DB32∕T 3544-2019 临床级人体组织来源间充质干细胞 质量控制管理规范(江苏省).pdf

1ICS 07.080C 04DB32江苏省地方标准DB32/T 3544-2019临床级人体组织来源间充质干细胞质量控制管理规范Quality control and technical specifications of clinical grade mesenchymal stem cellsfrom human tissues2019-2-28 发布2019-3-30 实施江苏省市场监督管理局发 布DB32/T 3544-20191目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14基本要求.35操作规范.46质量控制.9附录 A（资料性附录）样本捐献供者知情同意书. 12附录 B（资料性附录）干细胞供者健康信息采集表. 13附录 C（资料性附录）临床级人间充质干细胞质量控制检测表.14DB32/T 3544-20192前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由江苏省卫生和计划生育委员会提出。本标准由江苏省卫生标准化技术委员会归口。本标准起草单位：苏州大学附属第一医院、中国科学院上海营养与健康研究院、常州市第一人民医院、南京市鼓楼医院、无锡市第三人民医院。本标准主要起草人：时玉舫、侯健全、王莹、陈晓栋、陈永井、蒋敬庭、孙凌云、吕国忠。DB32/T 3544-20193临床级人体组织来源间充质干细胞质量控制管理规范1范围本标准规定了临床级人体组织来源间充质干细胞制备的基本要求、操作规范和质量控制。本标准适用于临床级人体组织来源间充质干细胞的样本采集、制备、冻存、复苏与质量控制。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 3095 环境空气质量标准GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求GB 50073-2001 洁净厂房设计规范GB 50346 实验室建筑技术规范GB 50591 洁净室施工及验收规范WHO 实验室生物安全手册（第三版）药品生产质量管理规范（卫生部令第 79 号）中华人民共和国药典（2015 年版）干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)（国卫办科教发201546 号）T11/CSSCR 001-2017 干细胞通用要求（中国细胞生物学学会-干细胞生物学分会团体标准）3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1临床级人间充质干细胞clinical grade human mesenchymal stem cells符合质量要求，可用于临床研究和应用的人多种组织来源（脐带血、脐带、胎盘、子宫内膜、脂肪、牙齿、骨髓等组织）间充质干细胞。3.2伦理审查委员会ethical review committee负责对科学研究中涉及的伦理道德问题进行评估和审查的专门组织。3.3科学审查委员会scientific review committeeDB32/T 3544-20194负责对生物样本采集和使用的方案进行科学性审查的专门组织。3.4生物安全委员会institutional biosafety committee负责制定生物安全政策和安全操作规范的专门组织。3.5知情同意informed consent具有完全民事行为能力的自然人在重复获取信息并准确理解其内容后， 作出接受或不接受样本采集的决定，此决定不受恐吓、利诱或其他不当行为的影响。3.6样本specimen在特定时间从受试者或捐献者中采集的器官、组织、细胞等标本。3.7样本采集harvest从供体获得组织、细胞等生物样本的过程。