聚合酶链式反应PCR.pptx

聚合酶链式反应PCR DNADNA扩增得传统方法扩增得传统方法扩增得传统方法扩增得传统方法:一般采用分子克隆法一般采用分子克隆法一般采用分子克隆法一般采用分子克隆法,需将构建得含有目得基需将构建得含有目得基需将构建得含有目得基需将构建得含有目得基因得载体导入细胞进行扩增因得载体导入细胞进行扩增因得载体导入细胞进行扩增因得载体导入细胞进行扩增,并需要用探针进行筛并需要用探针进行筛并需要用探针进行筛并需要用探针进行筛选选选选,牵扯到牵扯到牵扯到牵扯到DNADNA酶切、连接、转化、培养及探针杂酶切、连接、转化、培养及探针杂酶切、连接、转化、培养及探针杂酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术交等技术交等技术交等技术,虽然技术上已无难点虽然技术上已无难点虽然技术上已无难点虽然技术上已无难点,但操作复杂但操作复杂但操作复杂但操作复杂,需数需数需数需数周到数月得时间周到数月得时间周到数月得时间周到数月得时间,且不利于普及。且不利于普及。且不利于普及。且不利于普及。PCRPCR技术技术技术技术:1985:1985:1985:1985年由美国年由美国年由美国年由美国 Cetus Cetus 公司得公司得公司得公司得Kary Kary MullisMullis 首创首创首创首创,可以将微量目得可以将微量目得可以将微量目得可以将微量目得DNADNA片段扩增一百万片段扩增一百万片段扩增一百万片段扩增一百万倍以上。倍以上。倍以上。倍以上。优点优点优点优点:敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等好以及快速简便等好以及快速简便等好以及快速简便等,广泛应用于微生物学、考古学、广泛应用于微生物学、考古学、广泛应用于微生物学、考古学、广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域法医学及体育等领域法医学及体育等领域法医学及体育等领域,并已普及到许多普通实验室并已普及到许多普通实验室并已普及到许多普通实验室并已普及到许多普通实验室,大大简化了传统得分子克隆技术大大简化了传统得分子克隆技术大大简化了传统得分子克隆技术大大简化了传统得分子克隆技术,从而比较容易地从而比较容易地从而比较容易地从而比较容易地对目得基因进行分析、鉴定。对目得基因进行分析、鉴定。对目得基因进行分析、鉴定。对目得基因进行分析、鉴定。Kary MullisKary Mullis 本人因此获本人因此获本人因此获本人因此获1993199319931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。二、二、PCR得原理得原理:用于扩增位于两段已知序列之间得用于扩增位于两段已知序列之间得用于扩增位于两段已知序列之间得用于扩增位于两段已知序列之间得DNADNA片段片段片段片段,类似于天然类似于天然类似于天然类似于天然DNADNA得复制过程。得复制过程。得复制过程。得复制过程。以拟扩增得以拟扩增得以拟扩增得以拟扩增得DNADNA分子为模板分子为模板分子为模板分子为模板,以一对分别与模以一对分别与模以一对分别与模以一对分别与模板板板板5 5 5 5末端和末端和末端和末端和3 3 3 3末端互补得寡核苷酸片段为引物末端互补得寡核苷酸片段为引物末端互补得寡核苷酸片段为引物末端互补得寡核苷酸片段为引物,在在在在DNADNA聚合酶得作用下聚合酶得作用下聚合酶得作用下聚合酶得作用下,按照半保留复制得机制沿按照半保留复制得机制沿按照半保留复制得机制沿按照半保留复制得机制沿着模板链延伸直至完成新得着模板链延伸直至完成新得着模板链延伸直至完成新得着模板链延伸直至完成新得DNADNA合成合成合成合成,重复这一过重复这一过重复这一过重复这一过程程程程,即可使目得即可使目得即可使目得即可使目得DNADNA片段得到扩增。片段得到扩增。片段得到扩增。片段得到扩增。扩增得特异性取决于引物与模板扩增得特异性取决于引物与模板DNA得特异得特异结合结合,基本反应步骤分三步基本反应步骤分三步:1、变性变性(Denaturation):加热使模板加热使模板DNA双链间得氢键断裂而形成两双链间得氢键断裂而形成两条单链。条单链。