第四章核酸化学.pptx

第四章核酸化学目目 录录第一节第一节 核酸得概念、分类和功能核酸得概念、分类和功能 第二节第二节 核酸得组成和分子结构核酸得组成和分子结构 第三节第三节 DNA DNA得结构得结构 第五节第五节 核酸得性质及分离、分析核酸得性质及分离、分析 第六节第六节 核酸得应用核酸得应用第四节第四节 RNA RNA得结构得结构 第一节第一节 核酸得概念、分类和功能核酸得概念、分类和功能一、核酸得发现一、核酸得发现二、核酸概念和分类二、核酸概念和分类l18681868年年,F,F、MiescherMiescher首先从伤员绷带得脓首先从伤员绷带得脓细胞中分离得到称为细胞中分离得到称为“核素核素”得核酸得核酸l18891889年年,Altman,Altman等从酵母和动物得细胞核等从酵母和动物得细胞核中制备出不含蛋白质得核酸中制备出不含蛋白质得核酸,这就是首次这就是首次使用使用核酸核酸这一词。这一词。l19441944年年,O,O、N N、AveryAvery通过转化实验证实通过转化实验证实DNADNA就是主要得遗传物质就是主要得遗传物质l19531953年年,J,J、D D、WatsonWatson和和F F、H H、C C、CrickCrick提出提出DNA DNA 双螺旋结构模型双螺旋结构模型 核酸得发现和研究简史核酸得发现和研究简史l19681968年年 NirenbergNirenberg发现发现遗传密码。遗传密码。l19751975年年 TeminTemin和和BaltimoreBaltimore发现发现逆转录酶。逆转录酶。l19811981年年 GilbertGilbert和和SangerSanger建立建立DNA测序方法。测序方法。l19851985年年 Mullis Mullis发明发明PCR技术技术。l19901990年年 美国启动人类基因组计划美国启动人类基因组计划(HGP)HGP)。l19941994年年 中国人类基因组计划启动。中国人类基因组计划启动。l20002000年年 人类基因组计划。人类基因组计划。第一节第一节 核酸得概念、分类和功能核酸得概念、分类和功能 l核酸核酸(nucleic acid)(nucleic acid)就是生物体内含有磷酸基团得就是生物体内含有磷酸基团得重要生物大分子重要生物大分子,主要作用就是信息得储存和传递。主要作用就是信息得储存和传递。l核酸分为脱氧核糖核酸核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)以及核糖核酸以及核糖核酸 (RNA)(RNA)两类两类,DNA,DNA所含核苷酸分子数比所含核苷酸分子数比RNARNA大得多。大得多。lRNARNA分为三个类型分为三个类型,即核糖体即核糖体 RNA(rRNA)RNA(rRNA)、信使、信使RNA(mRNA)RNA(mRNA)和转移和转移RNA(tRNA),RNA(tRNA),她们都参与蛋白质合她们都参与蛋白质合成。成。lDNADNA就是遗传得物质基础就是遗传得物质基础,负责遗传信息得贮负责遗传信息得贮存和发布存和发布,遗传基因就就是遗传基因就就是DNADNA链上得若干核链上得若干核苷酸所组成得片段。苷酸所组成得片段。lRNARNA负责遗传信息得表达负责遗传信息得表达,直接参与蛋白质生直接参与蛋白质生物合成物合成,转录转录DNADNA所发布得遗传信息所发布得遗传信息,并将之翻并将之翻译给蛋白质译给蛋白质,使生命机体得生长、发育、繁殖使生命机体得生长、发育、繁殖和遗传得以继续进行和遗传得以继续进行。核酸得功能核酸得功能核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解核蛋白核蛋白蛋白质蛋白质第二节第二节 核酸得组成和分子结构核酸得组成和分子结构 组成元素组成元素(C,H,O,N,P)大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点一、戊糖一、戊糖 三、核苷三、核苷二、碱基二、碱基四、核苷酸四、核苷酸第二节第二节 核酸得组成和分子结构核酸得组成和分子结构 五、核酸五、核酸组成核酸得戊糖有两种组成核酸得戊糖有两种 组成组成DNADNA 组成组成RNARNA一、戊糖一、戊糖二、碱基二、碱基1 1、嘧啶碱基、嘧啶碱基2 2、嘌呤碱基、嘌呤碱基3 3、稀有碱基、稀有碱基4 