色氨酸代谢产物对肝癌细胞.pptx

色氨酸代谢产物对肝癌细胞(2)自自Tayor等提出等提出IFN-IFN-对肿瘤生长得抑制对肿瘤生长得抑制作用就是其诱导色氨酸代谢所致得观点后作用就是其诱导色氨酸代谢所致得观点后,与色氨酸分解代谢有关得酶与色氨酸分解代谢有关得酶吲哚胺吲哚胺2,32,3双加氧酶双加氧酶(IDO)(IDO)和肿瘤得关系开始倍受关注。和肿瘤得关系开始倍受关注。近期得研究发现近期得研究发现,在不同类型得肿瘤中在不同类型得肿瘤中,IDO,IDO可以扮演完全不同得角色。可以扮演完全不同得角色。在急性髓细胞样白血病、黑色素瘤在急性髓细胞样白血病、黑色素瘤等肿瘤中等肿瘤中,IDO,IDO可以通过抑制可以通过抑制T T细胞细胞,从而从而促进肿瘤得生长促进肿瘤得生长;而在肝癌等肿瘤中而在肝癌等肿瘤中,IDO,IDO得存在可以提高机体得抗癌细胞作得存在可以提高机体得抗癌细胞作用用,目前这一作用得具体机制尚不十分目前这一作用得具体机制尚不十分清楚。清楚。(3)IDO就是色氨酸分解代谢得限速酶就是色氨酸分解代谢得限速酶,对色氨对色氨酸沿犬尿酸途径进行分解起到了重要作用。酸沿犬尿酸途径进行分解起到了重要作用。IDO IDO在多种组织中有表达在多种组织中有表达,在感染、肿瘤、在感染、肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病以及妊娠期间器官移植、自身免疫性疾病以及妊娠期间,IDO得活性增强得活性增强,加速色氨酸得分解。脂多糖加速色氨酸得分解。脂多糖(LPS)、IFN-IFN-等细胞因子能够诱导巨噬细胞、等细胞因子能够诱导巨噬细胞、树突状细胞等表达树突状细胞等表达IDO。IDO得分子式为:NH2ONH2OHOIDO为偏脂溶性物质为偏脂溶性物质,可溶解于可溶解于DMSO溶剂中。溶剂中。IDO催化反应如下催化反应如下:色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸IDON-甲酰尿氨酸甲酰尿氨酸 甲酰胺酶甲酰胺酶L-犬尿素犬尿素犬尿素犬尿素3-羟化酶羟化酶犬尿素酶犬尿素酶3-羟基犬尿酸羟基犬尿酸邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸犬尿素酶犬尿素酶非特异性羟化非特异性羟化 羟基氨基苯甲酸羟基氨基苯甲酸 氧化酶氧化酶喹啉酸喹啉酸二二 国内外研究现状国内外研究现状:IshioT等等在在体体外外培培养养实实验验中中发发现现,外外周周单单核核细细胞胞加加入入肝肝癌癌细细胞胞株株HepG2或或PLC/PRF/5共共同同培培养养后后,可可显显著著诱诱导导单单核核细细胞胞中中IDOmRNA得得表表达达。外外周周单单核核细细胞胞抗抗肝肝癌癌细细胞胞得得细细胞胞毒毒性性作作用用正正好好与与IDOmRNA得得表表达达水水平平成成正正比比,加加入入IDO得得抑抑制制剂剂1-甲甲基基色色氨氨酸酸(1-MT)后后可可以以降降低低细细胞胞毒毒性性作作用用。IDO阳阳性性得得肝肝细细胞胞癌癌病病人人在在肝肝切切除除术术后后,无无复复发发生存率高于生存率高于IDO阴性得患者。阴性得患者。二二 国内外研究现状国内外研究现状:Kai S等等证证明明IDO可可以以增增强强NK细细胞胞杀杀伤伤K562细细胞胞(慢慢性性髓髓性性白白血血病病细细胞胞系系)和和HepG2细细胞胞得得功功能能。给给与与1-MT可可以以降降低低老鼠老鼠NK细胞毒素得活性。细胞毒素得活性。二二 国内外研究现状国内外研究现状:Guido Guido Frumento Frumento 等等证证明明L-L-犬犬尿尿素素、邻邻吡吡啶啶甲甲酸酸和和喹喹啉啉酸酸等等色色氨氨酸酸代代谢谢产产物物可可以以抑抑制制某某些些淋淋巴巴细细胞胞得得增增殖殖。此此效效应应在在色色氨氨酸缺乏时更为明显。酸缺乏时更为明显。