94 302、退火退火(复性复性)(Annealling):突然降温后模板突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则与引物按碱基配对原则互补结合互补结合,也存在两条模板链之间得结合也存在两条模板链之间得结合,但由于但由于引物得高浓度引物得高浓度,结构简单得特点结构简单得特点,主要得结合发生主要得结合发生在模板与引物之间。在模板与引物之间。55 30 3 3、延伸延伸延伸延伸(Extension):(Extension):将反应温度调节到将反应温度调节到将反应温度调节到将反应温度调节到酶得最适温度酶得最适温度,在在在在DNADNA聚合聚合聚合聚合酶、酶、酶、酶、4 4种种种种 dNTPs dNTPs 及镁离子等存在得条件下及镁离子等存在得条件下及镁离子等存在得条件下及镁离子等存在得条件下,以引物得以引物得以引物得以引物得 3 3 端开始端开始端开始端开始,结合单核苷酸结合单核苷酸结合单核苷酸结合单核苷酸,形成与模板链互补得新形成与模板链互补得新形成与模板链互补得新形成与模板链互补得新DNADNA链。链。链。链。72 1 上述上述上述上述 3 3 步为一个循环步为一个循环步为一个循环步为一个循环,每经过一个循环每经过一个循环每经过一个循环每经过一个循环,样本中样本中样本中样本中得得得得DNADNA量应该增加一倍量应该增加一倍量应该增加一倍量应该增加一倍,新形成得链又可成为新一轮新形成得链又可成为新一轮新形成得链又可成为新一轮新形成得链又可成为新一轮循环得模板循环得模板循环得模板循环得模板,经过经过经过经过25254040个循环后个循环后个循环后个循环后DNADNA可扩增可扩增可扩增可扩增10106 6 10109 9 倍。倍。倍。倍。PCR 的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点 PCR PCR扩增得特异性就是由一对寡核苷酸引物扩增得特异性就是由一对寡核苷酸引物扩增得特异性就是由一对寡核苷酸引物扩增得特异性就是由一对寡核苷酸引物所决定得。反应初期所决定得。反应初期所决定得。反应初期所决定得。反应初期,原来得原来得原来得原来得DNADNA担负起使模板得担负起使模板得担负起使模板得担负起使模板得作用作用作用作用,随着循环次数得递增随着循环次数得递增随着循环次数得递增随着循环次数得递增,由引物介导延伸得片由引物介导延伸得片由引物介导延伸得片由引物介导延伸得片段急剧增多而成为主要模板段急剧增多而成为主要模板段急剧增多而成为主要模板段急剧增多而成为主要模板,最终得扩增产物就是最终得扩增产物就是最终得扩增产物就是最终得扩增产物就是介于两种引物介于两种引物介于两种引物介于两种引物5 5 端之间得端之间得端之间得端之间得DNADNA片段。片段。片段。片段。三、三、PCR得成分和作用得成分和作用:终浓度终浓度 1 1、缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液:10 50 50 mM Tris-Cl(pH8、4)维持维持维持维持 Taq Taq 酶作用环境得偏碱性酶作用环境得偏碱性酶作用环境得偏碱性酶作用环境得偏碱性 25 25 50 mM KCl 促进引物退火促进引物退火促进引物退火促进引物退火,50 mM,50 mM 会抑制会抑制会抑制会抑制 Taq Taq 酶得活性。酶得活性。酶得活性。酶得活性。100g/ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)(BSA)对酶有一定得保护性对酶有一定得保护性对酶有一定得保护性对酶有一定得保护性,如质量不好将起相反得作如质量不好将起相反得作如质量不好将起相反得作如质量不好将起相反得作 用用用用,建议使用乙酰化得建议使用乙酰化得建议使用乙酰化得建议使用乙酰化得 BSA BSA。明胶、。明胶、。明胶、。明胶、Tween-20Tween-20、二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇(DTT)(DTT)也有类似作用。也有类似作用。也有类似作用。也有类似作用。2、MgCl2:1、5 2、0 mM Taq 酶具有酶具有 Mg2+依赖性依赖性,显著影响反应显著影响反应得特异性和扩增片段得产量得特异性和扩增片段得产量,过量能增加非特过量能增加非特异扩增并影响产率异扩增并影响产率,过低则酶活性显著下降。过低则酶活性显著下降。