4、碱基得性质、碱基得性质核酸中得碱基分两类核酸中得碱基分两类:(1)(1)嘧啶碱嘧啶碱:胞嘧啶胞嘧啶(C)(C)尿嘧啶尿嘧啶(U)(U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)(2)(2)嘌呤碱嘌呤碱:腺嘌呤腺嘌呤(A)(A)鸟嘌呤鸟嘌呤(G)(G)二、碱基二、碱基尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶 U U胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶 T T胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶 C CDNADNA特有特有特有特有RNARNA特有特有特有特有1 1、嘧啶碱基、嘧啶碱基鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤 G G腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤 A A2 2、嘌呤碱基、嘌呤碱基3 3、稀有碱基、稀有碱基核酸中得部分稀有碱基核酸中得部分稀有碱基DNADNARNARNA嘌嘌呤呤7-7-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤N N6 6-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤N N6 6-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤N N 6 6,N,N 6 6-二甲基腺嘌呤二甲基腺嘌呤7-7-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤嘧嘧啶啶5-5-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶5-5-羟甲基胞嘧啶羟甲基胞嘧啶假尿嘧啶假尿嘧啶二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶3 3、稀有碱基、稀有碱基假尿苷（假尿苷（）二氢尿嘧啶（二氢尿嘧啶（DHU）AmCH3CH3H3Cm26AHH52-O-2-O-甲基腺苷甲基腺苷甲基腺苷甲基腺苷(Am)(Am)4 4、碱基得性质、碱基得性质酮式烯醇式互变异构酮式烯醇式互变异构氨基亚氨基互变异构氨基亚氨基互变异构具有吸收紫外光得性质具有吸收紫外光得性质,最大吸收波长在最大吸收波长在260 nm左右左右碱基得紫外吸收光谱随碱基得紫外吸收光谱随pH得改变而改变得改变而改变化学性质比较稳定化学性质比较稳定嘌呤碱基还可以被银盐沉淀嘌呤碱基还可以被银盐沉淀 三、核苷三、核苷1 1、核苷得结构、核苷得结构2 2、核苷得书写、核苷得书写核苷就是一种糖苷核苷就是一种糖苷,由戌糖和碱基缩合而成。由戌糖和碱基缩合而成。糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖得第一糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖得第一位上得碳原子位上得碳原子(C1)与嘧啶碱得第一位上得氮与嘧啶碱得第一位上得氮原子原子(N1)或嘌呤碱得第九位上得氮原子或嘌呤碱得第九位上得氮原子(N9)相连相连,所以糖与碱基间得连键就是所以糖与碱基间得连键就是N-C键键,一一般称之为般称之为N-糖苷键。糖苷键。1 1、核苷得结构、核苷得结构糖与碱基之间以糖与碱基之间以C-NC-N糖苷键连接糖苷键连接11191 1、核苷得结构、核苷得结构1122334455(OH)1122334455(OH)嘧啶核苷嘧啶核苷嘌呤核苷嘌呤核苷2 2、核苷得书写、核苷得书写核苷可用单字符号核苷可用单字符号A(腺嘌呤核苷腺嘌呤核苷,简称腺苷简称腺苷)、G(鸟苷鸟苷)、C(胞苷胞苷)、U(尿苷尿苷)表示。表示。脱氧核苷则在单字符号前面加一个小写得脱氧核苷则在单字符号前面加一个小写得d,如如dA(腺嘌呤脱氧核糖核苷腺嘌呤脱氧核糖核苷,简称脱氧腺苷简称脱氧腺苷)、dG(脱氧鸟脱氧鸟苷苷)、dC(脱氧胞苷脱氧胞苷)、dT(脱氧胸苷脱氧胸苷)。稀有碱基稀有碱基(或称为修饰碱基或称为修饰碱基)与戊糖通过糖苷键结与戊糖通过糖苷键结合生成得核苷称为稀有核苷合生成得核苷称为稀有核苷(或称为修饰核苷或称为修饰核苷)。