环氧乙烷残留量气相色谱法分析-PPT.ppt

环氧乙烷残留量气相色谱法分析2环氧乙烷1345气相色谱的基本概念气相色谱的结构EO的测试气相色谱的维护6其他测试2理化性质：理化性质：最简单的环醚最简单的环醚 无色气体无色气体 沸点：沸点：10.4 易爆，易挥发，有醚味。易爆，易挥发，有醚味。1.1 环氧乙烷的综述环氧乙烷对人体的危害环氧乙烷对人体的危害（1）急、慢性毒性）急、慢性毒性（2）三致作用及生殖毒性）三致作用及生殖毒性（3）急性中毒与局部刺激）急性中毒与局部刺激（4）神经系统损害与慢性毒性）神经系统损害与慢性毒性（5）致癌作用）致癌作用（6）生殖毒性）生殖毒性灭菌：灭菌：EO具有顽强的扩散和穿透能力，对具有顽强的扩散和穿透能力，对细菌芽孢、真菌和病毒等各种微生物均细菌芽孢、真菌和病毒等各种微生物均有灭杀作用，属于广谱灭菌剂。有灭杀作用，属于广谱灭菌剂。机理：烷基化反应31.1 环氧乙烷的综述残留物：1.EO Ethylene Oxide 环氧乙烷 2.ECH ethylene chlorohydrin 氯乙醇3.EG Ethylene Glycol 乙二醇 一种刺激体表、具有急性毒性，并且在中毒剂量通过皮肤快速吸收的易燃性液体。轻微的致突变性，具有产生胎儿毒性的潜能。动物致癌试验：阴性ISO10993-7:2008 附录附录I EG无遗传毒性，未显示任何潜在的致癌性 多数材料中EO转化为EG不明显，且EG允许限量明显高于EO、ECH 棉花、胶原4 参照标准：参照标准：ISO10993-7:2008 医疗器械环氧乙烷的接触量限度1.2 环氧乙烷限量51.3 环氧乙烷分析方法比色分析法 环氧乙烷在酸性条件下水解生成乙二醇，乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛，环氧乙烷在酸性条件下水解生成乙二醇，乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛，甲醛与品红亚硫酸试液反应生成产生紫红色化合物，通过比色分析法可求甲醛与品红亚硫酸试液反应生成产生紫红色化合物，通过比色分析法可求得环氧乙烷含量。得环氧乙烷含量。气相色谱法在一定温度下，用萃取剂萃取样品中所含环氧乙烷（在一定温度下，用萃取剂萃取样品中所含环氧乙烷（EO），用顶空），用顶空气相色谱法测定环氧乙烷含量。气相色谱法测定环氧乙烷含量。6大家学习辛苦了，还是要坚持大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静继续保持安静7 1.4 环氧乙烷-浸提方法浸提方法模拟使用浸提模拟使用浸提极限浸提极限浸提定义：用水浸提来模拟产品使用，通过评价患者或使用者在日常使用器械中所接触到的残留物水平。a)浸提介质：水 b)浸提温度：整个或部分与人体接触的器械在37浸提，不直接与人体接触的器械在（252）浸提；c)浸提时间：应考虑在推荐或预期使用最为严格的时间条件下进行，但不短于1h；d)浸渍表面：器械与药液或血液接触的表面。短期接触 长期接触定义：随后的浸提至浸提液中EO或ECH的量小于首次浸提液中10%检出量的浸提，或浸提到测得的累积残留量无显著性增加。持久接触包括热极限浸提法和溶剂极限浸提法8通过分析有代表性的通过分析有代表性的“最坏情况最坏情况”，经动力学研究来掌握一族相似的产品。，经动力学研究来掌握一族相似的产品。1.5 影响环氧乙烷残留量的因素温度、装载密度和排列、气流、时间温度、装载密度和排列、气流、时间涤纶、聚碳酸酯吸附量大涤纶、聚碳酸酯吸附量大包装材料、包装密度、运输包装材料、包装密度、运输容器的密度容器的密度浓度、作用时间、温度、循环类型、湿浓度、作用时间、温度、循环类型、湿度、抽真空度与换气次数、产品密度度、抽真空度与换气次数、产品密度。组合包：组合包：选择残留量最大的作为选择残留量最大的作为代表代表如：导管、纱布、吸液如：导管、纱布、吸液材料、手术衣袖口材料、手术衣袖口91.5 影响环氧乙烷残留量的因素组合包：组合包：手术衣袖口手术衣袖口10分配系数分配系数 在一定温度下，组分在两相间分在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（配达到平衡时的浓度（g/mL）比，用比，用K 表示表示分配比分配比 k：质量比，又叫容量因子或容量比质量比，又叫容量因子或容量比分分配配系系数数与与分分配配比比都都是是与与组组分分及及固固定定相相的的热热力力学学性性质质有有关关的的常常数数，随随分分离离柱柱温温度度、柱柱压压的的改改变变而变化。