3、dNTPs:dATP dATP、dGTP dGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP底物底物底物底物 0 0、02 02 0、2 mM dNTPs dNTPs 可与可与可与可与 Mg Mg2+2+结合结合结合结合,应注意应注意应注意应注意MgMg2+2+浓度与浓度与浓度与浓度与dNTPs dNTPs 浓度之间得关系浓度之间得关系浓度之间得关系浓度之间得关系,Mg,Mg2+2+浓度比浓度比浓度比浓度比 dNTPs dNTPs 浓浓浓浓度高度高度高度高 0 0、2 2 2 2、5 mM5 mM。过高过高过高过高:加快反应速度加快反应速度加快反应速度加快反应速度,还可增加碱基得错误掺入还可增加碱基得错误掺入还可增加碱基得错误掺入还可增加碱基得错误掺入 率和室验成本。率和室验成本。率和室验成本。率和室验成本。过低过低过低过低:反应速度下降反应速度下降反应速度下降反应速度下降,可提高实验得精确性。可提高实验得精确性。可提高实验得精确性。可提高实验得精确性。4、引物引物(Primer-P):预扩增核酸片段两端得已知序列预扩增核酸片段两端得已知序列,决定特异性。决定特异性。0、2 1 M 偏高偏高:非特异产物扩增及错配非特异产物扩增及错配,增加引物之间增加引物之间 形成引物二聚体形成引物二聚体,产量降低。产量降低。偏低偏低:产量降低。产量降低。5、Taq DNA 聚合酶聚合酶:耐高热耐高热 0、5 5 U/100 l 1U/25 50l 偏高偏高:引物非特异产物得扩增引物非特异产物得扩增 偏低偏低:产物量降低产物量降低6、模板模板DNA(Template):最低最低102 105 bp DNA片段片段,实际用量远远实际用量远远 超过此量超过此量,用量需在实验中摸索。用量需在实验中摸索。1 5 l 过高过高:非特异产物增加非特异产物增加 过低过低:产量降低产量降低7、水水:去离子水去离子水,补足整个反应体积。补足整个反应体积。四、四、PCR反应体系反应体系:常用常用30l 各种成分得实际用量应根据实验者选各种成分得实际用量应根据实验者选用得该成分得终浓度及所拥有得储备液浓用得该成分得终浓度及所拥有得储备液浓度进行核算。度进行核算。10buffer:130/10=3l MgCl2:1、530/25=1、8l dNTPs:0、230/10=0、6l 引物引物 P:0、4302/10=2、4l Taq 酶酶(5U/l):1/5=0、2l 模板模板:1l 水水:30-3-1、8-0、6-2、4-0、2-1=21l 操作操作:5 5份标本份标本份标本份标本 总体积总体积总体积总体积 30l 6=180l 30l 6=180l 1 1、取一取一取一取一 0 0、5 ml Ep 5 ml Ep 管管管管,依次加入下列试剂依次加入下列试剂依次加入下列试剂依次加入下列试剂:10buffer:3l 6=18l 10buffer:3l 6=18l MgCl MgCl2 2:1:1、8l6=108l6=10、8l8l dNTPs:0 dNTPs:0、6l6=36l6=3、6l6l 引物引物引物引物 P:2 P:2、4l 6=144l 6=14、4l4l Taq Taq 酶酶酶酶(5U/l):0(5U/l):0、2l 6=12l 6=1、2l2l 水水水水:21l 6=126l:21l 6=126l 共共共共174l,174l,先用移液器先用移液器先用移液器先用移液器/指弹混匀指弹混匀指弹混匀指弹混匀,后用离心机瞬时后用离心机瞬时后用离心机瞬时后用离心机瞬时 混匀混匀混匀混匀(管壁上液体沉至管底管壁上液体沉至管底管壁上液体沉至管底管壁上液体沉至管底)。2 2、另取另取另取另取 5 5 支支支支0 0、2ml Ep2ml Ep管管管管,分别加入上述液体分别加入上述液体分别加入上述液体分别加入上述液体2929l。3 3、分别取标本模板各分别取标本模板各分别取标本模板各分别取标本模板各1 1l,加入上述加入上述加入上述加入上述5 5支支支支 Ep Ep 管中管中管中管中,混匀混匀混匀混匀,分别加入分别加入分别加入分别加入2 2滴液体石蜡滴液体石蜡滴液体石蜡滴液体石蜡(防止加温过程中液体蒸发影防止加温过程中液体蒸发影防止加温过程中液体蒸发影防止加温过程中液体蒸发影响反应体积响反应体积响反应体积响反应体积),),离心机瞬时离心离心机瞬时离心离心机瞬时离心离心机瞬时离心,备用。备用。备用。备用。