1 1、核苷酸得种类、核苷酸得种类2 2、核苷酸得结构与命名、核苷酸得结构与命名3 3、多磷酸核苷及其衍生物、多磷酸核苷及其衍生物4 4、环核苷酸、环核苷酸5 5、核苷酸得性质、核苷酸得性质四、核苷酸四、核苷酸核苷中得戌糖羟基被磷酸酯化核苷中得戌糖羟基被磷酸酯化,就形成核苷酸就形成核苷酸作作为为DNA或或RNA结结构构单单元元得得核核苷苷酸酸分分别别就就是是5-磷酸磷酸-脱氧核糖核苷和脱氧核糖核苷和5-磷酸磷酸-核糖核苷。核糖核苷。1 1、核苷酸得种类、核苷酸得种类1 1、核苷酸得种类、核苷酸得种类核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸或脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。NNNN9NH2OO HO HHHHCH2H1 2OPO-HOO糖苷键糖苷键酯键酯键2 2、核苷酸得结构与命名、核苷酸得结构与命名l lM-M-单单单单(D-(D-(D-(D-二二二二;T;T;T;T三三三三);P-);P-);P-);P-磷酸磷酸磷酸磷酸lRNARNA得名称为某得名称为某(单、二、三单、二、三)磷酸核苷酸磷酸核苷酸,DNA,DNA在某在某(单、二、三单、二、三)前加脱氧两字。前加脱氧两字。l如如AMPAMP称腺苷磷酸称腺苷磷酸(或腺苷酸或腺苷酸),dAMP),dAMP称为脱氧腺称为脱氧腺苷磷酸苷磷酸(脱氧腺苷酸脱氧腺苷酸)。八种核苷酸得表示八种核苷酸得表示2 2、核苷酸得结构与命名、核苷酸得结构与命名参参与与核核酸酸生生物物合合成成得得直直接接原原料料不不就就是是一一磷磷酸酸核核苷苷酸酸,而而就就是是三三磷磷酸酸核核苷苷酸酸,如如ATP ATP(三磷酸腺苷酸三磷酸腺苷酸)。ATPATP上得磷酸残基用上得磷酸残基用、来编号。来编号。ATPATP含有两个高能磷酸酯键含有两个高能磷酸酯键(P),P),其水解时释放出其水解时释放出得能量为得能量为7 7、3 3千卡千卡/克分子克分子(普通磷酸酯键为普通磷酸酯键为2 2千卡千卡/克分子克分子)。ATPATP在细胞能量代谢中起着及其重要得作用。在细胞能量代谢中起着及其重要得作用。3 3、多磷酸核苷及其衍生物、多磷酸核苷及其衍生物n n1 1 1 1、继续磷酸化继续磷酸化继续磷酸化继续磷酸化AMPADPATP3 3、多磷酸核苷及其衍生物、多磷酸核苷及其衍生物环化磷酸化环化磷酸化:cAMP:cAMP和和cGMPcGMP在细胞得代谢调节中有在细胞得代谢调节中有重要作用重要作用,称为第二信使称为第二信使 cAMPcGMP3 3、多磷酸核苷及其衍生物、多磷酸核苷及其衍生物3 3、含核苷酸得生物活性物质、含核苷酸得生物活性物质:NAD+NAD+、NADP+NADP+、CoASHCoASH、FADFAD等等3 3、多磷酸核苷及其衍生物、多磷酸核苷及其衍生物4 4、核苷酸得性质、核苷酸得性质碱基可以发生酮式和烯醇式得互变异构碱基可以发生酮式和烯醇式得互变异构,体内以酮体内以酮式为主。式为主。核苷酸在核苷酸在240290 nm具有强烈得光吸收具有强烈得光吸收,最大吸最大吸收波长在收波长在260 nm左右。左右。核苷酸就是两性电解质核苷酸就是两性电解质,在不同得在不同得pH条件下条件下,其解其解离程度不同离程度不同,在某一在某一pH值时值时,对外不表现出电性对外不表现出电性,该该pH值称为其等电点。值称为其等电点。核苷酸在日常生活中也有重要用途核苷酸在日常生活中也有重要用途,如在食品行业如在食品行业中作为鲜味剂中作为鲜味剂,称为呈味核苷酸。称为呈味核苷酸。一般物理性质一般物理性质:1 1、核酸得结构、核酸得结构2 2、核酸得降解、核酸得降解五、核酸五、核酸脱脱脱脱HH2 2OO脂键相连脂键相连脂键相连脂键相连3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键首首尾尾35531 1、核核酸酸得得结结构构2 2、核酸得降解、核酸得降解(1)(1)碱水解碱水解(2)(2)酸水解酸水解(3)(3)酶水解酶水解(1)(1)碱水解碱水解RNA用用0、3 mol/L得得NaOH在在37条件下处条件下处理理1618 h可被完全降解可被完全降解,得到得到2-核苷酸和核苷酸和3-核苷酸。核苷酸。同样得条件下同样得条件下DNA十分稳定十分稳定,不被降解。不被降解。利用此性质可以进行利用此性质可以进行DNA和和RNA得鉴别和得鉴别和分离。分离。