源序列。找同源序列。找同源序列。找同源序列。如果模式生物的同源序列已如果模式生物的同源序列已如果模式生物的同源序列已如果模式生物的同源序列已经经被被被被鉴鉴定定定定为为某个功某个功某个功某个功能基因的能基因的能基因的能基因的话话.主要用途是主要用途是主要用途是主要用途是对对新序列新序列新序列新序列进进行功能分析行功能分析行功能分析行功能分析.5-2.2.通通通通过实验过实验技技技技术识别术识别基因基因基因基因 检测检测是否是否是否是否转录转录RNARNA分子分子分子分子 .起始密起始密起始密起始密码码上游的数上游的数上游的数上游的数1010个碱基，个碱基，个碱基，个碱基，终终止密止密止密止密码码下游的上百个碱基下游的上百个碱基下游的上百个碱基下游的上百个碱基.包括：包括：包括：包括：6-（1 1）核酸）核酸）核酸）核酸杂杂交交交交实验实验 1 1）Northern blottingNorthern blotting选择选择性剪接或者多基因性剪接或者多基因性剪接或者多基因性剪接或者多基因家族都能家族都能家族都能家族都能产产生多个生多个生多个生多个RNARNA转录转录物物物物mRNA mRNA 一般都是从一个一般都是从一个一般都是从一个一般都是从一个组织组织或器官中得到的或器官中得到的或器官中得到的或器官中得到的7-2 2）zoo-blot(garden blotzoo-blot(garden blot）用用用用Southern blot Southern blot 把一个物种的把一个物种的把一个物种的把一个物种的DNADNA片断与相关片断与相关片断与相关片断与相关的其他物种的的其他物种的的其他物种的的其他物种的编码编码基因基因基因基因DNADNA杂杂交交交交Probe Probe samplesample8-（2 2）cDNA cDNA 测测序序序序（3 3）PCRPCR技技技技术术从从从从cDNAcDNA文文文文库库（cDNA librarycDNA library）中）中）中）中筛选筛选。1 1）RT-PCR(RT-PCR(r reverse everse t transcriptase PCR)ranscriptase PCR)2 2）RACE(RACE(r rapid apid a amplification of mplification of c cDNA DNA e ends nds)9-RACERACE10-（3 3）寻寻找外找外找外找外显显子子子子-内含子内含子内含子内含子边边界界界界.1 1）mRNA-DNAmRNA-DNA杂杂交交交交2 2）外）外）外）外显显子捕子捕子捕子捕获获需要特殊的需要特殊的需要特殊的需要特殊的载载体体体体11-二、确定某个基因的功能二、确定某个基因的功能二、确定某个基因的功能二、确定某个基因的功能1.1.生物信息学分析生物信息学分析生物信息学分析生物信息学分析预测预测基因功能基因功能基因功能基因功能通通通通过过生物信息学分析和生物信息学分析和生物信息学分析和生物信息学分析和实验实验研究研究研究研究 .同源性同源性同源性同源性查询查询:原理：原理：原理：原理：功能相似的基因具有相似的序列功能相似的基因具有相似的序列功能相似的基因具有相似的序列功能相似的基因具有相似的序列（1 1）序列同源性反映了共同祖先的）序列同源性反映了共同祖先的）序列同源性反映了共同祖先的）序列同源性反映了共同祖先的进进化关系化关系化关系化关系直系同源体直系同源体直系同源体直系同源体 （OrthologousOrthologous）:来自不同的物种的同源基因来自不同的物种的同源基因来自不同的物种的同源基因来自不同的物种的同源基因 旁系同源体（旁系同源体（旁系同源体（旁系同源体（ParaloguosParaloguos）:来自同一个生物的同源基因来自同一个生物的同源基因来自同一个生物的同源基因来自同一个生物的同源基因 12-（2 2）同源性分析揭示基因或片断的功能同源性分析揭示基因或片断的功能同源性分析揭示基因或片断的功能同源性分析揭示基因或片断的功能可以分析可以分析可以分析可以分析DNADNA序列，但一般需要把序列，但一般需要把序列，但一般需要把序列，但一般需要把DNADNA转转化成化成化成化成氨基酸序列氨基酸序列氨基酸序列氨基酸序列进进行分析。