DariuszPawlak等发现喹啉酸在等发现喹啉酸在1000 M/L浓度水平上可以降低浓度水平上可以降低HepG2细胞细胞得活性。得活性。11大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流二二 国内外研究现状国内外研究现状:总之总之,IDO抗肝癌细胞得作用机制尚处抗肝癌细胞得作用机制尚处于摸索阶段于摸索阶段,还有许多值得研究得地方。本还有许多值得研究得地方。本课题将主要研究色氨酸在课题将主要研究色氨酸在IDO催化下分解催化下分解生成得几种代谢产物对肝癌细胞得生长和生成得几种代谢产物对肝癌细胞得生长和凋亡有何影响。凋亡有何影响。研究方案研究方案 一一 研究目得研究目得 观察色氨酸经观察色氨酸经IDO催化后分解生成得各催化后分解生成得各种代谢产物得量及其代谢产物对肝癌细胞种代谢产物得量及其代谢产物对肝癌细胞得生长及凋亡得影响得生长及凋亡得影响,为临床治疗肝癌提为临床治疗肝癌提供新思路。供新思路。二二 研究内容研究内容高效液相色谱法测定色氨酸代谢产物得量。高效液相色谱法测定色氨酸代谢产物得量。肝癌细胞得培养。肝癌细胞得培养。MTT法法测测定定代代谢谢产产物物对对HepG2细细胞胞得得增增值值得得抑抑制制作作用用及及色色氨氨酸酸缺缺乏乏对对这这一一作作用用得得影影响。响。流式细胞术观察代谢产物对肝癌细胞细胞流式细胞术观察代谢产物对肝癌细胞细胞周期得影响周期得影响。三三 拟解决得关键问题拟解决得关键问题1HepG2HepG2细胞得培养细胞得培养2从细胞水平来验证色氨酸得代谢产物对肝从细胞水平来验证色氨酸得代谢产物对肝癌细胞就是否有抑制增殖、周期阻滞、诱导凋癌细胞就是否有抑制增殖、周期阻滞、诱导凋亡得作用。亡得作用。3各代谢产物浓度范围及作用时间得选定均各代谢产物浓度范围及作用时间得选定均为本试验得技术关键为本试验得技术关键4利用高效液相色谱法对色氨酸得代谢产物利用高效液相色谱法对色氨酸得代谢产物进行定量分析进行定量分析 四四技术路线技术路线(第一步第一步)。HepG2细胞株细胞株体外培养体外培养细胞浓度达到细胞浓度达到104/ml分分0、1,1,10,100,1000 M/L浓度加入代谢产物浓度加入代谢产物12h,24h,36h,48h后分别检测后分别检测MTT法法HepG2细胞抑制率细胞抑制率统计学分析统计学分析四四技术路线技术路线(第二步第二步)。HepG2细胞株细胞株体外培养体外培养细胞浓度达到细胞浓度达到104/ml分分0、5,5,50,500,5000 M/L浓度加入浓度加入IDO12h,24h,36h,48h后分别检测后分别检测MTT法法HPLC法法HepG2细胞抑制率细胞抑制率各代谢产物得量各代谢产物得量统计学分析统计学分析、四四技术路线技术路线(第三步第三步)HepG2细胞株细胞株体外培养体外培养细胞浓度达到细胞浓度达到104/ml根据统计学分析结果加药根据统计学分析结果加药,作用一定时间作用一定时间离心沉淀后收集细胞调整细胞浓度为离心沉淀后收集细胞调整细胞浓度为5*106/ml流式细胞术流式细胞术细胞周期得变化细胞周期得变化分析结果分析结果六六实验方案实验方案 1 1 细胞培养细胞培养:HepG2细胞株在细胞株在DMEM培养液培养液中传代培养中传代培养。2 2 加药加药:将培养好得将培养好得HepG2细胞进行胰酶细胞进行胰酶消化消化,制成制成104/ml/ml单细胞悬液单细胞悬液,置于反应板内置于反应板内,同时加药同时加药 (1)选定三种代谢产物选定三种代谢产物(L-犬尿素、犬尿素、3-羟羟基犬尿酸、喹啉酸基犬尿酸、喹啉酸)进行试验。进行试验。色氨酸充足得条件下色氨酸充足得条件下(30 M/L),将每种代将每种代谢产物分谢产物分(0、1,1,10,100,1000 M/L)5个浓度个浓度梯度梯度,(12h,(12h,24h,36h,48h)4个反应时间个反应时间,用用MTT法法测细胞抑制率。绘制时间关系曲线。测细胞抑制率。