DB65∕T 4119-2018 绵羊细管冷冻精液操作规程(新疆维吾尔自治区).pdf

ICS 65.020.30 840 新疆维吾尔自 J口DB65 区地方标准DB 65/T 4119-2018 绵羊细管冷冻精液操作规程Technical Practice Specification for Sheep Frozen Semen Straws 2018 -04 -30发布2018一05-30实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布DB65/T 4119-2018 目IJ1=1 本标准按GB/T1. 1 -2009 (标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写的要求编制。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧总站提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。本标准起草单位:新疆维吾尔自治区畜牧总站、新疆天山畜牧生物工程股份有限公司。本标准主要起草人:耿娟、卫新瑛、谭世新、王玉钦、杨楠、王爱芳、孙岩、邓强、热孜亚买买提、程黎明、贾旭升、田晓阳、王永力、陈蕾。D865/T 4119-2018 绵羊细管冷冻精液操作规程1 范围本标准规定了绵羊细管冷冻精液(以下简称细管冻精)制作前的准备、采精、精液品质外观检查、精液稀释保护液与配制、细管冻精封装打印程序、冷冻、冻精规格与质量、解冻、冻精包装、标记、贮存和运输的要求。本标准适用于绵羊细管冷冻精液的制作技术。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 5458 液氮生物容器3 细管;东精制作前的准备3. 1 采精前的准备3. 1. 1 采精用假阴道消毒采精用的假阴道外壳、假阴道内胎应提前用不高于600C的温热清水冲洗，适当使用少量洗涤液刷洗干净后用清水、蒸馆水冲洗，再用75%的酒精棉球擦拭消毒内外壳后，放置在恒温干燥箱内2h4 h烘干备用，涂抹假阴道的凡士林必须提前隔水煮沸消毒30mino 3.1.2 采精常用器具消毒采集精液所用玻璃器具(集精杯、温度计)、假阴道充气活塞、慑子等都必须用洗涤液热水清洗后用75%酒精棉球擦洗消毒，再用蒸馆水冲洗3遍后置于烘箱中加热至1200C，消毒30min后待用。3.1.3 装卸假阴道程序(1)将羊用集精杯插入假阴道一段(2)用0.9%氯化纳溶液冲洗假阴道内壁2次(3)假阴道夹层注入500C600C温水，水量控制在150mL-180 mL。添加假阴道内壁的水温应根据季节的变化调整温度，内胎温度保持在380C-40oC用于采精。(4)通过假阴道夹层开关出口处吹气，使内胎形成三角形:(5)凡士林涂抹假阴道内壁整体面积的2/3处待用。3.2 种公羊的采前准备公羊采精前应先用O.1%的高考孟酸饵溶液清洗阴茎和包皮，然后再用0.9%的灭菌生理盐水冲洗干净后待采。采精用的台羊一般选择发情旺盛的健康母羊(也可采用台羊)。4 采精DB65/T 4119-2018 4. 1 种公羊质量标准4.1.1 用于制作细管冻精的种公羊，其体型、外貌特征和生产性能均应符合该品种标准特、一级以上的种羊。4.1.2 主力公羊要进行后裔测定，对优秀个体延长使用年限，充分发挥其利用率。4.1.3 用于细管冻精制作的种公羊应严格执行隔离、检疫程序，不允许有己发布的一类疫病、二类疫病中任何一种疫病。4.2 采精方法将台羊固定在采精架上，采精员蹲在台羊右侧后方，右手握假阴道，气卡塞向下，靠在台羊臀部，假阴道和地面约呈450，当公羊爬跨、伸出阴茎时，迅速向前用左手托着公羊包皮，右手持假阴道与台羊成400450 ，假阴道入口斜向下方，左右手配合将公羊阴茎自然地引入假阴道口内(切勿用手捉拿阴茎)，公羊射精动作很快，发现抬头、挺腰、前冲，表示射精完毕。随着公羊从台羊身上滑下时，缓慢地把假阴道脱出，并立即将假阴道入口斜向上方，打开活塞放气，使精液尽快、充分地流入集精管内，然后小心地取下集精管并记录公羊号，放于300C恒温水槽待检。4.3 采精频率配种季节，成年种公羊每周采精4次6次，也可一天采精2次(间隔时间为10min15 min)休息一天，其他时间可减少采精次数，每周采精2次4次。5 精液晶质外观检查5.1 精液晶质外观目测法5. 1. 1 色泽新鲜精液色泽呈乳白色或稍带浅黄色为正常精液。5.1.2 气昧原精液的气味应表现出无味或略带腥味。