3.8人间充质干细胞分离 isolation of human mesenchymal stem cells从供者器官或组织中分离出间充质干细胞的过程。3.9人间充质干细胞制备preparation of human mesenchymal stem cells人间充质干细胞从新鲜组织样品分离，经过一系列规范处理达到入库标准的过程。3.10人间充质干细胞扩增amplificaiton of human mesenchymal stem cells人间充质干细胞经培养后，数量得到增加的过程。3.11人间充质干细胞分化differentiation of human mesenchymal stem cells同一来源的人间充质干细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类型的过程。3.12人间充质干细胞冻存cryopreservation of human mesenchymal stem cells使人间充质干细胞暂时脱离生长状态而保存其干细胞特性的低温冷冻过程。DB32/T 3544-201953.13人间充质干细胞复苏thawing human mesenchymal stem cells使人间充质干细胞从脱离生长状态重新获得生长活力的过程。3.14人间充质干细胞传代培养subculture of human mesenchymal stem cells当原代培养成功后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，为避免发生接触性抑制，将培养中的人间充质干细胞分割成小的部分，重新接种到新的培养皿（瓶）的培养基中进行培养的过程。3.15干细胞制剂stem cell-based medicinal products用于治疗疾病或改善健康状况的、以某种类型干细胞为主要成分、符合相应质量及安全标准，且具有明确生物学效应的干细胞制品。3.16干细胞质量控制stem cell quality control为达到临床级人间充质干细胞入库质量要求所采取的操作技术和管理程序。4基本要求4.1场地与设施4.1.1临床级人间充质干细胞制备机构选址应符合 GMP 要求，空气质量标准应符合 GB 3095 标准分级二级标准。4.1.2临床级人间充质干细胞制备机构实验室或厂房应由具有洁净实验室设计建设资质的工程公司设计与建造，并应符合 GB 19489、GB 50073、GB 50346、GB 50591 规定。建设完成后，各功能区域的洁净级别应由专业机构进行检测并出具合格证明。4.1.3干细胞制备功能区应按临床级人间充质干细胞制备工艺进行各区域设计,符合 GMP 和 干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求。干细胞制备机构应配备独立质量检测实验室，并符合 GB19489GB 和 GB 50346 规定。4.2设备和耗材4.2.1临床级人间充质干细胞的制备机构应优先选用符合 GMP、干细胞通用要求和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求，获得国家资质认证的设备、仪器、耗材和试剂。4.2.2临床级人间充质干细胞的制备机构应对设备、仪器、耗材和试剂供应商进行资质审核认证，要求供应商提供产品质量报告和批次检验报告， 并对耗材及试剂进行质量抽检， 避免采购质量不合格的产品。4.2.3临床级人间充质干细胞的制备机构设备和仪器正式使用前应做安装确认（IQ）、运行确认（OQ）和性能确认（PQ），并定期进行第三方校准，不得使用有安全隐患的仪器操作样本及细胞制品。DB32/T 3544-201964.2.4临床级人间充质干细胞的制备机构应对设备与仪器应进行编号建档， 并建立标准操作流程 （SOP） ，确保使用、运行、保养、维修记录完整可追溯，对于关键工艺相关设备参数应进行实时监测，及时对状态异常的设备进行校对和维修。4.3人员管理4.3.1临床级人间充质干细胞制备机构应分别设立干细胞制备负责人、质量管理负责人和质量授权人岗位。