质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法)-S2517实验室-第三组.ppt

质粒DNA的小量快速提取（碱裂解法）S2517实验室 第三小组2015年11月17日目录Content一、实验目的二、实验原理三、实验器材与试剂四、实验操作五、思考题一、实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。注释：质粒（plasmid）:大小在1kb200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其在胞内的存在一般对宿主细胞的代谢活动无影响。SDS:十二烷基硫酸钠,用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸。经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。氨苄西林:（2S，5R，6R)-3，3-二甲基-6-（R)-2-氨基-2-苯乙酰氨基-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环3.2.o庚烷-2-甲酸三水化合物，为半合成的广谱青霉素。本实验中，大肠埃希菌对其敏感，通过与青霉素结合蛋白（PBPs）结合，干扰细菌细胞壁的合成起到抗菌作用。Tris-HCl：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷。在这里，Tris缓冲液主要是做核酸和蛋白质的溶剂。EDTA：四乙酸二氨基乙烷（二氨基乙烷四乙酸），又叫托立龙、依地酸。EDTA 是一种重要的络合剂。EDTA用途很广，可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添加剂，血液抗凝剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性配合物。在这里主要作用是降低细胞膜的稳定性。TE缓冲液:TE是由Tris和EDTA配置而成的，呈弱碱性,主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA。RNase A：是一种被详细研究和具有广泛应用的5核酸内切酶。RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。RNase A专一地催化RNA的核糖在C（胞嘧啶）和U（尿嘧啶）残基下一个核苷酸的5磷酸二酯键裂开，形成具有 2,3-环磷酸衍生物3C或3U寡聚核苷酸。如 pG-pG-pC-pA-pG 被切割产生pG-pG-pCp 和 A-pG。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。DNase：脱氧核糖核酸酶。是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。二、实验原理 在含有SDS的碱性条件下，细菌细胞壁破裂，释放出来的染色体DNA、质粒DNA和蛋白质等都发生变性。当加入酸性的醋酸钾溶液将pH中和至中性时，质粒DNA为共价闭合环状结构，很快复性并溶解在溶液中。而染色体DNA由于相对分子质量大难以复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去;然后用酚/氯仿抽提进一步除去少量残留的蛋白质；最后用乙醇沉淀获得质粒DNA。三、实验器材与试剂（一）器材 高压灭菌器，恒温摇床，高速离心机，微量可调试移液器，1.5mL离心管等。（二）试剂 1.LB液体培养基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g,NaCl 10 g,去离子水950mL。待溶质完全溶解后，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积1000mL，121，1.01105 Pa高压蒸汽灭菌20min。2.氨苄西林 100 mg/mL。3.溶液一 50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),10mmol/L EDTA(pH 8.0)。4.溶液二（新鲜配制）0.2mol/L NaOH,1 SDS。5.溶液三 0.5mol/L醋酸钾60 mL,冰醋酸11.5 mL，H2O 28.5 mL。6.酚/氯仿 将酚和氯仿等体积混合，用Tris-HCl平衡至pH 7.6，置于棕色瓶中4保存。7.TE缓冲液（pH 8.0)10mol/L Tris-HCl(pH 8.0),1mmol/L EDTA 8.RNase A(10 mg/mL)。9.70%乙醇、无水乙醇。四、实验操作 1.细菌培养 将含有pQE30质粒的大肠埃希菌TG1 10 L 接种到10 mL含氨苄西林（100 g/mL)的LB培养液中，37振摇过夜。2.收集细菌 取1.5 ml菌液转入离心管中，10000 r/min离心1 min，弃上清。3.悬浮细菌 将细菌沉淀重悬于100 L用冰预冷的溶液一中，剧烈振荡使细菌沉淀悬浮。注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则所提质粒DNA的纯度及得率会大大降低。溶液一的作用是分散细胞，并鳌合金属离子使能够破坏质粒DNA的DNase失活。4.碱液裂解 加200 L新配制的溶液二。轻缓颠倒离心管68次，使管内内容物混匀，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置2min。溶液二的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱性条件下变性。5.中和与复性 加150L用冰预冷的溶液三。轻缓颠倒数次，使溶液三在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5 min。溶液三的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA与蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。6.离心沉淀 用台式高速离心机12000 r/min 离心5 min，将含有质粒DNA的上清转入另一离心管中。7.酚/氯仿抽提除蛋白 加等体积酚-氯仿，剧烈振荡混匀，静置3 min待其分层后，12000 r/min离心10 min，将上层液转入另一离心管中。8.乙醇沉淀质粒DNA 加入2倍体积的无水乙醇，振荡混合，静置5min使质粒DNA形成沉淀。12000 r/min 离心10 min，收集质粒DNA沉淀，弃上清液。9.乙醇洗盐 质粒DNA沉淀里含有一定量的盐分需除去。加1 ml 70%乙醇，轻缓摇动数次，12000 r/min离心2 min。弃上清液。10.溶解质粒DNA 待残余乙醇挥发干净后，加30 L TE缓冲液（pH 8.0）溶解沉淀，加2 L RNase A(10 mg/mL),37保温30min以去除RNA。所得质粒DNA置-20保存备用。质粒DNA的还有以下几种提取方法：煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等但碱裂解法有操作简便、快速、得率高的优点。五、思考题 1.溶液一，二，三的作用分别是什么？加溶液一、二、三时要注意哪些问题?溶液一的作用是分散细胞，并鳌合金属离子使能够破坏质粒DNA的DNase失活。溶液一使用前需用冰预冷。溶液二的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱性条件下变性。溶液需要新鲜配制。溶液三的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA与蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。溶液三使用前需用冰预冷。2.实验中加入酚-氯仿、无水乙醇、70%乙醇和RNaseA的作用分别是什么？酚变性蛋白质；氯仿萃取溶液中的酚；无水乙醇（2倍体积）沉淀质粒DNA；70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分；RNase A 对RNA有水解作用有问题？您说话谢谢聆听