DB45∕T 2755-2023 百香果品种鉴定技术规程 SSR分子标记法(广西壮族自治区).pdf

ICS 65.020.20 CCS B 05 45 广西壮族自治区地方标准 DB45/T 27552023 百香果品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 Code of practice identification of passion fruit varieties by SSR molecular marker method 2023-08-10 发布 2023-09-30 实施 广西壮族自治区市场监督管理局 发 布 DB45/T 27552023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 原理.2 6 材料和试剂.2 一般规定.2 6.1 试剂.2 6.2 溶液配制.2 6.3 7 仪器和设备.3 8 SSR 引物序列信息.3 9 操作步骤.4 样品采集.4 9.1 DNA 提取.4 9.2 PCR 扩增.4 9.3 PCR 产物检测.4 9.4 10 数据记录与统计.5 数据记录.5 10.1 统计.5 10.2 11 结果判定.6 判定方法.6 11.1 结果表述.6 11.2 附录 A（规范性）引物序列信息.7 DB45/T 27552023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西检验检疫标准化技术委员会提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西绿保环境监测有限公司、广西智标云信息科技有限公司、南宁海关技术中心、广西壮族自治区种子管理站、百色市检验检测中心、南宁维尔凯生物科技有限公司。本文件主要起草人：赵永锋、姚振光、何京明、黎保序、朱秋莲、莫璋红、苏丽梅、薛海燕、梁俊、黄小娟、王丹、劳苏海、莫薇、黄鹂、郑美玲、官月香、韦仁矿、韦东、黄芳、刘守廷。DB45/T 27552023 1 百香果品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 1 范围 本文件界定了百香果品种鉴定技术的相关术语和定义，规定了利用简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记法进行百香果品种鉴定的原理、材料和试剂、仪器设备、引物序列信息、操作步骤、数据记录和统计、结果判定。本文件适用于广西壮族自治区行政区域内基于SSR分子标记的百香果品种SSR指纹数据采集和品种鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA分子标记法 总则 3 术语和定义 NY/T 2594界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 核心引物 core primer 品种鉴定中优先选用一套简单重复序列（SSR）引物，其检测位点具有多态性高、重复性好等综合特性。3.2 对照品种 control variety 具有所用SSR位点上不同等位变异的特性，用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差的一类品种。3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 利用DNA在体外摄氏95 高温时变性会变成单链，低温（经常是60 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72 左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5-3）的方向合成互补链。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。SSR：简单重复序列（Simple Sequence Repeat）。PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction）。DB45/T 27552023 2 DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribo Nucleic Acid）。5 原理 不同品种百香果的基因组成不同，其基因组中SSR的重复次数存在差异，根据SSR的差异，通过PCR扩增及电泳技术可以鉴定百香果品种。6 材料和试剂 一般规定 6.1 除另有说明外，本文件中使用分析纯（含）以上试剂，水为符合GB/T 6682规定的二级水，其中PCR用水要求达到一级水指标。试剂 6.2 6.2.1 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：纯度99.0。6.2.2 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）：纯度99.0。6.2.3 硼酸（H3BO3）：=1.43 g/cm，含量99.5。6.2.4 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：=1.32 g/mL，纯度99.0。6.2.5 氯化钠（NaCl）：=2.165 g/cm，含量99.5。6.2.6 琼脂糖。6.2.7 过硫酸铵（(NH4)2S2O8）：=1.98 g/cm，含量98.0。6.2.8 氢氧化钠(NaOH）：=2.13 g/cm，含量96.0。