由法人授权任命，任职资质应符合 GMP 和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求，定期接受岗位专业培训，制备技术负责人与质量管理负责人、质量授权人不得相互兼任。4.3.2临床级人间充质干细胞制备和质控技术人员应具备的健康要求：HBsAg 和针对 HAV、HCV、HIV及梅毒的抗体检测应为阴性，并且（矫正）视力正常，无色盲、色弱。4.3.3临床级人间充质干细胞制备和质控技术人员须半年接受体检一次，有呼吸道感染或发热等疾病状态下不得进入洁净操作区，需完全康复后方可恢复岗位操作。4.3.4临床级人间充质干细胞制备和质控技术人员上岗前应经过专业培训，内容包括但不限于干细胞理论与实践、生命伦理、干细胞法律法规、GMP 管理、GCP 资质、制剂基本知识、细胞培养基础、生物安全、仪器设备使用与维护方法、物料管理与清洁卫生、岗位职责、操作规范等内容。4.4生命伦理4.4.1临床级人间充质干细胞制备机构应成立伦理审查委员会，伦理审查委员会由医药学、伦理学、法学等专家以及无利害关系的社区代表等人员组成， 负责相关伦理问题的审查和评价。 同时应按照国家法律法规和行业要求，建立干细胞伦理准则和相应的伦理操作规范，以保护样本提供者的权益和安全。4.4.2临床级人间充质干细胞制备机构应设有科学审查委员会。科学审查委员会应由生物和医学领域的专家组成，负责对生物样本采集和使用的方案进行科学性审查。4.4.3临床级人间充质干细胞制备机构应设有生物安全评审委员会。生物安全评审委员会应由生物学家、医务人员、技术人员和实验室管理人员等各方面的专家或工作人员组成，制定符合WHO 生物安全手册和 GB 19489 规定的生物危害评估方案、生物安全事故应急预案等安全管理措施。负责人间充质干细胞制备的生物安全政策和安全操作规范的审查，避免不必要的操作，保护供者及样本安全。4.4.4临床级人间充质干细胞制备机构的工作人员应当对风险及收益进行有效评估，确保样本提供者或其近亲属对项目信息在当时科学技术条件下充分知情、 形成全面和准确的认识， 自愿做出是否同意采集样本的决定，并签署知情同意书。样本捐献供者知情同意书参见附录 A。4.4.5采集人员、医务人员、制备质控操作人员和管理人员应当对样本提供者的个人信息采取保密措施， 防止有意或意外泄露， 若确需提供信息， 需要经有关申请程序并提交伦理委员会批准同意方可实施。违反法律规定的，应依法追究民事责任、行政责任和刑事责任。5操作规范5.1样本采集5.1.1供者健康5.1.1.1临床级人间充质干细胞采集制备方应对干细胞供者的基本信息与健康信息进行详细采集与记录，同时做好对供者的隐私保护，相关记录入档保留至少 30 年。DB32/T 3544-201975.1.1.2干细胞供者应无血液系统疾病、内分泌系统疾病、恶性肿瘤史、性传播疾病及高危人群史、吸毒史、一般传染性疾病或其他遗传疾病；HIV、HBV、HCV、TP、HTLV、EBV 与 CMV 抗体与核酸检测应为阴性。供者健康调查和采集登记表参见附录 B。5.1.2采集场所5.1.2.1人体组织样本的采集场所或环境一般为洁净手术室，无菌采集。5.1.2.2人牙齿样本的采集场所无洁净级别要求，但需保证个人基本卫生。5.1.2.3新生儿脐带血、脐带、胎盘、人骨髓样本的采集场所应达到级标准洁净手术室要求。5.1.2.4人脂肪组织和子宫内膜组织样本的采集场所须达到级一般洁净手术室要求。5.1.3采集方法5.1.3.1新生儿脐带血5.1.3.1.1新生儿脐带血采集应由经严格专业培训的护士或助产士职称以上医务人员进行操作。5.1.3.1.2待新生儿娩出后，断脐结扎。用蘸有 75%医用酒精的消毒纱布快速擦拭胎盘远端脐带。5.1.3.1.3采血针穿刺消毒部位脐静脉，引流脐带血至脐带血采集袋，待采集的脐血管塌陷、发白后或脐带血停止流动时即可结束采集。5.1.3.1.4旋紧采血袋软管旋塞，或做热合密封处理，并贴上条形码作为唯一标识。