DB37∕T 3676-2019 种猪场伪狂犬病净化技术规范(山东省).pdf

ICS 65.020.30 B 41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 36762019 种猪场伪狂犬病净化技术规范 Technical Regulation of Eradication of Pseudorabies in Swine BreedingFarms 2019 - 08 - 30 发布 2019 - 09 - 30 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 36762019 I 目 次 前言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 检测方法 . 2 4.1 仪器 . 2 4.2 耗材 . 2 4.3 试剂 . 2 4.4 核酸检测 . 2 4.5 血清学检测 . 2 5 净化群的建立 . 3 5.1 净化策略 . 3 5.2 感染状况普查阶段 . 3 5.3 强化免疫阶段 . 3 5.4 检测与淘汰阶段 . 4 5.5 强制净化阶段 . 4 5.6 假定健康阶段 . 4 5.7 净化场的评估阶段 . 4 6 净化场的维持阶段 . 4 6.1 免疫 . 5 6.2 监测 . 5 6.3 引种检疫 . 5 6.4 生产记录不佳的种猪检测 . 5 7 综合生物安全措施 . 5 7.1 合理的猪场选址 . 5 7.2 生产模式 . 5 7.3 饲养管理 . 5 7.4 消毒措施 . 5 7.5 无害化处理措施 . 6 7.6 有害生物防治措施 . 6 7.7 其它生物安全措施 . 6 7.8 档案管理 . 6 附 录 A （资料性附录） 猪伪狂犬病免疫无疫评估实验室检测方法及抽样要求 . 7 附 录 B （资料性附录） 猪伪狂犬病净化评估实验室检测方法及抽样要求 . 8 DB37/T 36762019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 山东省动物疫病预防与控制中心、 山东省畜牧总站、 山东汇众兽医科技服务公司。 本标准主要起草人：李云岗、张栋、张月、周开锋、楚遵峰、汪洋、王士荣、王敏、曹振山、刘波。 DB37/T 36762019 1 种猪场伪狂犬病净化技术规范 1 范围 本标准规定了种猪场猪伪狂犬病净化的检测方法、 净化群的建立、 净化场的维持及综合生物安全措施。 本标准适用于种猪场猪伪狂犬病净化。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 17823 集约化猪场防疫基本要求 GB/T 17824.2 规模猪场生产技术规程 GB/T 18641 伪狂犬病诊断技术 GB/T 35911 伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法 NY/T 1168 畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T 1568 标准化规模养猪场建设规范 DB37/T 2384 种猪场消毒技术规范 病死及病害动物无害化处理技术规范 农医发201725号 跨省调运乳用种用动物产地检疫规程 农牧发20192号 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 伪狂犬病 Pseudorabies 伪狂犬病是由疱疹病毒科疱疹病毒型伪狂犬病毒（PRV）引起的猪及多种家畜和野生动物的传染病。 3.2 净化 eradication 对种猪场采取一系列措施，达到消灭和清除猪伪狂犬病的过程。在某一限定的种猪场内，根据猪伪狂犬病的监测结果，及时发现并淘汰感染猪只，使种猪群中猪伪狂犬病逐渐被清除的疫病控制方法。 3.3 猪伪狂犬gE基因缺失疫苗 Pseudorabies gEgene-deleted vaccine 利用猪伪狂犬gE基因缺失病毒株所制成的疫苗。 DB37/T 36762019 2 4 检测方法 4.1 仪器 4.1.1 荧光 PCR 检测仪。 4.1.2 PCR 仪和凝胶成像系统（根据实验室条件选择，替换 4.1.1）。 4.1.3 高速台式冷冻离心机：可控温至 4 、离心速度可达 12 000 r/min 以上。 4.1.4 组织研磨器或者研钵。 4.1.5 普通冰箱。 4.1.6 微量移液器：0.2 L2 L，1 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，100 L1 000 L。 4.1.7 酶标仪。 4.1.8 恒温箱。 4.1.9 高压灭菌锅。 4.2 耗材 4.2.1 1.5 mL 离心管。 4.2.2 0.2 mLPCR 薄壁管。 