(1)(1)碱水解碱水解RNARNA水解产物中会含有水解产物中会含有2-2-核苷酸？核苷酸？(2)(2)酸水解酸水解在不同得酸浓度下在不同得酸浓度下,核酸得水解产物不同。核酸得水解产物不同。嘌呤得糖苷键比嘧啶得糖苷键对酸更不稳嘌呤得糖苷键比嘧啶得糖苷键对酸更不稳定。定。脱氧核糖得糖苷键比核糖得糖苷键更易被脱氧核糖得糖苷键比核糖得糖苷键更易被酸水解酸水解。(3)(3)酶水解酶水解按照核酸酶作用底物按照核酸酶作用底物:分为核糖核分为核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶酸酶和脱氧核糖核酸酶按照核酸酶对底物作用方式按照核酸酶对底物作用方式:分为分为核酸外切酶和核酸内切酶核酸外切酶和核酸内切酶按照核酸酶所作用化学键按照核酸酶所作用化学键:分为磷分为磷酸二酯酶和磷酸单酯酶酸二酯酶和磷酸单酯酶(3)(3)酶水解酶水解核糖核核糖核酸酶和脱酸酶和脱氧核糖核氧核糖核酸酶。酸酶。核酸外核酸外切酶和核切酶和核酸内切酶。酸内切酶。磷酸二磷酸二酯酶和磷酯酶和磷酸单酯酶。酸单酯酶。一、一、DNA得一级结构得一级结构 三、三、DNA得三级结构得三级结构 二、二、DNA得二级结构得二级结构 四、核酸序列得研究方法四、核酸序列得研究方法第三节第三节 DNA DNA得结构得结构 五、五、DNA基因组基因组一、一、DNA得一级结构得一级结构 双链线性分子双链线性分子:细胞核内得细胞核内得DNA、有些动物病毒。有些动物病毒。环状双链环状双链DNA:原核生物染色体原核生物染色体DNA、质粒、质粒DNA、真核生物细胞器、真核生物细胞器DNA、有些动物病毒。、有些动物病毒。各各核核苷苷酸酸残残基基沿沿多多核核苷苷酸酸链链排排列列得得顺顺序序叫叫核核酸酸得得一级结构。一级结构。连连接接键键:3,5:3,5一一磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接起起来来得得直直线线形形或或环环形分子。形分子。DNADNA没有侧链。没有侧链。一、一、DNA得一级结构得一级结构 DNA线条缩写线条缩写:戊糖戊糖5-磷酸磷酸PA A核苷酸核苷酸53首端首端末端末端PPPPPP A G C T G C A G C T G C OH OH3-OH3-OH 核苷酸顺序又称碱基顺序核苷酸顺序又称碱基顺序,就是蛋白质与核就是蛋白质与核酸结构得生物语言。酸结构得生物语言。碱基碱基一、一、DNA得一级结构得一级结构 DNA字母简写字母简写:5 P A P G P C P T P G P C-OH 3 或或 5 A G C T G C 3一、一、DNA得一级结构得一级结构 公公认认得得为为1953年年watson和和 crick提提出出得得DNA双双螺螺旋旋结构模型。结构模型。二、二、DNA得二级结得二级结构构 二、二、DNA得二级结构得二级结构 1 1、实验证据、实验证据2 2、B-DNAB-DNA双螺旋结构模型得要点双螺旋结构模型得要点3 3、双螺旋结构得稳定性、双螺旋结构得稳定性4 4、DNADNA双螺旋得不同类型双螺旋得不同类型5 5、三螺旋、三螺旋DNADNA和四螺旋和四螺旋DNA DNA 1 1、实验证据、实验证据(1)20世纪世纪40年代末年代末,Avery证实了遗传物质就是证实了遗传物质就是DNA(2)20世纪世纪50年代初年代初,Chargaff规则规则:无组织特异性无组织特异性;不随生物体得年龄、营养状态或环境不随生物体得年龄、营养状态或环境变化而改变变化而改变;A=T,G=C;不同生物来源得不同生物来源得DNA碱基组碱基组成不同。成不同。(3)1952年年,Wilkins和和Franklin等人研究等人研究DNA得得X光衍射光衍射图谱图谱,说明说明DNA分子可能含有螺旋结构。分子可能含有螺旋结构。(4)1952年年,Gulland和和Jordan,说明说明DNA分子中得碱基间分子中得碱基间会形成会形成氢键。氢键。(5)1953年年,Watson和和Crick,DNA双螺旋结构模型。双螺旋结构模型。