而变化。分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。2.1 色谱的基本概念-分配系数112.1色谱的基本概念-分配系数分配比与分配系数的关系分配比与分配系数的关系 式式中中为为相相比比，流流动动相相体体积积Vm 与与固定相体积固定相体积VS之比之比分配比分配比k 与保留时间与保留时间tR的关系的关系 k的实验求解的实验求解122.2 色谱的基本概念1.1.基线基线 无无试试样样通通过过检检测测器器时时，检检测测到到的信号即为基线。的信号即为基线。2.2.保留值：时间或体积保留值：时间或体积 保留时间（保留时间（tR）：）：组分从进样组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需到柱后出现浓度极大值时所需的时间；的时间；死时间（死时间（tM）：）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间调整保留时间（调整保留时间（tR）：）：tR=tRtM 132.2 色谱的基本概念3.3.相对保留值相对保留值r21组分组分2与组分与组分1调整保留值之比：调整保留值之比：r21=tR2 /tR1=VR2/VR1相相对对保保留留值值只只与与柱柱温温和和固固定定相相性性质质有有关关，与与其其他他色色谱谱操操作作条条件件无无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。r21=tR2/tR1=K2/K1k1/k2142.2 色谱的基本概念色谱峰为高斯色谱峰为高斯正态分布时，色谱流出曲线为：正态分布时，色谱流出曲线为：用来衡量色谱峰区域宽度的参数，有三种表示方法：用来衡量色谱峰区域宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差）标准偏差()：即即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度色谱峰高一半处的宽度 Y1/2=2.354 （3）峰底宽）峰底宽(Y)：Y=4 色谱柱效参数色谱柱效参数色谱柱效参数色谱柱效参数152.3 色谱的基本概念-理论两种色谱理论两种色谱理论u 塔板理论塔板理论热力学因素热力学因素u 速率理论速率理论动力学因素动力学因素 塔板理论的假设：塔板理论的假设：(1)在在每每一一个个塔塔板板上上，可可以以迅迅速速建建立立分分配平衡配平衡 (2)(2)将流动相看作成脉动（间歇）过程；将流动相看作成脉动（间歇）过程；(3)(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 (4)(4)每次分配的分配系数相同。每次分配的分配系数相同。162.3 色谱的基本概念-塔板理论 色谱柱长：色谱柱长：L，塔板高度：塔板高度：H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：则三者的关系为：n=L/H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：组分在tM时间内不参与柱内分配，需引入有效塔板数有效塔板数和有效塔板高度有效塔板高度：Y柱效参数：柱效参数：柱效参数：柱效参数：单单位位柱柱长长的的塔塔板板数数越越多多，表表明明柱柱效效越越高高Y172.3 色谱的基本概念-塔板理论 (1)提出了计算和评价色谱柱效的参数和方法提出了计算和评价色谱柱效的参数和方法 (2)2)柱柱效效不不能能表表示示被被分分离离组组分分的的实实际际分分离离效效果果，当当两两组组分分的的分分配配系系数数K K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(3 3)无无法法解解释释同同一一色色谱谱柱柱在在不不同同的的载载气气流流速速下下柱柱效效不不同同的的实实验验结结果果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。塔板理论的特点和不足塔板理论的特点和不足182.4 色谱的基本概念-速率理论速率理论用用速速率率方方程程重重新新定定义义塔塔板板高高度度，并并提提出出影影响响柱柱效效的的动动力力学学因因素素：涡涡流流扩扩散、分子扩散、传质阻力散、分子扩散、传质阻力速率方程（也称范速率方程（也称范.