4.2.3 酶标板,移液器吸头。 4.3 试剂 4.3.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 4.3.2 商品化 DNA 抽提试剂，于 4 保存。 4.3.3 无水乙醇，-20 预冷。 4.3.4 75 %乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20 预冷。 4.3.5 含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 10 mmol/L，-20 保存，避免反复冻融。 4.3.6 普通 PCR 引物参照 GB/T 18641。 4.3.7 荧光 PCR 引物和探针参照 GB/T 35911。 4.3.8 酶标检测试剂 等效采用 PRV-gE 基因缺失疫苗配套的商品化鉴别检测试剂。 4.4 核酸检测 活猪采集扁桃体或全血， 病死猪或流产胎儿采集大脑、 扁桃体、 淋巴结、 肺脏等组织。 依据GB/T 18641或GB/T 35911，使用PCR方法，检测组织中的猪伪狂犬病病毒核酸。 4.5 血清学检测 4.5.1 猪伪狂犬病病毒 gB（PRV-gB）抗体检测 采集猪血， 分离血清。 采用商品化ELISA试剂盒， 检测猪血清中的PRV-gB 抗体， 评估免疫抗体水平。 4.5.2 猪伪狂犬病病毒 gE（PRV-gE）特异性抗体检测 采集猪血，分离血清。采用商品化ELISA试剂盒，检测猪血清中的PRV-gE特异性抗体，评估野毒感染状态。 4.5.3 合格免疫抗体判定标准 DB37/T 36762019 3 4.5.3.1 个体免疫抗体合格标准，PRV-gB 抗体按所选取的试剂盒判定标准执行。 4.5.3.2 群体免疫抗体合格标准，群体 PRV-gB 抗体阳性率不低于 90 %。 5 净化群的建立 5.1 净化策略 5.1.1 采用 gE 基因缺失疫苗免疫、野毒鉴别诊断技术淘汰阳性感染猪的策略。 5.1.2 适时淘汰生产成绩差的母猪。做好引种监测，每年引进的公猪和后备猪应为全阴性。 5.1.3 综合生物安全措施保障到位。 5.2 感染状况普查阶段 5.2.1 采样技术 前腔静脉或扁桃体采样，并及时对血样或组织样品规范保存、送检。采血过程及制样过程要防止污染并规范标记。 5.2.2 抽样数量 抽样要求和数量参照附录A中表A.1和表A.2进行。置信度95 %，预期流行率5 %。根据野毒抗体阳性率高低，确定具体净化方案。 5.2.3 净化方案的确定 5.2.3.1 血清样品 PRV-gE 抗体阳性率不超过 10 %，实行检测淘汰-监测与认证维持的净化方案。 5.2.3.2 血清样品 PRV-gE 抗体阳性率在 10 %20 %，实行强化免疫-检测淘汰-补充阴性后备猪-监测与认证维持的分步净化方案。 5.2.3.3 血清样品 PRV-gE 抗体阳性率大于 20 %，该猪群不具备净化条件。 5.3 强化免疫阶段 5.3.1 疫苗 5.3.1.1 PRV-gE 基因缺失活疫苗，免疫原性好。 5.3.1.2 有配套的 PRV 野毒感染鉴别诊断试剂。 5.3.2 免疫程序 5.3.2.1 根据疫苗免疫后抗体跟踪检测情况确定合理的免疫程序。 5.3.2.2 种猪，种母猪和公猪每年普免 2 次3 次，避免在分娩前 7 d 内接种。 5.3.2.3 后备猪群，后备猪配种前 8W1 次活疫苗免疫 ；以后按生产种猪的免疫程序进行免疫。 5.3.2.4 仔猪，1 d2 d 日龄滴鼻免疫。45 d 活疫苗加强免疫。 5.3.3 检测评估 免疫后3W检测gB抗体和gE抗体。当gE抗体阴性时，如果90 %的样品gB抗体阳性，即可认为群体免疫合格。 5.3.4 临床评估 DB37/T 36762019 4 通过强化免疫后，猪群应无猪伪狂犬病的临床症状。 5.4 检测与淘汰阶段 5.4.1 隔离淘汰 每半年进行一次血清学检查，全群采样。阴、阳性猪分群饲养。逐步淘汰和缩小阳性猪群。加强阴性群的隔离与监测，最后建立完全健康的gE阴性猪群。 5.4.2 种猪群的检测与淘汰 当种猪群样品的伪狂犬病野毒感染抗体（gE抗体）阳性率在10 %以下时，如gE抗体阳性，应直接淘汰；对可疑样品再次检测，也可在10 d14 d后再抽样复核，如仍为可疑，应直接淘汰。 5.4.3 后备种猪的检测与淘汰 对拟选留的后备种猪，可分别在5月龄（或进入后备舍）和配种前1个月检测gE抗体，如为阴性，即可作为种猪使用；gE抗体阳性或两次可疑，应淘汰处理。 5.5 强制净化阶段 5.5.1 对全群猪只进行检测，剔除全部阳性猪只。 5.5.2 在最后 1 头阳性猪淘汰 1 个月后， 对种公猪按 100 %比例、 母猪按 10 %比例采血， 再次进行 PRV-gE 特异性抗体检测。 5.5.3 如抽检种猪群PRV-gE抗体全部阴性且群体90 %的样品为gB抗体阳性可视为假定猪伪狂阴性群。 