(1)w两条多核苷酸链组成两条多核苷酸链组成w反向平行反向平行(p5-糖糖3-p得结构与得结构与p3-糖糖5-p得结构相对得结构相对)w两条链得糖磷酸主链都就是右手螺旋两条链得糖磷酸主链都就是右手螺旋,有一共同螺旋轴有一共同螺旋轴2 2、B-DNAB-DNA双螺旋结构模型得要点双螺旋结构模型得要点(2)两条链上得碱基互补配对两条链上得碱基互补配对:wA-T,C-G或或T-A,G-CwA与与T之间为二个氢键之间为二个氢键,C与与G之间为三个氢键之间为三个氢键2 2、B-DNAB-DNA双螺旋结构模型得要点双螺旋结构模型得要点2 2、B-DNAB-DNA双螺旋结构模型得要点双螺旋结构模型得要点双螺旋得螺双螺旋得螺距为距为3、4 nm,螺旋得直径为螺旋得直径为2 nm,相邻碱基对相邻碱基对平面间得距离平面间得距离就是就是0、34 nm。双螺旋得每双螺旋得每一转有一转有10对核对核苷酸苷酸,相邻核苷相邻核苷酸之间得夹角酸之间得夹角为为36。(3)螺螺旋旋表表面面有有一一条条大大沟沟和和一一条小沟条小沟大沟大沟小沟小沟2 2、B-DNAB-DNA双螺旋结构模型得要点双螺旋结构模型得要点(4)2 2、B-DNAB-DNA双螺旋结构模型得要点双螺旋结构模型得要点(5)碱基平面与碱基平面与双螺旋得中心双螺旋得中心轴垂直轴垂直,糖环平糖环平面与中心轴平面与中心轴平行。行。2 2、B-DNAB-DNA双螺旋结构模型得要点双螺旋结构模型得要点(6)双螺旋结双螺旋结构横向靠氢键构横向靠氢键稳定稳定,纵向靠纵向靠碱基堆积力维碱基堆积力维系稳定。系稳定。2 2、B-DNAB-DNA双螺旋结构模型得要点双螺旋结构模型得要点(7)一个链得碱基顺序一个链得碱基顺序确定后确定后,则另一条链必则另一条链必有相对应得碱基顺序。有相对应得碱基顺序。碱基互补原则具有碱基互补原则具有极重要意义极重要意义,DNA复制、复制、转录、反转录等过程转录、反转录等过程得分子基础都就是碱得分子基础都就是碱基互补配对。基互补配对。(1)(1)氢键氢键;(2)(2)离离子子键键及及范范德德华力华力;(3)(3)碱基堆积力碱基堆积力;3 3、双螺旋结构得稳定性、双螺旋结构得稳定性(1)(1)氢氢键键:两两条条链链间间碱碱基基得得相相互互作作用用,A,A与与T T之之间间为为二二条条氢氢键键,C,C与与G G之之间间为为三三条条氢氢键键。氢氢键键作作用用力力很很弱弱,但但DNADNA分分子子中中存存在大量氢键在大量氢键,因此氢键为一重要稳定因素因此氢键为一重要稳定因素;(2)(2)离离子子键键及及范范德德华华力力:DNA:DNA分分子子中中磷磷酸酸基基团团在在生生理理条条件件下下解解离离,使使DNADNA成成为为一一种种多多阴阴离离子子,这这有有利利于于她她与与带带正正电电荷荷得得其其她她阳阳离离子子基基团团发发生生静静电电作作用用,这这样样减减少少双双链链间间得得静静电电排排斥斥,有利于双螺旋得稳定有利于双螺旋得稳定;(3)(3)碱碱基基堆堆积积力力:目目前前普普遍遍认认为为堆堆积积碱碱基基间间得得疏疏水水作作用用就就是是稳稳定定DNADNA结结构构得得更更重重要要得得因因素素。大大量量碱碱基基层层层层堆堆积积,两两相相邻邻碱碱基基得得平平面面十十分分贴贴近近,于于就就是是使使双双螺螺旋旋结结构构内内部部形形成成一一个个强强大大得得疏疏水水区区,与与介介质质中中得得小小分分子子隔隔开开,有有利利于于互互补补碱碱基基之之间氢键得形成间氢键得形成;3 3、双螺旋结构得稳定性、双螺旋结构得稳定性4 4、DNADNA双螺旋得不同类型双螺旋得不同类型B型型DNA(BDNA):在在相相对对湿湿度度为为92%时时,所得到得所得到得DNA钠盐纤维钠盐纤维;A型型DNA(ADNA):在在相相对对湿湿度度低低于于75%时时,获得得获得得DNA钠盐纤维钠盐纤维;此外还有此外还有ZDNA等等;4 4、DNADNA双螺旋得不同类型双螺旋得不同类型5 5、三螺旋、三螺旋DNADNA和四螺旋和四螺旋DNA DNA 双螺旋双螺旋DNA可以与单链可以与单链DNA分子结分子结合形成三螺旋合形成三螺旋DNA;人工合成得单链人工合成得单链DNA序列序列(T/A)mGn(m14,n18)中得中得4个鸟嘌呤可个鸟嘌呤可以通过以通过Hoogsteen氢键配对形成分子内氢键配对形成分子内或分子间得四螺旋或分子间得四螺旋DNA;5 5、三螺旋、三螺旋DNADNA和四螺旋和四螺旋DNA DNA 当当研研究究某某些些小小病病毒毒、线线粒粒体体、叶叶绿绿体体及及某某些些细细菌菌中中分分离离出出来来降降解解得得DNADNA时时,发发现现她她们们得得双双螺螺旋旋二二级级结结构构还还可可进进一一步步紧紧缩缩成成闭闭链链环环状状或或开开链链环环状状以以及及麻麻花花状状等等,这这就就是是DNADNA形形成得三级结构。成得三级结构。