5.1.3.2新生儿脐带组织5.1.3.2.1新生儿脐带组织采集应由经严格专业培训的护士或助产士职称以上医务人员进行操作。5.1.3.2.2胎儿娩出后，在距胎儿脐部 5cm 至 8cm 处，用止血钳分别夹住脐带上下两端，用蘸有 75%医用酒精的消毒纱布擦拭脐带，消毒剪刀于两钳中间断脐。5.1.3.2.3胎盘端方向取至少 15cm 无针孔的脐带， 手术线结扎脐带样本两端， 截取脐带样本置于无菌采集瓶中，同时加入样本保存液以浸没脐带组织。5.1.3.2.4采集瓶密闭包装，并贴条形码作为唯一标识。5.1.3.3新生儿胎盘组织5.1.3.3.1新生儿胎盘组织采集应由经严格专业培训的护士或助产士职称以上医务人员进行操作。5.1.3.3.2胎儿娩出后，待胎盘与母体完全分离，用生理盐水充分清洗胎盘，再用 75%医用酒精快速冲洗表面。5.1.3.3.3迅速将胎盘放入胎盘采集盒或采集袋，再加入保存液予以全部浸没。5.1.3.3.4采集盒或采集袋密闭包装，并贴上条形码作为唯一标识。5.1.3.4脂肪组织5.1.3.4.1脂肪组织采集前应由整形医师制定抽脂方案和术前术后的防感染措施。5.1.3.4.2由整形医师行脂肪抽吸术，抽取脂肪组织，置于无菌采集袋或瓶中保存。5.1.3.4.3采集袋或瓶密封包装，并贴上条形码作为唯一标识。5.1.3.5骨髓组织5.1.3.5.1骨髓采集前应由血液科等有经验的医师或住院医师规范化培训合格者进行制定骨髓穿刺方案和术前术后的防感染措施。DB32/T 3544-201985.1.3.5.2由血液科等有经验的医师或经住院医师规范化培训合格的医师行骨髓穿刺术，采取避免骨髓稀释的措施，采集骨髓至含抗凝剂的针管内，即时转移至无菌采集瓶中保存。5.1.3.5.3采集瓶密封包装，并贴上条形码作为唯一标识。5.1.3.6子宫内膜组织5.1.3.6.1子宫内膜组织采集前应由妇产科医师制定子宫内膜诊刮方案和术前术后的防感染措施。5.1.3.6.2手术诊刮获取成年正常女性子宫内膜组织，置于无菌采集瓶中，加入样本保存液予以全部浸没保存。5.1.3.6.3采集瓶密封包装，并贴上条形码作为唯一标识。5.1.3.7牙齿组织5.1.3.7.1收集没有牙体和牙髓病变、自然脱落的乳牙，置于无菌采集瓶中，加入样本保存液予以全部浸没保存。5.1.3.7.2采集瓶密封包装，并贴上条形码作为唯一标识。5.2样本运输5.2.1样本运输人员应是经过专业培训合格的人员，对样本运输应制定规范及应急预案，并对样本运输全程做记录，包括但不限于运输的方式、条件、路径、时间、人员、地址及样本信息，相关记录入档保留至少 30 年。5.2.2样本运输过程中须防渗漏、防辐射、抗震动、耐压、耐热等，样本包装需贴上条形码作为唯一标识。5.2.3样本运输须采用平稳、安全、快速的运输途径。5.2.4新生儿脐带（血）或胎盘、人脂肪、骨髓、子宫内膜和牙齿样本的运输温度为 28，运输时间不超过 12 小时。5.3样本接收5.3.1样本接收人员应是经过专业培训合格的人员，应遵从安全与准确的原则对样本接收制定规范及应急预案，并对样本接收过程进行记录，相关记录入档保留至少 30 年。5.3.2样本接收时，接收人员应做好自我防护工作，接触样本之前应佩戴手套与口罩，并对接收场所进行消毒。5.3.3接收样本后应先观察样本容器外包装的外观，检查有无破损。5.3.4检查外观后，工作人员应检查样本采集信息记录表是否齐全，同时确认记录表上信息是否填写完整，检查信息记录表信息是否与样本信息一一对应，样本及记录表上应贴有一致对应的条形码，做到样本与供者信息相对应，确认无误后进行接收。5.3.5样本接收后，使用 75%医用酒精消毒清理容器外表面，如不能及时对样本进行处理，需把样本保存在 28条件下，最长时间不超过 12 小时。5.3.6样本量应能够满足制备和检测的最低要求。5.3.7样本接收后应及时将信息反馈给样本发送方。5.3.8间充质干细胞制备方应制定样本拒收标准，按照样本拒收标准处理样本，并及时通知有关部门或负责人，同时做好相应记录。