6.2.9 硝酸银（AgNO3）：=4.35 g/cm，含量98.0。6.2.10 甲醛（HCHO）：=0.815 g/cm。6.2.11 液氮（N2）：=0.81 g/cm。6.2.12 三氯甲烷（CHCl3）：=1.50 g/cm。6.2.13 无水乙醇（CH3CH2OH）：=0.79 g/cm，含量99.7。6.2.14 DNA 分析仪用 LIZ 500 分子量内标。6.2.15 去离子甲酰胺（CH3NO）：=1.133 g/mL。6.2.16 40丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（Acryl/Bis Solution(29:1)）。6.2.17 四甲基乙二胺（TEMED）：=1.32 g/mL。6.2.18 DNA 分子量标准（DNA marker）：可以清楚区分 50 bp500 bp 的 DNA 片段。6.2.19 2 Taq Plus PCR 预混试剂：0.1 U/L Taq Plus Polymerase、500 mol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、稳定剂、增强剂。溶液配制 6.3 6.3.1 5TBE 缓冲液 称取5.40 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.372 g 乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.75 g硼酸（6.1.3）溶于70 mL一级水中，定容至100 mL，在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。6.3.2 0.5TBE 缓冲液 量取100 mL浓度5TBE（6.2.1）缓冲液于烧杯中，加入900 mL一级水混匀。DB45/T 27552023 3 6.3.3 CTAB 提取溶液 称取4.00 g十六烷基三甲基溴化铵（6.1.4）、16.38 g氯化钠（6.1.5）、1.21 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、1.49 g 乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）溶于70 mL一级水，定容至200 mL，在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。6.3.4 无菌一级水 一级水在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。6.3.5 1琼脂糖溶液 1 g琼脂糖（6.1.6）溶于100 mL的0.5TBE缓冲液（6.2.2），适当加热融化。6.3.6 10过硫酸铵溶液 称取10 g过硫酸铵（6.1.7），加入100 mL一级水溶解。6.3.7 电泳缓冲液 称取108 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、7.44 g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）、55 g硼酸（6.1.3）、0.80 g氢氧化钠（6.1.8），加入10 L一级水溶解。6.3.8 染色液 称取0.2 g硝酸银（6.1.9），加入400 mL一级水溶解。6.3.9 显色液 称取4.0 g氢氧化钠（6.1.8），加入400 mL一级水溶解，临用时再加1.6 mL甲醛（6.1.10）。7 仪器和设备 电子天平：感量为 1 mg。7.1 水浴锅。7.2 高速冷冻离心机。7.3 PCR 扩增仪。7.4 垂直板电泳系统。7.5 凝胶成像系统。7.6 毛细管电泳仪。7.7 胶片观察灯。7.8 涡旋振荡仪。7.9 8 SSR 引物序列信息 引物序列信息按附录A。DB45/T 27552023 4 9 操作步骤 样品采集 9.1 随机取5个单株，用不锈钢剪刀采集种植的待测品种的百香果嫩叶放入塑料样品袋中，做好标识，放入0 8 保温箱中，带回实验室，于-18 及以下条件保存。DNA 提取 9.2 称取9.1中1 g2 g百香果叶片用自来水冲洗干净，再用一级水冲洗两遍，自然晾干后用不锈钢剪刀剪碎放入研钵中，加入液氮（6.1.11）研磨成粉末状，称取100 mg放入1.5 mL离心管中，加入750 L CTAB提取溶液（6.2.3），涡旋振荡混匀后于65 水浴45 min60 min，期间每隔15 min颠倒离心管混匀；加入500 L的三氯甲烷（6.1.12），颠倒混匀，12 000 r/min 离心3 min，转移上清液约0.5 mL至新离心管中，加入等体积（即0.5 mL）预冷至约4 的无水乙醇（6.1.13），颠倒混匀，-18 下静置1 h，12 000 r/min 离心3 min，弃去上清液，室温下挥干沉淀。加入50 L无菌一级水（6.2.4）混匀后于-18 及以下条件保存。注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量的DNA提取方法也适用于本文件。PCR 扩增 9.3 9.3.1 PCR 反应体系 PCR反应体系参见表1。