松弛形松弛形解链环形解链环形负超螺旋负超螺旋三、三、DNA得三级结构得三级结构 DNADNA得三级结构得三级结构:在细胞内在细胞内,由于由于DNADNA分子与其她分分子与其她分子子(主要就是蛋白质主要就是蛋白质)得相互作用得相互作用,使使DNADNA双螺旋双螺旋进一步扭曲形成得高级结构。进一步扭曲形成得高级结构。l超螺旋就是指双螺旋进一步扭曲或再螺旋得构超螺旋就是指双螺旋进一步扭曲或再螺旋得构象象;l正超螺旋正超螺旋(盘绕方向与盘绕方向与DNADNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同)和和负超螺旋负超螺旋(盘绕方向与盘绕方向与DNADNA双螺旋方同相反双螺旋方同相反););l人类人类4646条染色体得条染色体得DNADNA总长可达总长可达1 1、7m,7m,经过螺经过螺旋化压缩旋化压缩,实际总长只有实际总长只有200nm;200nm;三、三、DNA得三级结构得三级结构 原核生物原核生物DNA得高级结构得高级结构真核生物真核生物DNADNA得存在形式得存在形式-核小体核小体l真核生物中真核生物中DNADNA双螺旋沿着组蛋白八聚体核双螺旋沿着组蛋白八聚体核心得短轴绕心得短轴绕1 1、7575圈圈,形成左手超螺旋形成左手超螺旋,称核称核小体。小体。l染色质得基本结构单位就是核小体。染色质得基本结构单位就是核小体。l串珠状结构进一步卷曲形成螺线管串珠状结构进一步卷曲形成螺线管,后者再后者再进一步卷曲形成超螺旋管进一步卷曲形成超螺旋管,形成染色单体。形成染色单体。一、一、RNA得一级结构得一级结构 二、二、RNA得高级结构得高级结构 第四节第四节 RNA RNA得结构得结构 RNA得一级结构指得得一级结构指得就是多核苷酸链中核糖就是多核苷酸链中核糖核苷酸得排列顺序核苷酸得排列顺序,即即多核苷酸链中碱基得排多核苷酸链中碱基得排列顺序。列顺序。RNA就是无分支得线就是无分支得线形结构。形结构。一、一、RNA得一级结构得一级结构 RNA RNA得二级结构基本上就是单股分子得二级结构基本上就是单股分子,其二其二级结构比级结构比DNADNA简单得多简单得多,但也存在少数碱基配但也存在少数碱基配对区域即双螺环结构。对区域即双螺环结构。二、二、RNA得高级结构得高级结构(1)(1)占总占总RNARNA得得1515(2)(2)一种氨基酸对应最少一种一种氨基酸对应最少一种RNARNA(3)(3)分子中含有较多修饰成分分子中含有较多修饰成分(4)3-(4)3-末端都具有末端都具有CCAOHCCAOH结构结构(5)(5)半数碱基可经过自身回折半数碱基可经过自身回折,形成形成局部双螺旋局部双螺旋“茎茎”结构结构,其间就其间就是单链形成得是单链形成得“环环”。绝大多数。绝大多数tRNAtRNA经过这样得折叠形成经过这样得折叠形成4 4个茎个茎和和4 4个环组成得特征性三叶草形个环组成得特征性三叶草形二级结构。二级结构。1、tRNA占总占总RNARNA得得80802、rRNA原核生物原核生物真核生物真核生物核糖体核糖体rRNArRNA核糖体核糖体rRNArRNA 30s 30s70s70s 50s 50s16s16s5s 5s、23s23s 40s40s80s80s 50s 50s 18s18s5s5s、5 5、8s8s、28s28s5sRNA5sRNA的二级结构的二级结构 占总占总RNARNA得得3 35 53、mRNA和和hnRNAl真核细胞真核细胞mRNAmRNA得得3-3-末端有一段长达末端有一段长达200200个核个核苷酸左右得聚腺苷酸苷酸左右得聚腺苷酸(polyA),(polyA),称为称为“尾结构尾结构”,5-”,5-末端有一个甲基化得鸟苷酸末端有一个甲基化得鸟苷酸,称为称为”帽结构帽结构“。hnRNA 内含子内含子mRNA 外显子外显子3、mRNA和和hnRNA真核生物真核生物mRNAmRNA特征特征:“帽子帽子”(m”(m7 7G-5ppp5-N-3p)+G-5ppp5-N-3p)+单顺反子单顺反子+“尾巴尾巴”(Poly A)”(Poly A)真核细胞真核细胞mRNAmRNA得结构特点得结构特点AAAAAAA-OH5“帽子帽子”PolyA 3 m7G-5ppp-N-3 plRNA得三级结构得三级结构l在在tRNAtRNA二级结构中二级结构中未配对得某些并不未配对得某些并不互补得碱基参与了互补得碱基参与了三级结构中特殊得三级结构中特殊得氢键作用氢键作用,tRNA,tRNA链中链中得核糖得核糖-磷酸骨架与磷酸骨架与某些碱基甚至其她某些碱基甚至其她得骨架之间也能产得骨架之间也能产生作用。