5.4人间充质干细胞分离与培养DB32/T 3544-201995.4.1基本要求5.4.1.1临床级人间充质干细胞分离与培养应在符合 GMP、干细胞通用要求和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求的车间内进行。5.4.1.2所有操作需事先制定标准规范，由经专业培训的技术人员严格遵照执行，并进行记录登记，相关记录入档保留至少 30 年。5.4.1.3分离与培养过程中应标识干细胞的名称、代次、批次、操作日期、培养条件、操作人员姓名等信息。5.4.1.4所使用试剂应尽量采用符合国家 GMP、中华人民共和国药典、干细胞通用要求和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则 要求的药品辅料或已获批的药品， 应出具产品质检合格报告，并对各批次试剂进行质量抽检。5.4.1.5尽可能避免人源或动物源性血清及蛋白，不得使用同种异体人血清或血浆。如必须使用动物血清，应确保其无特定动物源性病毒污染。严禁使用海绵体状脑病流行区来源的牛血清。5.4.2分离与培养方法5.4.2.1新生儿脐带间充质干细胞新生儿脐带组织剥取华通氏胶， 以组织块贴壁法或胶原酶消化法分离新生儿脐带间充质干细胞。 采用贴壁法进行新生儿脐带间充质干细胞原代培养。5.4.2.2新生儿脐带血间充质干细胞新生儿脐带血样本，用无菌磷酸盐缓冲液稀释后，以密度梯度离心法分离单个核细胞。采用贴壁法进行新生儿脐带血间充质干细胞原代培养。5.4.2.3新生儿胎盘间充质干细胞去除胎盘羊膜、 绒毛膜及绒毛组织， 剪取脐带近端的胎盘组织， 以酶消化法分离胎盘间充质干细胞。采用贴壁法进行新生儿胎盘间充质干细胞原代培养。5.4.2.4脂肪间充质干细胞成人脂肪组织剪碎至糜状， 以胶原酶消化法分离脂肪间充质干细胞。 采用贴壁法进行人脂肪间充质干细胞原代培养。5.4.2.5骨髓间充质干细胞人骨髓液样本，用无菌磷酸盐缓冲液稀释后，以密度梯度离心法分离单个核细胞。采用贴壁法进行人骨髓间充质干细胞原代培养。5.4.2.6子宫内膜间充质干细胞子宫内膜组织样本剪碎至糜状， 以胶原酶消化法分离宫内膜间充质干细胞。 采用贴壁法进行人子宫内膜间充质干细胞原代培养。5.4.2.7牙髓间充质干细胞DB32/T 3544-201910牙齿样本，完整剥离牙髓，以酶消化法分离牙髓间充质干细胞。采用贴壁法进行人牙髓间充质干细胞原代培养。5.5人间充质干细胞换液5.5.1临床级人间充质干细胞换液操作需严格遵照 GMP、干细胞通用要求和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求，保证无外源微生物污染，相关操作均进行记录并入档保存至少 30 年。5.5.2换液时间及频次需根据人间充质干细胞生长情况及培养基状态进行判断，以保障人间充质干细胞生长所需营养物质水平，并消除代谢物毒害作用。5.5.3换液操作时吸弃培养瓶中原有的部分或全部培养液，再加入新鲜培养液。首次换液需要在镜下观察到原代细胞完全贴壁和延展后方可进行。5.5.4培养基成分应符合临床级人间充质干细胞分离与培养基本要求，尽量采用已获国家批准的临床级产品或药品辅料。5.6人间充质干细胞传代5.6.1临床级人间充质干细胞传代操作应严格遵照 GMP、干细胞通用要求和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求，保证无外源微生物污染，相关操作均进行记录并入档保存至少 30 年。5.6.2人间充质干细胞一般情况在达到 80%90%融合度可进行传代操作， 传代操作应密度适宜、 及时，迅速。5.6.3传代所使用消化酶应符合临床级人间充质干细胞分离与培养的基本要求，尽量采用国家已批准的临床级产品。如必须使用动物源性消化酶，应确保其无特定动物源性病毒污染。5.7人间充质干细胞冻存5.7.1临床级人间充质干细胞冻存操作应严格遵照 GMP、干细胞通用要求和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求，保证无外源微生物污染，相关操作均进行记录并入档保存至少 30 年。