表1 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 L 灭菌一级水-8.5 2 Taq Taq Plus PCR预混试剂 1 12.5 10 mol/L正向引物 0.4 mol/L 1.0 10 mol/L反向引物 0.4 mol/L 1.0 25 ng/L DNA模板 2.0 ng/L 2.0 总体积-25.0 9.3.2 PCR 反应程序 94 预变性5 min；94 变性30 s，退火30 s（退火温度按附录A），72 延伸30 s，35个循环；最后72 下延伸7 min。PCR 产物检测 9.4 9.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 9.4.1.1 聚丙烯酰胺凝胶制备 在一对玻璃板间插入1.0 mm宽的间隔片，在封口处注入1琼脂糖溶液（6.2.5），让其凝固密封。在50 mL量杯中依次加入7.5 mL 5 TBE缓冲液（6.2.1），7.5 mL 40 Acryl/Bis Solution(29:1)（6.1.16），搅拌并用一级水定容至30 mL；加入200 L 10过硫酸铵（6.2.6）和12 L四甲基乙二胺溶液（6.1.17），混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在50 min60 min内聚合凝固，凝胶高度不应小于10 cm。DB45/T 27552023 5 9.4.1.2 电泳 将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入电泳缓冲液（6.2.7），小心拔下样品梳。用加样器吸取1 L不同引物PCR产物，加入样品孔中，同时在同一块胶中加入1 L DNA marker（6.1.18）。电泳选用的电压梯度为1 V/cm5 V/cm，2Taq Plus预混试剂（6.1.19）的蓝色指示带从上到下分别到达胶板1/2、2/3 处（50 min70 min）后结束电泳。9.4.1.3 银染显色 银染显色按下列步骤操作。a)固定：将附着凝胶的玻璃板用去一级水冲洗 30 s60 s 后，将凝胶放入方形不锈钢盘中；b)染色：加入染色液（6.2.8）覆盖凝胶，轻摇 5 min10 min 进行染色；c)漂洗：倒掉染色液，用去一级水快速漂洗两次，每次 20 s；d)染色：放入显色液（6.2.9）中，轻摇至显色出清晰带纹；e)漂洗：取出凝胶用一级水冲洗两次；f)沥干后进行拍照。9.4.2 毛细管电泳检测 9.4.2.1 PCR 产物样品准备 分别量取等体积的稀释后不同引物PCR扩增产物溶液混合，从混合液中吸取1 L按序号加入到DNA分析仪专用96孔板孔中，板中各孔分别再加入0.1 L DNA LIZ 500 分子量内标（6.1.14）和8.9 L去离子甲酰胺（6.1.15）。将样品在PCR仪上95 变性5 min，取出，迅速置于冰浴中，冷却10 min15 min。将整个96 孔板置于4 000 r/min离心机中，离心10 s后放置到DNA分析仪上待检。9.4.2.2 电泳检测 按照仪器操作规程，编辑样品表及运行程序，执行运行程序，仪器自动给出检测结果，保存并记录数据。10 数据记录与统计 数据记录 10.1 10.1.1 样品每个 SSR 位点等位变异采用扩增片段长度表示；10.1.2 对于毛细管电泳检测方法，使用对照品种消除 DNA 分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取位点等位变异；10.1.3 对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，将待检样品与对照品种的等位变异片段进行比较，明确待检样品位点等位变异。统计 10.2 纯合位点结合等位变异大小数据记为 X/X，其中 X 为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异大小数据记录为 X/Y，其中 X、Y 分别为该位点上的 2 个等位变异的大小，小片段数据在前、大片段数据在后；缺失位点的等位变异大小数据记录为 0/0。示例1：样品在某个位点上仅出现 1 个等位变异，大小为 160 bp，则该位点的等位变异数据记录为 160/160。示例2：样品在某个位点上仅出现 2 个等位变异，大小为 160 bp、165 bp，则该位点的等位变异数据记录为 160/165。DB45/T 27552023 6 11 结果判定 判定方法 11.1 11.1.1 待检样品和对照品种间差异位点数2，判定为“不同品种”。11.1.2 待检样品和对照品种间差异位点数=1，判定为“近似品种”。11.1.3 待检样品和对照品种间差异位点数=0，判定为“极近似品种或相同品种”。结果表述 11.2 待测样品 与对照样品 （或数据库中 已知品种）利用 分子标记类型，采用 检测平台，采用 位点组合进行检测，结果显示：检测位点数为 ，差异位点数为 ，判定为（相同或疑同）。DB45/T 27552023 7 A A 附录A （规范性）引物序列信息 引物序列信息按表A.1。