生作用。第五节第五节 核酸得性质及分离、分析核酸得性质及分离、分析 一、核酸得理化性质一、核酸得理化性质二、核酸得分离二、核酸得分离三、核酸得分析三、核酸得分析四、核酸测序得研究方法四、核酸测序得研究方法一、核酸得理化性质一、核酸得理化性质一、一般物理性质一、一般物理性质二、核酸得水解二、核酸得水解三、两性解离三、两性解离四、紫外吸收性质四、紫外吸收性质五、稳定性五、稳定性六、变性六、变性七、复性与杂交七、复性与杂交(一一)一般物理性质一般物理性质1 1、DNADNA白色纤维状固体白色纤维状固体,RNA,RNA白色粉末状固体白色粉末状固体,都微溶于水都微溶于水,不溶于乙醇不溶于乙醇,因此常用乙醇来因此常用乙醇来沉淀沉淀DNA;DNADNA;DNA溶液黏度大于溶液黏度大于RNA;RNA;2 2、DNADNA难溶于难溶于0 0、14mol/L14mol/L得得NaClNaCl溶液溶液,可溶于可溶于12 mol/L12 mol/L得得NaClNaCl溶液溶液,RNA,RNA则相反则相反,可据此可据此分离二者分离二者;(二二)核酸得水解核酸得水解1 1、核酸分子中得磷酸二酯键可在酸或碱性条件、核酸分子中得磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。下水解切断。2 2、DNADNA和和RNARNA对酸或碱得耐受程度有很大差别。对酸或碱得耐受程度有很大差别。室温条件下室温条件下,DNA,DNA在碱中变性在碱中变性,但不水解但不水解,RNA,RNA水水解。解。例如例如,在在0 0、1 mol/L NaOH1 mol/L NaOH溶液中溶液中,RNA,RNA几乎可以几乎可以完全水解完全水解;DNA;DNA在同样条件下则不受影响。在同样条件下则不受影响。DNADNA得相对分子质量较大得相对分子质量较大,一般为一般为10106 610109 9 bp,bp,大多数大多数DNADNA为线性分子为线性分子,分子极不对称分子极不对称,虽然其长度可达虽然其长度可达cmcm级但分子得直径只有级但分子得直径只有nmnm级。级。RNARNA得相对分子质量较小得相对分子质量较小,通常为通常为10104 410106 6 bpbp。(三三)两性解离两性解离1 1、核酸含酸性得磷酸基团、核酸含酸性得磷酸基团,又含弱碱性得又含弱碱性得碱基碱基,为两性电解质为两性电解质,可发生两性解离可发生两性解离;2 2、核酸相当于多元酸、核酸相当于多元酸,pH,pH大于大于4 4时时,呈阴离呈阴离子状态子状态;(四四)紫外吸收紫外吸收l在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系共轭双键体系,在在260 nm260 nm有吸收有吸收;l可以作为区别蛋白质和对核酸及其组可以作为区别蛋白质和对核酸及其组份定性和定量测定得依据份定性和定量测定得依据,进行核酸纯进行核酸纯度鉴定度鉴定,也可作为核酸变性和复性得指也可作为核酸变性和复性得指标。标。l1 1、DNA DNA或或RNARNA得定量得定量lODOD260260=1=1、0 0相当于相当于l5050g/mlg/ml双链双链DNADNAl4040g/mlg/ml单链单链DNA(DNA(或或RNA)RNA)l20g/ml20g/ml寡核苷酸寡核苷酸l2 2、判断核酸样品得纯度、判断核酸样品得纯度lDNADNA纯品纯品:OD:OD260260/OD/OD280280=1=1、8 8lRNARNA纯品纯品:OD:OD260260/OD/OD280280=2=2、0 0(五五)DNA)DNA得稳定性得稳定性lDNADNA得溶液呈粘稠状得溶液呈粘稠状,但实际上但实际上DNADNA得双螺旋结得双螺旋结构僵直而有刚性构僵直而有刚性,易断成碎片易断成碎片,这也就是目前难这也就是目前难以获得完整大分子以获得完整大分子DNADNA得原因。得原因。l溶液状态得溶液状态得DNADNA易受易受DNADNA酶作用而降解酶作用而降解,抽干水抽干水分得分得DNADNA性质十分稳定。性质十分稳定。(六六)DNA得变性得变性核酸得变性核酸得变性:指核酸双螺旋区氢键断裂指核酸双螺旋区氢键断裂,变成变成单链单链,她并不涉及共价键她并不涉及共价键(磷酸二酯键磷酸二酯键)得断得断裂。裂。DNADNA得变性得条件得变性得条件能够引起核酸变性得因素有能够引起核酸变性得因素有:o温度升高温度升高;o酸碱度改变、酸碱度改变、pH(11 pH(11、3 3或或55、0);0);o有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等;o低离子强度。