5.7.2经制备数量达到冻存要求的人间充质干细胞系可进行冻存操作，冻存细胞需加入适当的冻存保护液，遵循程序降温原则，并在液氮中进行保存。5.7.3冻存液成分应符合临床级人间充质干细胞分离与培养的基本要求，尽量采用国家已批准的临床级产品或药品辅料，二甲基亚砜含量不得超过 10%，如必须使用动物源性血清，应确保其无特定动物源性病毒污染，严禁使用海绵状脑病流行区来源的牛血清。5.7.4冻存细胞应标明干细胞名称、培养条件、代次、批次、操作人员、冻存日期等信息，并具有唯一标识。5.7.5液氮冻存应使用符合要求的液氮容器，气相冻存，由专人负责，保证液氮充足，温度恒定。5.8人间充质干细胞复苏5.8.1临床级人间充质干细胞复苏操作应严格遵照 GMP、干细胞通用要求和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求，保证无外源微生物污染，相关操作均进行记录并入档保存至少 30 年。5.8.2自液氮容器中取出装有间充质干细胞的冻存管，迅速核对信息并检查盖子是否旋紧。5.8.3将冻存管立即投入 37水浴锅中，轻摇冻存管使其在 1 分钟内全部融化，消毒剂擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。5.8.4快速转移干细胞悬液至含有培养基的无菌离心管内，离心洗涤至少 2 次，加入新鲜培养基重悬细胞，混合均匀，转移至培养瓶，置于 CO2培养箱培养。DB32/T 3544-2019115.8.5复苏细胞应标明细胞名称、代次、批次、培养条件、操作人员，复苏时间等信息。5.9人间充质干细胞制剂制备5.9.1临床级人间充质干细胞制剂制备应严格遵照 GMP、干细胞通用要求和干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则要求，保证无外源微生物污染，相关操作均进行记录并入档保存至少 30 年。5.9.2临床级人间充质干细胞制剂主要成分应为质量合格的临床级人间充质干细胞，其余成分应符合中华人民共和国药典对药品辅料的要求，并避免对人间充质干细胞的渗透压、状态、功能等特性产生影响。5.9.3临床级人间充质干细胞制剂制备完成到临床使用前应在2-8洁净条件下暂存， 保存时间不应超过12小时。使用前干细胞制剂应为均质状态，无明显絮状沉淀，细胞存活率90。5.10人间充质干细胞运输5.10.1根据干细胞的使用要求，选择合适的承载细胞的容器、运输方式、运输条件、运输设备和运输路线，由专人负责，制定保障措施，保证临床级人间充质干细胞生物学特性、安全性、稳定性和有效性。5.10.2运输条件的控制应包括但不限于温度范围、振荡、无污染、设备性能和包装等。5.10.3干细胞的运输应全程记录，包括但不限于干细胞运输的方式、条件、路径、时间、人员、地址及干细胞信息等，记录入档保存至少 30 年。6质量控制6.1质控内容6.1.1临床级人间充质干细胞生物学特性6.1.1.1细胞形态检测显微镜下观察，人间充质干细胞漩涡状贴壁生长，呈长梭形纤维细胞样，形态均一。6.1.1.2表面标志物检测采用流式细胞术进行测定， 人间充质干细胞表面标志物CD73、 CD90、 CD105阳性率不低于95%；CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR 阳性率不高于 5%。6.1.1.3分化能力检测采用体外条件培养基诱导培养下，人间充质干细胞应能够分化为成脂肪、骨、软骨细胞。成脂分化经油红 O 染色法鉴定，成骨分化经茜素红染色法鉴定，成软骨分化经阿尔辛蓝染色法鉴定。6.1.1.4染色体核型检测采用 G 带分析法进行测定，人间充质干细胞染色体数量为 46（含 XX/XY），无染色体缺失、异位和重排现象。