表A.1 引物编号及引物扩增信息 序 号 引物名称 条带大小 bp 引物退火温度 引物序列（5-3）1 PeRM10001 95107 50 正向：GCA TGG ACT TGA TTT GTA TAT TCT 反向：GAG AAC AAT GAT GTC ACT TTC ATA 2 PeRM10005 98140 50 正向：TAG TGA CAT AAC TGA AAA CGC TAT 反向：GAG TTA CCG CTG AAG TTT TCT A 3 PeRM10006 149190 50 正向：TCA TTA ACA TCG TAA ACA AAG ATT 反向：AAT TCG ACA AGA TTT ACT GAT ACA 4 PeRM10007 95106 50 正向：GTA GTA GGA GAA TAT TTG AGG GAA 反向：CTA TTT TGT GAT CCA AGG AAG T 5 PeRM10008 105123 50 正向：GTC ACT ATC ATC CCA TAA AAA TTC 反向：AGG TAA AAT TAA TAT GAT AAG CGA A 6 PeRM10009 135145 50 正向：GAT TGA TTT GTG GAT GGA TAC T 反向：CAC TTG TTT CAC TCG TAC AAT AAT 7 PeRM10011 120130 109 55 正向：ATG GAG AAG ACT TCA GAG TCA C 反向：AGA GAT ATT TTT CAC TCA CTG GAT 8 PeRM10012 135180 151 50 正向：CTC CAT ATC AGA TTA AGT AAC CAC 反向：CTC AAA TAA AAA CAA ACC TGT TAC 9 PeRM10014 130140 50 正向：CAT TTA TAA AGG AAT TGA CAA GAA 反向：CTG AGT TAA TGC TGT GAT TAA GAT 10 PeRM10016 149 50 正向：AAT TTT CTT GGC TTA AAA CAC TAC 反向：TTG ACT TCA CTG CTA TGG TAT TAG 11 PeRM10017 146176 50 正向：AAG ACA CTG ATA GTT CTC TGA GG 反向：CAA ATT ATG ATA AGA AAC TTG GAA 12 PeRM10018 160170 50 正向：ACA GAA AAG AAA GAT AAA GCA AAT 反向：TTC AGT ATC CAA CTG AAC ACA C 13 PeRM10019 142150 50 正向：TGG TAG TCA ATC AGA AAA CTA AGA 反向：GAG TTG TTA GGT CTC CTC AAC TTA 14 PeRM10020 132142 50 正向：AAC AGG GTA TAC TGT AAA TCA TTG 反向：GTT TAT TCC TTT CTC TTC TAG TGC 15 Pa_F-P10A10 220 50 正向：TGG AAT GTG ATT TGC ATG G 反向：TAG GTA TTG CTG GCG AAG 16 Pa_F+R-Contig114 290 50 正向：CTT GCC TCT CTC CCT CTC 反向：GGG TTT TGG GTT TGA CAG DB45/T 27552023 8 表A.1 引物编号及引物扩增信息（续）序 号 引物名称 条带大小 bp 引物退火温度 引物序列（5-3）17 Pa_F-Contig13 293 50 正向：CAG AAG GAA AAC CAG CAA G 反向：CCC CAT CAT CAT CAC TTT C 18 Pa_F-P7E10 240255 50 正向：TTA ATG CCA CAG CCC AAC 反向：TGA CCC AAA ATC AAA CAC C 19 Pa_F+R-Contig80 360380 55 正向：TGT TCA AGC CCA TCT TCG 反向：GCT CTC GCT CTT GTC GTA G 20 Pa_F-P6H04 280295 55 正向：GAA TAG GGT CAG CAG GAG G 反向：GAG TGT GTC ATC GGA GTC C 21 PE 2 223 53 正向：GAT CGG TCC TCG GTT AGA C 反向：AGT CAC ACA GCA TGA GAA ATC 22 PE 6 258 53 正向：GCA ATT TCA CCA TCT TCT GCT 反向：CCA CGG TCA TGG ATG TTC 23 PE 10 145150 55 正向：TTG CTC ATT GCA CTC ATC CT 反向：GCA GAC ATT TCC TGG AGC A 24 PE 12 260290 55 正向：CCA TAG TCC CAA CAA GCA TC 反向：GCT GTG GAC CCT AAC TCA GTC 25 PE 13 260 50 正向：TCA GGA AGA TTG CAT GTT AGT 反向：CTG GGT TTTG TTT ATG TTG C 26 PE 15 230270 53 正向：CCG TGA ACC AAC CAT TTC TC 反向：TTG CAG CAC AAA CAA GTC AA 27 PE 16 180270 53 正向：AGG ATC ACC ATA GAA AAC CAT 反向：GTT AGG TTG GCA TTG CTC TT 28 PE 18 210230 50 正向：GTC ACT TCA TTC TTC CTT TCC 反向：TTA GCC CAC TCA AAC ACA A 29 PE 27 250 53 正向：CAC ATT TGC CGT CAC TGG 反向：CGG CAT ACG ATA AAT CTC CTG 30 PA 8 270 53 正向：TCT AAT GAG CGG AGG AAA GC 反向：CCG GAT ACC CAC GCA TTA 31 PA 9 265320 53 正向：GGG CCT TTA TCC ATG TTT GA 反向：GGA AAT CCG AAA ACT GGT TG