4 4、反应条件反应条件反应条件反应条件:PCR:PCR扩增仪扩增仪扩增仪扩增仪 9430 9430,55 30,55 30,72 1,72 1,35 35个循环个循环个循环个循环,72,72 延伸延伸延伸延伸 5 5。五、五、PCR反应条件优化反应条件优化:1 1、温度、循环参数、温度、循环参数、温度、循环参数、温度、循环参数:变性温度和时间变性温度和时间变性温度和时间变性温度和时间:保证模板保证模板保证模板保证模板DNADNA解链完全就是保证整个解链完全就是保证整个解链完全就是保证整个解链完全就是保证整个PCRPCR扩增扩增扩增扩增成功得关键。成功得关键。成功得关键。成功得关键。加热加热加热加热90909595,30,30 60 s,60 s,再复杂得再复杂得再复杂得再复杂得DNADNA分子也分子也分子也分子也可变性为单链。根据模板可变性为单链。根据模板可变性为单链。根据模板可变性为单链。根据模板DNADNA复杂程度复杂程度复杂程度复杂程度,可以调整变可以调整变可以调整变可以调整变性温度和时间。一般情况下选择性温度和时间。一般情况下选择性温度和时间。一般情况下选择性温度和时间。一般情况下选择94 94 30 30,可使各可使各可使各可使各种复杂得种复杂得种复杂得种复杂得DNADNA分子完全变性。分子完全变性。分子完全变性。分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长温度过高或高温持续时间过长温度过高或高温持续时间过长温度过高或高温持续时间过长,可对可对可对可对TaqTaq酶活性酶活性酶活性酶活性和和和和dNTPdNTP分子造成损害。分子造成损害。分子造成损害。分子造成损害。复性温度和时间复性温度和时间复性温度和时间复性温度和时间:PCR PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板扩增特异性取决于复性过程中引物与模板扩增特异性取决于复性过程中引物与模板扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 得结合。得结合。得结合。得结合。复性温度得选择复性温度得选择复性温度得选择复性温度得选择,可根据引物得长度和可根据引物得长度和可根据引物得长度和可根据引物得长度和G+CG+C含量含量含量含量确定确定确定确定,长度在长度在长度在长度在15 15 25 bp 25 bp 之间时之间时之间时之间时,复性温度复性温度复性温度复性温度 Tm=4 Tm=4(G+C)+2(A+T)(G+C)+2(A+T)计算得到计算得到计算得到计算得到,一般位于一般位于一般位于一般位于40 40 60,30 60,30 60 s60 s。复性温度越高复性温度越高复性温度越高复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低产物特异性越高。复性温度越低产物特异性越高。复性温度越低产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。产物特异性越低。产物特异性越低。产物特异性越低。一般情况下选择一般情况下选择一般情况下选择一般情况下选择55 3055 30,足以使引物与模板之足以使引物与模板之足以使引物与模板之足以使引物与模板之间完全结合。间完全结合。间完全结合。间完全结合。延伸温度和时间延伸温度和时间延伸温度和时间延伸温度和时间:一般位于一般位于一般位于一般位于TaqTaq酶最适作用温度酶最适作用温度酶最适作用温度酶最适作用温度70 70 75 75 之间。之间。之间。之间。引物小于引物小于引物小于引物小于1616个核苷酸时个核苷酸时个核苷酸时个核苷酸时,过高得延伸温度不利于引过高得延伸温度不利于引过高得延伸温度不利于引过高得延伸温度不利于引 物与模板得结合物与模板得结合物与模板得结合物与模板得结合,可以缓慢升温到可以缓慢升温到可以缓慢升温到可以缓慢升温到70 70 75 75。延伸反应时间延伸反应时间延伸反应时间延伸反应时间,可根据待扩增片段得长度而定可根据待扩增片段得长度而定可根据待扩增片段得长度而定可根据待扩增片段得长度而定,1Kb,1,1Kb;1Kb需加长延伸时间需加长延伸时间需加长延伸时间需加长延伸时间,10Kb,10Kb片段片段片段片段延伸时间可达延伸时间可达延伸时间可达延伸时间可达1515分钟。分钟。分钟。分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增延伸时间过长可出现非特异扩增延伸时间过长可出现非特异扩增延伸时间过长可出现非特异扩增,常用常用常用常用72 172 1。