5.1.3 射精量采用刻度滴管测量射精总量。5.2 精子密度5.2.1 肉眼观测法在载玻片上滴一滴原精，在400倍600倍显微镜下观察评定密度:显微镜视野内精子密集，精子间几乎无空隙者评为密每毫升约30亿60亿精子:精子间隙大约为一个精子距离者评为中每毫升约20亿30亿精子:间隙超过一个精子距离评为稀每毫升约10亿20亿精子:视野内只能看到少数精子或无精子者评为无。5.2.2 密度测定仪测定采用密度测定仪测定精子密度。2 DB65/T 4119-2018 5.3 精液活力显微镜检查方法5.3.1 温度评定精子活力的显微镜载物台温度为3TC-380C为宣，也可利用自制保温箱380C-400C检查活力。5.3.2 活力检查方法5.3.2.1平板压片法在载玻片上滴一滴精液，然后用盖玻片均匀盖着整个液面，做成压片检查标本，在200倍-400倍显微镜下观察活力。5.3.2.2 悬滴检查法在盖玻片上滴一滴精液，然后再凹玻片上的凹窝中作成悬滴状检查标本，置于显微镜下放大400倍进行观察。5.4 精子活力评定方法5.4.1 盖玻片和载玻片要事先洗净擦干，检查活力时应预热。5.4.2 评定精液活力时水浴锅的温度须保持在320C-38. 50C温度下检查活力为宜。有条件的单位可用带有恒温装置的显微镜或在显微镜的载物台上装一个恒温器观察活力。5.4.3 每个滴片要观察三个以上视野，不同层面的精子运动状况，所呈现的前进运动精子数所占的百分率并给予评定。5.4.4 采用0-10的十级评分法评分，也可采用百分制进行评定。5.5 精液晶质种公羊的新鲜精液应符合下列质量标准方可冻精，对其中任何一项不符合标准的，不得用于制作冷冻精液。a)原精液精子活力:即呈直线前进运动精子活力二三65%;b)原精液精子密度二三10X108个/mL; c)原精液精子畸形率运15%。6 精液稀释保护液与配制配制冻精用的稀释保护液，必须使用双重蒸馆水、新鲜的卵黄和化学分析纯试剂等，所用器具保证清洁、干燥、无菌。6. 1 配制要求6. 1. 1 所有稀释溶液(除卵黄外)都必须经过滤后并在水浴中煮沸消毒，冷却至350C-380C，再加卵黄和抗菌素，甘油单独水浴蒸煮消毒30min-45 min。6.1.2 配制好的稀释液应做好标记，并将三角瓶口盖用滤膜封好后放入40C的冰箱冷藏。6.1.3 稀释保护剂必须现用现配。6. 2 配方成分Tirs拧橡酸纳果糖抗菌素甘油蛋黄双蒸水3 DB65/T 4119-2018 6.3 稀释:夜配置方法6.3. 1 100 mL基础液二100mL双蒸水+3.5gTirs +1.8 g拧橡酸纳+1g果糖。6.3.2 100 mLA液=85mL基础液+15mL卵黄+0.03g硫链霉素6.3.3 100 mLB液=90mLA液+10mL甘泊6.4 稀释方法采用两次稀释法，A液不加甘油，B液添加甘油，经两次稀释后甘油总量(46)mL/100 mL为宜。6.5 稀释比例根据原精液密度和活力确定稀释倍数，稀释比例以1:11:5为宜，确保每一剂量冻精的有效精子数能达到1500万。6.6 降温与平衡时间稀释后的精液在300C350C范围采用逐渐降温法，在1h2 h内使稀释后的精液温度降至40C，并在恒温容器内平衡2h4 h。6. 7 降温平衡注意事项6. 7. 1 制备细管冻精的操作室应清洁干净，易于消毒并具有消毒设施，操作人员必须严格遵守实验室着装要求进行无菌操作，严格禁止异味存在(酒昧、烟味)。6.7.2 降温平衡后精液在封装打印前，匀速充分混匀，并检查冻前精子活力。7 细管冻精封装打印程序7. 1 准备工作7. 1. 1 精液装管前一小时打开低温操作柜，使温度保持在40C。7.1.2 依次打开由电脑控制的喷墨印字机、细管封装机、超声波发生器、细管传送机操作系统和计数系统，进入工作状态。7.1.3 安装调试好细管封装一体机部件后，将待装细管和平衡好的稀释精液放在低温操作柜中准备封装。7.2 封装打印7. 2. 1 将公羊精液信息输入主控系统中，打开系统计数器等待封装。7.2.2 确认操作系统及各部件运行正常后开始封装。7.2.3 每头公羊的精液封装完成后记录生产细管数。7.3 封装注意事项7.3.1 封装过程中，应将稀释后的精液摇匀后倒入锥形碗中。7.3.2 更换羊号时注意清洗、更换封装头。7.3.3 细管印字清晰。8冷;东4 DB65/T 4119-2018 8.1 冻前准备工作8. 1. 1 封装后将细管上架准备冷冻。8.1.2 按程序依次打开灌装一体机所有仪器及电源，将封装好的细管冻精整齐排放在冷冻架上准备冷冻。8.1. 3 冷冻完毕后所有需要清洗的仪器部件拆卸清洗消毒烘干，为下次使用做好准备。