6.1.1.5免疫调节功能检测采用 ELISA 技术和流式细胞术测定经炎症因子（IFN-与 TNF-）诱导后人间充质干细胞中吲哚胺 2，3-双加氧酶（IDO）的表达和功能，以及对于活化的人总淋巴细胞的增殖和对不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响。临床级人间充质干细胞经诱导应表达 IDO，并可抑制人淋巴细胞增殖。DB32/T 3544-2019126.1.2临床级人间充质干细胞安全性6.1.2.1无菌检测参照中华人民共和国药典2015 年版四部通则 1101 无菌检测法执行，对临床级人间充质干细胞样本采集、运输、分离、培养、冻存、复苏等生产制备环节进行留样（保存液、清洗液、培养基上清、冻存液等）检测。细菌和真菌检测结果都应为阴性。6.1.2.2支原体检测参照中华人民共和国药典2015 年版四部通则 3301 支原体检测法执行，对临床级人间充质干细胞样本采集、运输、分离、培养、冻存、复苏等生产制备环节进行留样（保存液、清洗液、培养基上清、冻存液等）检测。支原体检测结果都应为阴性。6.1.2.3细胞内外源致病因子检测采用血清 ELISA 检测法或核酸检测法，对临床级人间充质干细胞样本采集、运输、分离、培养、冻存、复苏等生产制备环节进行留样（保存液、清洗液、培养基上清、冻存液、细胞等）检测。HIV 抗体、HBsAg、HCV 抗体、TP 抗体、CMV-IgM、HTLV 抗体、HPV 抗体、HHV 抗体、EBV 抗体检测应为阴性；HCV、HBV、HIV 病毒核酸检测应为阴性。6.1.2.4内毒素检测参照中国药品检验标准操作规程 2010 年版细菌内毒素检查法执行，对临床级人间充质干细胞样本采集、运输、分离、培养、冻存、复苏等生产制备环节进行留样（保存液、清洗液、培养基上清、冻存液等）检测。各类样本中的内毒素检测值应0.5 EU/mL。6.1.2.5异常免疫学反应检测采用流式细胞术以及 ELISA 技术测定异体来源人间充质干细胞对于活化的人总淋巴细胞的增殖和对不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响， 以及对淋巴细胞相关细胞因子分泌的影响。 淋巴细胞亚群应无异常增殖，细胞因子表达水平应无异常增加。6.1.2.6致瘤性检测采用免疫缺陷动物（裸鼠或 SCID 鼠），通过局部或静脉方式接种人间充质干细胞，评价人间充质干细胞致瘤性。体内致瘤试验严格遵照动物伦理要求执行，单只小鼠接种人间充质干细胞数量106细胞/kg，观察期12 周。临床级人间充质干细胞应无致瘤性。6.1.2.7培养基及其他添加成分残余量检测参照中华人民共和国药典2015 年版三部生物制品中抗生素及牛血清白蛋白（BSA）残留量检查法执行。临床级人间充质干细胞制剂内应无抗生素残留，BSA 残留量应50 ng/mL。6.1.3临床级人间充质干细胞稳定性6.1.3.1存活率检测采用台盼蓝拒染法进行细胞存活率测定，各代数及批次临床级人间充质干细胞活细胞比例90%。6.1.3.2生长活性检测DB32/T 3544-201913通过检测细胞倍增时间、 细胞周期、 克隆形成率以及端粒酶活性对人间充质干细胞生长活性进行测定，各代数及批次临床级间充质干细胞应处于指数生长期，G0期细胞数10%，具有端粒酶活性。6.1.3.3细胞纯度和均一性检测采用人间充质干细胞表面标志物流式检测以及人基因组DNA短片段重复序列（STR）测序进行检定。各代数及批次临床级人间充质干细胞表面标志物表达应符合流式检测比例要求， 单一细胞系的临床级人间充质干细胞各代次及批次细胞STR检测结果应保持一致。6.2质控分类6.2.1批次质量检验临床级人间充质干细胞制备机构应对由同一供体、同一组织来源、同一时间、使用同一工艺采集和分离获得的干细胞制剂进行例行批次质量检验。当制备工艺、耗材、试剂、场地或规模等条件发生时，制备机构应对多批次干细胞制剂进行质量检验，确保工艺和质量稳定合格，记录入档保存至少30年。质量控制检测表参见附录C。