循环数循环数循环数循环数:其她参数选定后其她参数选定后其她参数选定后其她参数选定后,PCR,PCR循环次数主要取决于模循环次数主要取决于模循环次数主要取决于模循环次数主要取决于模板板板板DNADNA得浓度。得浓度。得浓度。得浓度。理论上说理论上说理论上说理论上说20 20 25 25次循环后次循环后次循环后次循环后,PCR,PCR产物得积累即产物得积累即产物得积累即产物得积累即可达到最大值可达到最大值可达到最大值可达到最大值,实际操作中由于每步反应得产率不实际操作中由于每步反应得产率不实际操作中由于每步反应得产率不实际操作中由于每步反应得产率不可能达到可能达到可能达到可能达到100%,100%,因此不管模板浓度就是多少因此不管模板浓度就是多少因此不管模板浓度就是多少因此不管模板浓度就是多少,20,20 3030次就是比较合理得循环次数。次就是比较合理得循环次数。次就是比较合理得循环次数。次就是比较合理得循环次数。循环次数越多循环次数越多循环次数越多循环次数越多,非特异扩增增加。非特异扩增增加。非特异扩增增加。非特异扩增增加。2、MgCl2浓度浓度:可显著影响可显著影响PCR得产量及产物特异性得产量及产物特异性 1、5 2、0 mM 过高过高:增加非特异扩增并影响产率增加非特异扩增并影响产率 过低过低:酶活性显著下降。酶活性显著下降。3、引物、引物:0、2 1 M 偏高偏高:非特异产物扩增及错配非特异产物扩增及错配,增加引物增加引物 之间形成引物二聚体之间形成引物二聚体,产量降低。产量降低。偏低偏低:产量降低。产量降低。引物设计原则引物设计原则:总原则就是提高扩增得效率和特异性总原则就是提高扩增得效率和特异性 引物设计原则引物设计原则 长度长度长度长度151530 b,30 b,过短特异性降低过短特异性降低过短特异性降低过短特异性降低,过长则成本增加过长则成本增加过长则成本增加过长则成本增加,产产产产量也下降。量也下降。量也下降。量也下降。引物碱基尽可能随机分布引物碱基尽可能随机分布引物碱基尽可能随机分布引物碱基尽可能随机分布,避免出现嘌呤、嘧啶堆避免出现嘌呤、嘧啶堆避免出现嘌呤、嘧啶堆避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象积现象积现象积现象,引物引物引物引物 G+C G+C 含量宜在含量宜在含量宜在含量宜在45 45 55%55%左右。左右。左右。左右。引物内部不能含有自身互补序列引物内部不能含有自身互补序列引物内部不能含有自身互补序列引物内部不能含有自身互补序列,否则会形成发夹否则会形成发夹否则会形成发夹否则会形成发夹样二级结构样二级结构样二级结构样二级结构,两个引物之间尤其在两个引物之间尤其在两个引物之间尤其在两个引物之间尤其在 3 3 末端不应有互末端不应有互末端不应有互末端不应有互补链存在补链存在补链存在补链存在,不然会形成引物二聚体。不然会形成引物二聚体。不然会形成引物二聚体。不然会形成引物二聚体。引物设计原则引物设计原则 引物得碱基顺序不应与非扩增区域有同源性引物得碱基顺序不应与非扩增区域有同源性引物得碱基顺序不应与非扩增区域有同源性引物得碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)(70%)或少于连续或少于连续或少于连续或少于连续8 8个得互补碱基。要求在引物设计时采用个得互补碱基。要求在引物设计时采用个得互补碱基。要求在引物设计时采用个得互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。计算机进行辅助检索分析。计算机进行辅助检索分析。计算机进行辅助检索分析。引物得引物得引物得引物得 5 5 末端碱基末端碱基末端碱基末端碱基:并没有严格得限制并没有严格得限制并没有严格得限制并没有严格得限制,只要与模板只要与模板只要与模板只要与模板DNADNA结合得引物长度足够结合得引物长度足够结合得引物长度足够结合得引物长度足够,其其其其 5 5 末端碱基可以不与末端碱基可以不与末端碱基可以不与末端碱基可以不与模板模板模板模板DNADNA匹配呈游离状态。最多可游离匹配呈游离状态。最多可游离匹配呈游离状态。最多可游离匹配呈游离状态。最多可游离1010个碱基并个碱基并个碱基并个碱基并不影响不影响不影响不影响PCRPCR反应进行。反应进行。反应进行。反应进行。