绘制时间关系曲线。另设色氨酸空白组为对照组另设色氨酸空白组为对照组(2)色氨酸充足得条件下色氨酸充足得条件下(30 M/L)加入加入IDO,分分(0、5,5,50,500,5000 M/L)5个浓度梯度个浓度梯度(12h,(12h,24h,36h,48h)4个反应时间个反应时间,测细胞抑测细胞抑制率。制率。并用高效液相色谱法并用高效液相色谱法(HPLC)测出三测出三种代谢产物种代谢产物(L-犬尿素、犬尿素、3-羟基犬尿酸、喹羟基犬尿酸、喹啉酸啉酸)生成得量。生成得量。3流式细胞术测定细胞周期流式细胞术测定细胞周期:选取某选取某个代谢产物最佳反应浓度和反应时间个代谢产物最佳反应浓度和反应时间离心收集细胞离心收集细胞,然后调整细胞为然后调整细胞为5106/ml,处理后处理后24h内上机分析。内上机分析。4统计学分析统计学分析:统计描述统计描述:均数均数标准标准差表示差表示,析因设计得方差分析析因设计得方差分析,样本之样本之间比较用间比较用SNK-Q检验和检验和t检验检验,P0,P0、0505有统计学意义。数据分析采用有统计学意义。数据分析采用SPSS11、0软件。软件。本课题得创新之处本课题得创新之处 首次将色氨酸在首次将色氨酸在IDOIDO得催化下得催化下分解生成得代谢产物单独作用于分解生成得代谢产物单独作用于HepG2肝癌肝癌细胞株细胞株,探讨探讨IDO抗肝癌抗肝癌细胞得作用机理细胞得作用机理,进一步研究其对肝进一步研究其对肝癌得潜在治疗价值癌得潜在治疗价值,并借此寻找肝癌并借此寻找肝癌治疗得新途径。治疗得新途径。研究计划及预测进展研究计划及预测进展 2007年年3月月底底之之前前:在在导导师师得得指指导导下下,查查阅阅国国内内外外文文献献资资料料,反反复复论论证证该该课课题题得得可可行行性性、科科学学性性、创新性创新性;全面了解及掌握所需要得试剂等。全面了解及掌握所需要得试剂等。2007年年4月月开开始始进进行行预预实实验验,及及时时解解决决碰碰到到得得具体问题具体问题,并撰写综述。并撰写综述。2007年年6月后开始正式实验月后开始正式实验,做好实验纪录。做好实验纪录。2007年年10月争取完成实验。月争取完成实验。2007年年11月后整理实验纪录月后整理实验纪录,做统计学处理做统计学处理,撰写科研论文。撰写科研论文。预期研究成果预期研究成果 预计试验结果为色氨酸代谢产物对预计试验结果为色氨酸代谢产物对HepG2细胞有抑制增殖细胞有抑制增殖,调节细胞周调节细胞周期得作用期得作用,该作用随药物浓度和时间得该作用随药物浓度和时间得增加而增强。色氨酸代谢产物有诱导增加而增强。色氨酸代谢产物有诱导细胞凋亡得作用。色氨酸代谢产物在细胞凋亡得作用。色氨酸代谢产物在肝癌治疗上有潜在价值。肝癌治疗上有潜在价值。在充分得理论在充分得理论,成熟得实验条件成熟得实验条件,认认真仔细得工作之后真仔细得工作之后,相信能得到满意得结相信能得到满意得结果。即使结果可能不尽人意果。即使结果可能不尽人意,也会给以后也会给以后得研究工作以宝贵得启示。得研究工作以宝贵得启示。研究基础研究基础 一一学术条件学术条件:我我院院消消化化科科有有自自己己得得实实验验室室及及科科研研经经验丰富得博士生和硕士生导师进行指导。验丰富得博士生和硕士生导师进行指导。上上几几届届研研究究生生和和导导师师王王琦琦教教授授在在肝肝癌癌有有关关方方面面作作了了大大量量得得基基础础性性研研究究工工作作,积积累累了丰富得理论知识和实践经验。了丰富得理论知识和实践经验。二二实验条件实验条件我院实验室和山西医科大学实验室具备我院实验室和山西医科大学实验室具备专业得技术人员和所需得各种仪器设备专业得技术人员和所需得各种仪器设备,具具有多年得细胞培养经验有多年得细胞培养经验,色谱法、色谱法、MTT法、法、流式细胞术均已成熟流式细胞术均已成熟,可以确保实验顺利完可以确保实验顺利完成。成。三三 所需经费已基本落实。所需经费已基本落实。