行分析。行分析。行分析。核酸序列核酸序列核酸序列核酸序列 76%76%相同相同相同相同 (偶然事件偶然事件偶然事件偶然事件 )氨基酸序列只有氨基酸序列只有氨基酸序列只有氨基酸序列只有 28%28%相同！相同！相同！相同！1 1）完整序列比）完整序列比）完整序列比）完整序列比对对13-2 2）部分序列分析）部分序列分析）部分序列分析）部分序列分析寻找共同找共同拥有的有的结构域构域（domain）.如如如如 tudor domaintudor domain 结结构域是序列功能的核心。构域是序列功能的核心。构域是序列功能的核心。构域是序列功能的核心。14-（3 3）同源性分析在酵母基因）同源性分析在酵母基因）同源性分析在酵母基因）同源性分析在酵母基因组计组计划中的划中的划中的划中的应应用用用用 30%30%是通是通是通是通过过同源性同源性同源性同源性分析分析分析分析预测预测的的的的 酵母基因酵母基因酵母基因酵母基因组组含有含有含有含有约约 6000 6000 个基因个基因个基因个基因,其中其中其中其中30%30%是是是是通通通通过过常常常常规规的的的的遗传实验遗传实验确定的确定的确定的确定的.15-2.2.用用用用实验实验确定基因功能确定基因功能确定基因功能确定基因功能（1 1）通通通通过过基因失活分析基因功能基因失活分析基因功能基因失活分析基因功能基因失活分析基因功能将基因突将基因突将基因突将基因突变变，观观察由此引起的表型察由此引起的表型察由此引起的表型察由此引起的表型变变化。化。化。化。1 1）同源重）同源重）同源重）同源重组组失活失活失活失活“Loss of function”“Loss of function”16-酵母的酵母的酵母的酵母的删删除盒除盒除盒除盒用抗生素抗性基因用抗生素抗性基因用抗生素抗性基因用抗生素抗性基因替替替替换换酵母的某一酵母的某一酵母的某一酵母的某一处处基因基因基因基因组组序列序列序列序列17-基因敲除（基因敲除（基因敲除（基因敲除（knock outknock out）小鼠）小鼠）小鼠）小鼠胚胎干胚胎干胚胎干胚胎干细细胞（胞（胞（胞（ES cellsES cells）注射到小鼠胚胎注射到小鼠胚胎注射到小鼠胚胎注射到小鼠胚胎 嵌合体嵌合体嵌合体嵌合体互相交配互相交配互相交配互相交配 纯纯合体敲除小鼠合体敲除小鼠合体敲除小鼠合体敲除小鼠 有些基因是至死基因，只有些基因是至死基因，只有些基因是至死基因，只有些基因是至死基因，只能得到能得到能得到能得到杂杂合体合体合体合体18-2 2）非同源重）非同源重）非同源重）非同源重组组的基因失活的基因失活的基因失活的基因失活1 1）转转座子座子座子座子标签标签：把把把把转转座序列插入到基因中，使基因失活。座序列插入到基因中，使基因失活。座序列插入到基因中，使基因失活。座序列插入到基因中，使基因失活。让转让转座子座子座子座子带带上上上上应应答元件，在外界的答元件，在外界的答元件，在外界的答元件，在外界的诱导诱导下下下下转转座。座。座。座。缺点：缺点：缺点：缺点：不能准确失活一个基因，因不能准确失活一个基因，因不能准确失活一个基因，因不能准确失活一个基因，因为转为转座是个随座是个随座是个随座是个随机事件。机事件。机事件。机事件。19-人工人工人工人工诱导转诱导转座：座：座：座：给给Ty1Ty1 的上游加上半乳糖的上游加上半乳糖的上游加上半乳糖的上游加上半乳糖诱导诱导的启的启的启的启动动子子子子20-2 2）RNARNA干涉（干涉（干涉（干涉（RNA RNA interferenceinterference）与目与目与目与目标标基因序列互基因序列互基因序列互基因序列互补补的短双的短双的短双的短双链链RNARNA能降解目能降解目能降解目能降解目标标基基基基因的因的因的因的mRNA.mRNA.