6.2.2放行质量检验每一批次临床级人间充质干细胞制剂在临床使用前应在完成例行质量检验的基础上， 由干细胞临床研究机构质检平台进行快速和简化的质量检测，应包括但不限于活率、细胞表型、细菌、病毒、支原体和内毒素含量等，确认制剂合格后方可申请临床放行使用。相关记录报告应入档保存至少30年。6.2.3复核质量检验临床级人间充质干细胞制备机构应对每一批次干细胞制剂单独留样保存，详细记录批号、代次、生产日期、 来源等信息。 定期由国家或地方相关部门授权的专业细胞检验机构或实验室进行临床级人间充质干细胞制剂的质量复核检验,并出具检验报告，入档保存至少30年。复核质量检验报告出具时间应在该批次临床级人间充质干细胞制剂提出临床放行申请之前，并作为放行检验参考。DB32/T 3544-201914A附录A（资料性附录）样本捐献供者知情同意书如有问题或疑问可与下列人员联系如有问题或疑问可与下列人员联系如您对样本采集有任何问题，请联系：项目负责人：XXX，电话：XXXXXXXXXXX如果您对您的权利有任何疑问，请联系：伦理审查委员会负责人：XXX电话：XXXXXXXXXX同意：是同意：是/ /否否姓名：出生：姓名：出生：_年年_月月请仔细阅读以下内容，并慎重考虑。如果同意，请签名：请仔细阅读以下内容，并慎重考虑。如果同意，请签名：我同意我同意: :提供_样本；将从我所提供的样本分离间充质细胞，并进行扩增，并用于病人；扩增的间充质细胞，冷冻保存，经过相应机构批准方可用于病人；我的样本所产生的间充质干细胞及其所获得的临床数据可被不同类型的研究机构应用、研究，其中包括公司；我同意不从在此产生的具有商业价值的产品中获利；一旦样本被收集，我将无法取回样本或从科学数据库中取回有关样本的信息。我已经阅读相关材料的内容，对于所产生的问题询问了有关人员，并得到答复。我知道提供样本是我自己的选择。志愿者签名志愿者签名 _日期日期_志愿者收到复印件志愿者收到复印件:_是是/否否DB32/T 3544-201915AB附录B（资料性附录）干细胞供者健康信息采集表采集样本信息编码采样日期参与者信息参与者信息姓名年龄/出生日期国家民族过往疾病有_无身份证号码联系电话联系地址联系邮箱法定监护人信息法定监护人信息姓名年龄/出生日期国家民族过往疾病有_无身份证号码联系电话联系地址联系邮箱化验结果化验结果血型A B O ABRH+ -血常规Hb(血红蛋白) g/L；WBC(白细胞) 109/L；PLT(血小板) 109/LHBsAg(乙肝表面抗原)+ -HBcAb(乙肝核心抗体)+ -HCV-Ab（丙肝抗体）+ -Anti-HIV(艾滋病抗体)+ -ALT（谷丙转氨酶）正常异常AST（谷草转氨酶）正常异常CMV-LGM（巨细胞病毒LGM抗体）+ -梅毒血清+ -地中海贫血（参与者/产妇/配偶）+ -G-6PD 缺乏症（参与者/产妇/配偶）+ -备注DB32/T 3544-201916BC附录C（资料性附录）临床级人间充质干细胞质量控制检测表检测项目检测项目取样时间点取样时间点样品名称及样品名称及数量数量检测内容检测内容检测结果检测结果检测人信息检测人信息备注信息备注信息细胞形态采用显微镜进行镜检细胞鉴别采用流式细胞术检测细胞表面标志物细胞活率台盼蓝拒染法检测生长活性采用细胞计数、流式细胞术和端粒酶酶活试剂盒检测细胞倍增时间、克隆形成率、细胞周期，和端粒酶活性染色体核型采用 G 带分析法进行测定纯度及均一性采用流式细胞术和基因组 STR测序技术进行测定无菌性检测细菌和真菌检测支原体检测支原体检测细胞内外源致病因子检测HIV 抗体、HBsAg、HCV 抗体、TP 抗体、 CMV-IgM、 HTLV 抗体、HPV抗体、 EBV抗体检测；HCV、HBV、HIV 病毒核酸检测内毒素检测采用鲎试剂盒检测法进行检定培养基及其他添加成分残余量采用 ELISA 和试剂盒测定 BSA及抗生素残留异常免疫学反应采用流式细胞术以及ELISA技术进行测定对人淋巴细胞增殖及因子表达影响致瘤性检测裸鼠或 SCID 鼠体内致瘤性试验分化潜能检测成脂、成骨、成软骨三向分化实验免疫调节能力采用ELISA技术和流式细胞术进行测定IDO表达及对人淋巴细胞增殖的调节作用