弟姆特方程式）弟姆特方程式）H=A+B/u+Cu H：理论塔板高度，：理论塔板高度，u：载气的线速度：载气的线速度(cm/s)A 涡流扩散项涡流扩散项B/u 分子扩散项分子扩散项Cu 传质阻力项传质阻力项192.4 色谱的基本概念-速率理论速率理论涡流扩散项涡流扩散项 A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子固固定定相相颗颗粒粒越越小小dp，填填充充的的越越均均匀匀，A，H，柱柱效效n，色色谱谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。202.4 色谱的基本概念-速率理论速率理论分子扩散项分子扩散项 B=2Dg ：弯曲因子，弯曲因子，Dg：组分在气相中的扩散系数（：组分在气相中的扩散系数（cm2s-1）与与组组分分性性质质、流流速速、滞滞留留时时间间、流流动相性质、柱温等因素有关动相性质、柱温等因素有关 21传质阻力项传质阻力项2.4 色谱的基本概念-速率理论速率理论 k为容量因子；为容量因子；Dg、DL为扩散系数。为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。流动相传质阻力流动相传质阻力Cg固定传质阻力固定传质阻力CL C=（Cg+CL）222.5 色谱的基本概念-分离度 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。邻两组份能够被完全分离。难难分分离离物物质质对对的的分分离离度度大大小小受受色色谱谱过过程程中中两两种种因因素素的的综综合合影影响响：保保留留值值之之差差色色谱谱过程的热力学因素；过程的热力学因素；区域宽度区域宽度色谱过程的动力学因素。色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：色谱分离中的四种情况如图所示：柱效高，柱效高，K(分配系数分配系数)较大较大,完全分离；完全分离；K不是很大，峰较窄，柱效高，基本分离不是很大，峰较窄，柱效高，基本分离 峰宽，柱效较低，峰宽，柱效较低，K较大较大,但分离的不好；但分离的不好；K小，小，柱效低，分离效果更差。柱效低，分离效果更差。232.5 色谱的基本概念-分离度分离度的表达式分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度：分离程度98%；R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。（相邻两峰完全分离的标准）。242.5 色谱的基本概念-分离度影响分离度的因素：22114kknR+-=aan 理论塔板数理论塔板数n 增加柱效增加柱效，可提高分离度，可提高分离度n r21 （或（或选择因子选择因子）增大增大r21是提高分离度的最有效方法，是提高分离度的最有效方法，n 容量因子，分配比容量因子，分配比柱选择项柱选择项柱选择项柱选择项柱容量项柱容量项柱容量项柱容量项柱效项柱效项柱效项柱效项252.5 色谱的基本概念-分离度k k 影响峰位影响峰位影响峰位影响峰位n n 影响峰宽窄影响峰宽窄影响峰宽窄影响峰宽窄 影响两峰间距影响两峰间距影响两峰间距影响两峰间距262.6 色谱的基本概念-分离条件的优化载气及其流速载气及其流速H=A+B/u+Cu，最佳流速最佳流速uopt(B/C)1/2柱温柱温 柱温柱温，分离度，分离度，分析时间，分析时间，综合考虑，综合考虑 复杂，沸程宽的试样，采用程序升温复杂，沸程宽的试样，采用程序升温柱长和柱内径柱长和柱内径 满足分离目的的前提下，尽可能选用较满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱短的柱 载体载体 粒度影响柱效粒度影响柱效进样方式和进样量进样方式和进样量 272.7 色谱的基本概念用回收率表示，至少3个浓度点9个结果。一般认为：色谱图上平直基线部分的噪声峰高RN，3倍RN对应的量就是检出限。基线漂移在最初基线的5%以内至少5个浓度点，最小相关性宜为0.95（ISO10993-2008）要求0.99以上。283.1 气相色谱-结构n 气气相相色色谱谱法法系系采采用用气气体体为为流流动动相相（载载气气）流流经经装装有有填填充充剂剂的的色色谱谱柱柱进进行行分分离离测测定定的的色色谱谱方方法法。