在在在在线线虫虫虫虫1 1号染色体上，号染色体上，号染色体上，号染色体上，2769 2769 个个个个预测预测的基因的基因的基因的基因中的中的中的中的2500 2500 分分分分别别被被被被进进行了行了行了行了RNARNA干涉干涉干涉干涉21-缺点：在哺乳缺点：在哺乳缺点：在哺乳缺点：在哺乳动动物中只能物中只能物中只能物中只能对单细对单细胞胞胞胞进进行行行行处处理，因理，因理，因理，因为为RNARNA在体内的存在在体内的存在在体内的存在在体内的存在时间时间有限。有限。有限。有限。22-（2 2）通通通通过过基因超表达分析基因功能基因超表达分析基因功能基因超表达分析基因功能基因超表达分析基因功能“Gain of function”“Gain of function”23-3.3.未知基因未知基因未知基因未知基因编码编码的蛋白的蛋白的蛋白的蛋白质质功能的精功能的精功能的精功能的精细细研究研究研究研究（1 1）定向突）定向突）定向突）定向突变变删删除或改除或改除或改除或改变变基因序列中的一部分基因序列中的一部分基因序列中的一部分基因序列中的一部分Site-directed mutagenesis(Site-directed mutagenesis(体外定点突体外定点突体外定点突体外定点突变变):):删删除一段除一段除一段除一段插入一段插入一段插入一段插入一段突突突突变变个个个个别别碱基碱基碱基碱基 24-1 1 1 1）寡核苷酸定点突）寡核苷酸定点突）寡核苷酸定点突）寡核苷酸定点突变变25-2 2）同源重）同源重）同源重）同源重组导组导入突入突入突入突变变基因基因基因基因 两步取代：两步取代：两步取代：两步取代：第一步第一步第一步第一步:用用用用标记标记基因取代原基因基因取代原基因基因取代原基因基因取代原基因第二步第二步第二步第二步:用突用突用突用突变变基基基基因取代因取代因取代因取代标记标记基因基因基因基因 失去失去失去失去标记标记 获获得得得得标记标记 26-（2 2）报报告基因（告基因（告基因（告基因（Reporter genesReporter genes）和免疫）和免疫）和免疫）和免疫组织组织化学化学化学化学reporter genes reporter genes 举举例例例例确定基因表达的部位和确定基因表达的部位和确定基因表达的部位和确定基因表达的部位和时时空特征空特征空特征空特征 .基因基因基因基因产物物方法方法lacZ-半乳糖苷半乳糖苷酶组织化学化学 testuidA-葡糖苷酸葡糖苷酸酶组织化学化学 testlux 荧光素光素酶生物生物发光光GFP绿色色荧光蛋白光蛋白荧光光27-1 1）报报告基因告基因告基因告基因2 2）免疫）免疫）免疫）免疫组织组织化学化学化学化学 测测定待定待定待定待测测基因的启基因的启基因的启基因的启动动子子子子确定基因确定基因确定基因确定基因产产物在物在物在物在细细胞内的位置胞内的位置胞内的位置胞内的位置28-研究不同研究不同研究不同研究不同组织组织的不同的不同的不同的不同发发育育育育阶阶段、不同疾病的段、不同疾病的段、不同疾病的段、不同疾病的转录转录物和翻物和翻物和翻物和翻译产译产物物物物三、三、三、三、研究基因研究基因研究基因研究基因组组的整体活性的整体活性的整体活性的整体活性29-1.1.研究研究研究研究转录转录物物物物组组（1 1）基因表达系列分析（）基因表达系列分析（）基因表达系列分析（）基因表达系列分析（SAGESAGE）鉴鉴定定定定细细胞中的全部胞中的全部胞中的全部胞中的全部mRNA mRNA 的相的相的相的相对对丰度。丰度。丰度。丰度。把把把把cDNAcDNA序列与基因序列与基因序列与基因序列与基因组组序列比序列比序列比序列比较较 把把把把 mRNA mRNA 转为转为 cDNA cDNA 把把把把 cDNA cDNA 文文文文库库中的每个克隆都中的每个克隆都中的每个克隆都中的每个克隆都测测序序序序转录物物组学学(transcriptomics)：是一是一是一是一门门在整体水平上研究在整体水平上研究在整体水平上研究在整体水平上研究细细胞中基因胞中基因胞中基因胞中基因转录转录的情的情的情的情况及况及况及况及转录调转录调控控控控规规律的学科律的学科律的学科律的学科.30-基因表达系列分析基因表达系列分析基因表达系列分析基因表达系列分析(SAGE)(SAGE)12-bp 12-bp 