低离子强度。DNADNA变性得特征变性得特征l变性核酸将失去其部分或全部得生物活性。变性核酸将失去其部分或全部得生物活性。l变性改变了变性改变了DNADNA得二级结构。核酸得变性并不涉得二级结构。核酸得变性并不涉及磷酸二酯键得断裂及磷酸二酯键得断裂,所以她得一级结构所以她得一级结构(碱基顺碱基顺序序)保持不变。保持不变。lDNADNA得变性过程就是突变性得得变性过程就是突变性得,她在很窄得温度区她在很窄得温度区间内完成。间内完成。DNA DNA解链温度解链温度l紫外吸收值明显增加紫外吸收值明显增加,即增色效应。即增色效应。l粘度降低粘度降低,沉降系数增加。沉降系数增加。DNADNA解链温度解链温度(熔点熔点,Tm,Tm)l当当50%50%得得DNADNA变性时得温度称为该变性时得温度称为该DNADNA得解链温度得解链温度,一般一般DNADNA得得T Tm m值在值在70-8570-85 C C之间。之间。l均一均一DNA(DNA(如病毒如病毒)得得T Tm m值范围较小。值范围较小。l分子中分子中G G和和C C得含量越高得含量越高,越不易变性越不易变性,T Tm m值越高。值越高。可通过经验公式计算可通过经验公式计算:(G+C)%=(Tm-69:(G+C)%=(Tm-69、3)X23)X2、4444lT Tm m值随溶液盐浓度增加而增大值随溶液盐浓度增加而增大,lT Tm m值较低值较低,易变性易变性,不易保存。不易保存。增色效应与减色效应增色效应与减色效应 天然天然DNADNA分子在热变性条件下分子在热变性条件下,双螺旋结构破坏双螺旋结构破坏,碱基暴露碱基暴露,在紫外光在紫外光260nm260nm波长处得吸收度明显波长处得吸收度明显增加增加,此现象称为增色效应。此现象称为增色效应。变性变性DNADNA分子复性形成双螺旋结构时其紫外吸分子复性形成双螺旋结构时其紫外吸收降低得现象称为减色效应。收降低得现象称为减色效应。(七七)DNA)DNA得复性得复性l概念概念l复性得条件复性得条件l分子杂交分子杂交1 1、复性得概念、复性得概念o变性变性DNADNA在适当得条件下在适当得条件下,两条彼此分开得单两条彼此分开得单链可以重新缔合成为双螺旋结构链可以重新缔合成为双螺旋结构,其物理性其物理性质和生物活性随之恢复质和生物活性随之恢复,这一过程称为复性这一过程称为复性;o对于热变性得对于热变性得DNA,DNA,在缓慢冷却得条件下可重在缓慢冷却得条件下可重新结合恢复双螺旋结构新结合恢复双螺旋结构,称为退火。称为退火。oDNADNA复性后复性后,一系列性质将得到恢复一系列性质将得到恢复,但就是但就是生物活性一般只能得到部分得恢复。生物活性一般只能得到部分得恢复。DNA得复性图示得复性图示2 2、DNADNA得复性条件得复性条件核酸浓度越高核酸浓度越高,随机碰撞得频率越高随机碰撞得频率越高,复性速度越复性速度越快。快。核酸分子越大核酸分子越大,链间错配频率越高链间错配频率越高,复性速度越慢。复性速度越慢。核酸链内重复序列多核酸链内重复序列多,易形成互补配对易形成互补配对,复性速度复性速度较快。较快。维持一定得溶液离子强度维持一定得溶液离子强度,消弱磷酸基静电斥力消弱磷酸基静电斥力,可加快复性速度。可加快复性速度。选择最佳得复性温度选择最佳得复性温度,温度太高会使核酸发生变性温度太高会使核酸发生变性,而温度过低会使错配得两链无法分开。而温度过低会使错配得两链无法分开。3 3、分子杂交、分子杂交o在变性得在变性得DNADNA溶液中加入外源溶液中加入外源DNADNA单链分子单链分子或或RNARNA单链分子单链分子(与原与原DNADNA具有同源性具有同源性),),去去掉变性条件后复性形成双螺旋结构得过程。掉变性条件后复性形成双螺旋结构得过程。o这样形成得新分子称为杂交这样形成得新分子称为杂交DNADNA分子。分子。分子杂交得种类分子杂交得种类lSouthern Blot:Southern Blot:DNA-DNADNA-DNA杂交杂交lNorthern Blot:DNA-RNANorthern Blot:DNA-RNA杂交杂交lWestern Blot:Western Blot:抗原抗原-抗体进行杂交抗体进行杂交l原位杂交原位杂交:活体组织上进行杂交活体组织上进行杂交,显出荧光显出荧光二、核酸得分离二、核酸得分离