物物质质或或其其衍衍生生物物气气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。采用溶液直接进样时，进样口温度应高于柱温30 50柱温箱稳定性要求:1，波动0.1/h火焰离子化检测器（FID）：痕量有机物痕量有机物热导检测器（TCD）：水、气体混合物的分析 电子捕获检测器（ECD）：含卤素的化合物 NPD、FPD、MS检测器温度一般应高于柱温，并不低于150，以免水汽凝结，通常为250350。色谱柱:填充柱或毛细管柱。（230老化5h）载气系统包括气源、气体净化、气体流速控和测量 5 5个个9 9隔垫 衬管293.2 气相色谱-操作毛细管进样系统：InertCap624 0.32mmx30mx3.00m上海舜宇GC1120304.1 气相色谱法-定量法 归一法归一法适用于试样中各组分都能流出色谱柱，并在色谱图上显示色谱峰。全部出峰全部出峰外标法外标法精密量取对照品，配制成溶液，注入仪器，记录色谱图对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：Cx=CRAx/AR自动进样自动进样内标法内标法精密取对照品和内标物质，分别配制成溶液，精密取各溶液配成校正因子测定的对照溶液，测量对照品和内标物质的峰面积或者峰高，按下式计算校正因子：（f）=AsCR/ARCs再取各项中含有内标物质的供试品溶液，测量峰面积。按下式计算含量：Cx=fAxCs/As例子：EO、ECH例子：乙醇（正丙醇）甲醇（正丁醇）EO（氧化丙烯）内标物内标物4个注意点：个注意点：相近相似；相近相似；试样中不存在内试样中不存在内标物，且完全分离；标物，且完全分离；纯物质或已知含量；纯物质或已知含量；互溶，互溶，不可逆不可逆不能全部出不能全部出峰峰31标准贮备液标准贮备液测试样品测试样品绘标准曲线绘标准曲线参考标准：参考标准：ISO 10993-7-2008、GB/T 14233.1-2008 4.2 EO的测试计算结果计算结果324.3 标准曲线-EO1 1、标准储备液的配制、标准储备液的配制取外部干燥的50mL容量瓶，加入30mL水，称重，记a；用冷却的注射器加入0.2mL环氧乙烷，轻轻摇晃后，盖好瓶盖，称重，记b。前后质量差即为溶液中所含环氧乙烷的质量，加水至刻度线，配成储备液，该浓度为C1=（b-a）*CEO*103/50 mg/mL。2 2、稀释、稀释1010倍为倍为C C2 2后配置成标样点后配置成标样点3 3、加热、加热每个标样取5mL液体，于60下加入40min4 4、测试并、测试并绘标准曲线绘标准曲线5 5、举例、举例a=61.6839 gb=61.8183 gC1=(61.8183-61.6839)x99.5%x103/50=2.67456 mg/mL =2674.56 g/mL稀释10倍，C2=267.456 g/mL取8个100mL容量瓶，配置标样点：334.4标准曲线-EO344.4 测试样品1、制样将样品透析包装打开，选取易于拆卸、剪取及不易环氧乙烷解析部位，将样品剪成 5mm 碎块，取 1.00g，置于20mL 顶空瓶，加水5.0mL，密封。注意：a、做好准备工作b、组合包中每款产品都检，以“结果最坏的”作为组合包的测试结果c、稀释合适的倍数2、加热 样品于60下浸提40min（极限浸提法）3、测试4、记录导入校准表，查看结果热极限浸提法热极限浸提法35绝对含量绝对含量 WEO=5cm1/m 10-3 （mg）m1-单位产品质量；m 称样量 相对含量相对含量 CEO=5c/m（g/g）4.4 测试样品364.4 样品的处理1 1、样品的保存、样品的保存注：验证时，“空白样品”374.4 样品的处理2 2、顶空瓶的处理、顶空瓶的处理 测试完的顶空瓶，剪开瓶盖，倒出样品，在自来水下冲洗后，放在盆中，加入肥皂水，于通风橱下浸泡1-2天；捞出清洗干净，在120下干燥2-3h。注：验证时，“空白样品”38五、气相色谱-维护a a、新的柱子、新的柱子主要目的：去除键和不够稳定的固定相，让新柱主要目的：去除键和不够稳定的固定相，让新柱子性能更稳定。子性能更稳定。b b、多次测试的柱子或测了残留大样品、多次测试的柱子或测了残留大样品的柱子的柱子主要目的：去残留主要目的：去残留T老化老化=（T方法方法Max+T耐受耐受Max）/2老化的第一个重点：老化的最高温度老化的第一个重点：老化的最高温度极性强、膜厚大的柱子通常耐受温度比较低，老极性强、膜厚大的柱子通常耐受温度比较低，老化前，需仔细查阅色谱柱包装盒或说明书。