短序列足短序列足短序列足短序列足够够特异特异特异特异 4 41212=16 777 216 bp =16 777 216 bp BsmBsm FI FI切割切割切割切割 1014 bp1014 bp的下游的下游的下游的下游.5-AGCT-3 5-AGCT-3 从每个从每个从每个从每个cDNAcDNA末端末端末端末端释释放平均放平均放平均放平均长长度度度度 12 bp12 bp31-（2 2 2 2）基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片cDNAcDNADNADNA32-2.2.研究蛋白研究蛋白研究蛋白研究蛋白质组质组研究一个研究一个研究一个研究一个细细胞中全部蛋白胞中全部蛋白胞中全部蛋白胞中全部蛋白质质的技的技的技的技术术。（1 1）蛋白）蛋白）蛋白）蛋白质组质组学学学学 蛋白蛋白蛋白蛋白质电质电泳泳泳泳第一向第一向第一向第一向:区分分子量的区分分子量的区分分子量的区分分子量的标标准准准准电电泳泳泳泳第二向第二向第二向第二向:区分区分区分区分电电荷的荷的荷的荷的标标准准准准电电泳泳泳泳 双向凝胶双向凝胶双向凝胶双向凝胶电电泳泳泳泳:33-质谱质谱 鉴鉴定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质点的性点的性点的性点的性质质.基基基基质辅质辅助激光解吸助激光解吸助激光解吸助激光解吸飞飞行行行行时间质谱时间质谱 (MALDI-(MALDI-TOF):TOF):质质荷比荷比荷比荷比 （Mass-to-charge ratioMass-to-charge ratio）分析分子量，）分析分子量，）分析分子量，）分析分子量，然后推然后推然后推然后推导导氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸组组成成成成34-35-（2 2）鉴鉴定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质的相互作用的相互作用的相互作用的相互作用如果知道位置蛋白与某个已知蛋白相互作用的如果知道位置蛋白与某个已知蛋白相互作用的如果知道位置蛋白与某个已知蛋白相互作用的如果知道位置蛋白与某个已知蛋白相互作用的话话，就能推就能推就能推就能推测测其功能。其功能。其功能。其功能。噬菌体展示噬菌体展示噬菌体展示噬菌体展示噬菌体展示文噬菌体展示文噬菌体展示文噬菌体展示文库库:将未知基因与噬菌体表面蛋白融合，表将未知基因与噬菌体表面蛋白融合，表将未知基因与噬菌体表面蛋白融合，表将未知基因与噬菌体表面蛋白融合，表达到噬菌体表面达到噬菌体表面达到噬菌体表面达到噬菌体表面36-37-酵母双酵母双酵母双酵母双杂杂交系交系交系交系统统38-（3 3）蛋白）蛋白）蛋白）蛋白质质相互作用相互作用相互作用相互作用图图画出蛋白画出蛋白画出蛋白画出蛋白质组质组中所有中所有中所有中所有组组分的相互作用分的相互作用分的相互作用分的相互作用图图。细细菌菌菌菌 Helicobacter pyloriHelicobacter pylori:画出了画出了画出了画出了1200 1200 个相互作用个相互作用个相互作用个相互作用 (占蛋白占蛋白占蛋白占蛋白质组质组的一半）的一半）的一半）的一半）酵母酵母酵母酵母 1870 1870 个蛋白之个蛋白之个蛋白之个蛋白之间间的的的的22402240个相互作用个相互作用个相互作用个相互作用 39-The yeast protein interaction map.The yeast protein interaction map.Red dots are essential proteins Red dots are essential proteins orange lead to slow growthorange lead to slow growth yellow dots are not knownyellow dots are not knowngreen dots are non-lethalgreen dots are non-lethal40-