8.2 冷冻8.2.1 将液氮阀、增压阀打开进行增压，待液氮压力(不能超过o.3 MPa)平稳后开始冷冻操作。8.2.2 开启冷冻程序，将冷冻仪预冷至4C按照设定好的冷冻程序开始冷冻。8.2.3 将冷冻好的细管冻精分别放入一1400C的环境中保存，等待包装。9 冻精规格与冻精质量9. 1 冻精规格9. 1. 1 细管剂型0.25mL细管9.1.2 剂量:细管冻精二三O.18 mL 9.2 冻精质量标准9.2.1 每一剂量细管冻精中总精子数二三5000万，每一剂量细管冻精中直线前进运动精子数二三1500万。9.2.2 解冻后的精子活力二三35%以上。9.2.3 解冻后的精子畸形率运20%。9.2.4 解冻后的每一细管精液中菌落数运800个。10 解冻恒温水浴锅温度和相差显微镜恒温板温度均调整至370C38. 50C为宜。10. 1 操作要领用预冷的慑子从液氮罐中快速取出l支细管冻精投入水浴锅中，轻摇10s15 s后取出。用灭菌纱布擦干水渍，双手搓动数下使其均匀，用细管剪刀剪去封口段1cmr-.-1.5cm，滴一滴精液置于载玻片上观察活力，合格者入库。10.2 注意事项10.2. 1 从液氮罐中提取细管精液时提桶的顶端提取高度要低于白线，以防冻精暴露在空气中。10.2.2 5 s内未能从液氮罐中及时取出冻精，要重新放入液氮中，30 s后再试。10.2.3 冻精解冻过程中避免阳光直射，解冻后的精液即可输精，30 min内完成输精。10.3 冻精活力检查按照本规程5.3方法进行检查11东精包装、标记、贮存和运输5 D865/T 4119-2018 11. 1东精包装细管冻精应封口良好，以25支包装单位装入特制的塑料拇指管内，再以50支200支为一个单位装消毒纱布袋中置于液氮中贮存。11. 2 标记11. 2. 1 细管冻精外包装上应标记有冻精制作时间、解冻后活力、制作单位、冻精数量、品种代码及种公羊号等。11.2.2 细管冻精壁上应有鲜明的标记:注明场名、精液制作日期、品种代号、公羊号(具体操作方法参见附录A)。11. 3 贮存和运输11. 3. 1 贮存贮存冻精的低温容器应符合GB/T5458的规定:专人负责及时补充液氮，细管冻精应浸在液氮中:每只公羊的冻精应单独贮存:贮存细管冻精的容器每年至少清洗、消毒1次并更换新鲜液氮;取放时，细管冻精离开液氮的时间不得超过10s。11.3.2 运输冻精运输过程中应有专人负责，贮存容器不得横倒、碰撞和强烈振动，保证细管冻精始终浸在液氮中。6 0865/T 4119-2018 附录A(资料性附录)绵羊公羊品种代号A. 1 导言本附录给出了最简称的绵羊公羊品种代号。A.2 原则和方法以绵羊品种英译汉的汉语名称第一和第二个字的汉语拼音的第一字母组合:同一品种毛色不同的，在该品种代号前加该毛色的汉语拼音的第一字母:涉及国家为多字的，以该国的第一字和品种第一字的汉语拼音第一字母组合:如仍不能区分则再加上区分性状的第一字的汉语拼音的第一字母:如品种代号按照上述规则简写后仍有重号，则品种分布较为广泛性的取汉语名称第一和第二个字的汉语拼音的第一字母组合:其它取第一、第二和第三个字的汉语拼音的第一字母组合:示例1:陶赛特羊的品种代号以陶和塞两个汉语拼音第一字母组合为TS;示例2:中国美利奴羊(军垦型)的品种代号以中、美和军三个汉语拼音第一字母组合为ZM;A. 3 不同品种公羊代号不同品种公羊代号见表A.3表A.3不同晶种公羊代号公羊品种品种代号公羊品种品种代号阿勒泰羊AL 罗布羊LB 白头杜泊羊BDB 黑头萨福克羊SF 巴尔楚克羊BE 特克塞尔羊TK 巴什拜羊BS 陶赛特羊TS 白头萨福克羊BSF 塔什库尔干羊TSK 巴音布鲁克羊BY 吐鲁番黑羊TL 策勒黑羊CL 小尾寒羊XWH 黑头杜泊羊DB 柯尔克孜羊KE 多浪羊DL 新吉细毛羊X 德国美利奴羊DM 新疆细毛羊XX 哈萨克羊HSK 叶城羊YC 大尾寒羊DWH 中国卡拉库尔羊ZK 湖羊HY 中国美利奴羊(军垦型)ZM 和田羊HT 中国美利奴羊(新疆型)ZMX 7 D865/T 4119-2018 A.4 常用公羊品种不同剂型冻精包装颜色及品种代号常用公羊品种不同剂型冻精包装颜色及品种代号见表A.4表A.4常用公羊品种不同剂型冻精包装颜色及品种代号公羊品种细管冻精颜色品种代码阿勒泰羊白色AL 臼头杜泊羊臼色BDB 黑头杜泊羊白色DB 多浪羊白色DL 德国美利奴羊白色DM 大尾寒羊白色DWH 黑头萨福克羊白色SF 特克塞尔羊白色TK 陶赛特羊白色TS 小尾寒羊白色XWH 备注:未列入品种可参照A.2自行编制。8