化前，需仔细查阅色谱柱包装盒或说明书。5.1 气相色谱-维护-色谱柱的老化色谱柱的老化395.1 气相色谱-维护-色谱柱的老化色谱柱的老化老化失败最常见的原因老化失败最常见的原因a a、氧气的存在、氧气的存在高温下氧气是破坏化学键的好手，而色谱柱里的固定相一旦高温下氧气是破坏化学键的好手，而色谱柱里的固定相一旦破坏，彼此间的键键链会破坏，固定相不能再破坏，彼此间的键键链会破坏，固定相不能再“稳定稳定”固定固定在色谱柱中，造成大量柱流失，柱效大幅下降。在色谱柱中，造成大量柱流失，柱效大幅下降。处理：处理：1、把色谱柱末端伸入溶剂中，观察是否有连续、把色谱柱末端伸入溶剂中，观察是否有连续的泡沫（查漏）的泡沫（查漏）2、升温前，先通、升温前，先通15min氮气氮气3、确保其它接头，正确安装、确保其它接头，正确安装c c、已使用过的柱子、已使用过的柱子先分析样品成分，若是在老化温度下也不能被完全气化的先分析样品成分，若是在老化温度下也不能被完全气化的成分，如蛋白质、胶状物，在老化前，应先进行色谱柱的成分，如蛋白质、胶状物，在老化前，应先进行色谱柱的维护维护换衬管、色谱柱柱头切割换衬管、色谱柱柱头切割b b、新柱子老化，最好不接检测器、新柱子老化，最好不接检测器FID检测器：可不连检测器、不点火、检测器：可不连检测器、不点火、不开空气和氢气不开空气和氢气40 5.2 气相色谱-维护3.4.1 3.4.1 气体气体FID：氢气为燃气，空气为助燃气纯度 填充柱：99.99%氮气作为载体 毛细管分析：99.999%氮气作为载气 氢气：安全原因 氦气：灵敏度高，基线噪声非常小，成本过高定期检查去除来自空气压缩机的空气水分的硅胶和除去有机物的分子筛等极性强的毛细管柱耐氧化性差，容易因氧化等而变化，因此，尽量装配氧气捕集器除氧。氧气捕集器须定期用氢还原进行再生。来自空气压缩机的空气不是经常流量一定，流量变动会影响基线，因此，在流路途中增加硅胶管和用于控制流量的波纹管阀，使流量稳定。3.4.2 3.4.2 柱柱柱的使用温度尽量比柱的耐热温度低 除去载气中的氧（特别是使用极性柱时）使用高纯度气体；气瓶更换时不要混入空气 氧气捕集器装在GC前不要使难挥发的成分进入柱内充分做好试样的预处理 使用柱衬管和石英棉 安短的一次性使用的前置柱3.4.3 FID3.4.3 FID检测器检测器柱子老化时，不要把柱子与检测器连接，以免检测器被污染，上海舜宇GC1120的色谱柱最高温度为230。各操作温度未平衡之前将氢气及空气源关闭，以防止检测器内积水。点火时，不要使按钮按下时的时间过长，以免损坏点火圈。仪器开机后，应先通过载气再升温，待FID检测器温度超过100时方能点火。416.1 其他-酒精的测试 1.比重法 适用于仅含乙醇和水的溶液原理：酒精比重计放入样品溶液中，比重计下按放手，当其上浮静止且溶液无气泡时，读取液面处刻度，即为乙醇含量。3.比色法-紫外-可见分光光度法 参考标准：中国药典2015版（第三部）P462 3201乙醇残留量测定法原理：乙醇在饱和碳酸钠溶液中加热逸出，被重铬酸钾-硫酸溶液吸收后呈黄绿色至绿色，用比色法测定血液制品中乙醇残留量。波长波长650nm4.气相色谱法（毛细管柱法 加校正因子内标法）参考标准：中国药典2010版 附录 M；GB 26373-2010乙醇消毒剂卫生标准 附录A柱温：程序升温，50保持7 分钟，然后以每分钟10的速率升温至110；进样口温度：190；检测器（FID）：温度220；分流进样；载气：N2。内标物质：正丙醇 理论板数按正丙醇峰计算应不低于8000，乙醇和正丙醇两峰的分离度应大于2.0。2.蒸馏法426.2 其他-甲醇的测试1.1.变色酸比色法变色酸比色法 原理：甲醇在磷酸溶液中，被高锰酸钾氧化成甲醛，用偏重亚硫酸钠除去过量的高锰酸钾，甲醛与变色酸在浓硫酸存在下，先缩合，随之氧化，生成对醌结构的蓝紫色化合物，与标准系列比较定量。分光光度计 波长570nm2.2.品红品红-亚硫酸比色法亚硫酸比色法 波长595nm3.3.气相色谱法气相色谱法（毛细管柱法（毛细管柱法 加校正因子内标法）加校正因子内标法）PEG交联石英毛细管柱柱温：程序升温，70保持3分钟，然后以每分钟5的速率升温至100；进样口温度：200；检测器（FID）：温度200；分流比20:1100:1；N2：0.5mL/min；氢气30mL/min；空气300mL/min。内标物质：正丁醇GB/T 394.2-2008 GB/T 394.2-2008 酒精通用分析方法酒精通用分析方法43