5.6 假定健康阶段 在最后1头阳性猪淘汰后1年内，种猪群PRV-gE抗体阴性；生产成绩正常稳定。猪群则进入假定健康阶段。 5.7 净化场的评估阶段 5.7.1 评估时间 在进入“假定健康阶段”后，按照免疫无疫标准、净化标准进行净化场评估。 5.7.2 免疫无疫标准 5.7.2.1 生产母猪和后备种猪抽检,猪伪狂犬病病毒 gB 抗体阳性率不低于 90 %。 5.7.2.2 种公猪、生产母猪和后备种猪抽检，猪伪狂犬病病毒 gE 抗体检测均为阴性。 5.7.2.3 连续两年以上无临床病例。 5.7.3 净化标准 5.7.3.1 种公猪、生产母猪和后备种猪抽检，猪伪狂犬病病毒 gE 抗体检测均为阴性。 5.7.3.2 停止免疫两年以上,无临床病例。 5.7.4 评估抽样 评估专家小组负责设计抽样方案并监督抽样。 样本方案和检测方法参照附录A、 附录B。 置信度95 %，预期流行率3 %。 DB37/T 36762019 5 6 净化场的维持阶段 6.1 免疫 种猪场要制定并实施合理的免疫程序， 选用合格的猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗， 按照免疫程序进行免疫接种。 6.2 监测 6.2.1 种猪群检测 每年对阴性种猪群，监测PRV-gE抗体。抽样比例参考表A.1。置信度95 %，预期流行率3 %。保证基础群、后备群维持阴性状态。 6.2.2 后备猪的检测 在后备猪选留时进行PRV-gE特异性抗体和PRV-gB免疫抗体检测， 确保转入种猪群的猪只PRV-gE抗体为阴性，PRV-gB免疫抗体水平应符合合格标准。后备猪入群必须逐头检测。 6.3 引种检疫 6.3.1 严格检疫引进猪只。按照农牧发20192 号跨省调运乳用种用动物产地检疫规程规定引进猪只。 在种猪启运前对拟引进猪只逐头进行检测， 确保 PRV-gE 特异性抗体阴性或猪伪狂犬病病毒核酸检测阴性，且 PRV-gB 抗体合格后方可启运引进。 6.3.2 建立专门隔离饲养舍，引进后隔离饲养 45 d 以上经检测合格后才可混群饲养。 6.3.3 使用外来种公猪的精液时，必须在购买前对供精种公猪进行严格检疫，保证供精种公猪 PRV-gE 特异性抗体阴性或猪伪狂犬病病毒核酸检测阴性且 PRV-gB 免疫抗体合格。 对精液进行病原核酸检测确保检测结果阴性。 6.4 生产记录不佳的种猪检测 要及时收集病死猪及母猪所生产的弱仔猪、死胎、流产胎儿，进行猪伪狂犬病病毒核酸检测，检测方法按照GB/T 18641或GB/T 35911执行。如果猪伪狂犬病病毒核酸检测阳性，则检测对应的亲本母猪PRV-gE野毒抗体，阳性者淘汰。 7 综合生物安全措施 7.1 合理的猪场选址 按NY/T 1568规定执行，避免病毒经空气传入。 7.2 生产模式 参照GB/T 17823执行。执行自繁自养、全进全出、提前断奶及“两点式”或“三点式”的生产模式，阻断猪场间、猪群间、批间、引种、转场疫病传播。 7.3 饲养管理 DB37/T 36762019 6 按GB/T 17824.2的规定执行，加强饲养管理，减少应激。做好通风、保温、适宜的饲养密度。种猪场的净道与污道要分开。分胎次饲养、分类别饲养、分类管理，隔离、阻断疫病传播。科学规范用药，种猪禁用皮质类固醇类药物。 7.4 消毒措施 按DB37/T 2384的规定执行。严格做好人员、物品、用具、车辆、猪舍内外环境以及粪便排泄物和污水的消毒。 7.5 无害化处理措施 7.5.1 病死猪及母猪所生产的弱仔猪、死胎、流产胎儿按农医发201725 号病死及病害动物无害化处理技术规范的规定处理。 7.5.2 粪便处理按 NY/T 1168 的规定。 7.6 有害生物防治措施 禁止在猪场内饲养犬、 猫等其它易感动物。 每6个月至少开展1次全方位彻底灭鼠。 定期杀虫、 防蝇。 7.7 其它生物安全措施 7.7.1 保障独立、隔离的公猪站的生物安全，加强人工授精检测与管理，防止精液传播。 7.7.2 加强生产流程管理。重点在容易转阳的阶段，全部清空 12 批，彻底消毒，空栏。 7.7.3 保持净化工作的连续性。 7.8 档案管理 7.8.1 做好生产记录、饲料和饲料添加剂购进和使用记录、兽药购进和使用记录、免疫记录、消毒记录、病死猪无害化处理记录、防疫监测记录、疾病诊疗记录、运输车辆记录、粪便及污物无害化处理记录和销售记录等。 7.8.2 记录保存不少于 2 年。 DB37/T 36762019 7 A A 附 录 A （资料性附录） 猪伪狂犬病免疫无疫评估实验室检测方法及抽样要求 表A.1 猪伪狂犬病免疫无疫评估实验室检测方法及抽样要求 检测项目 检测方法 抽样种群 抽样数量 样本类型 抗体检测 gE-ELISA 种公猪 生产公猪存栏 50 头以下，100 %采样；生产公猪存栏 50 头以上， 按照证明无疫公式计算 （置信度95 %， 预期流行率3 %） 。将采样数量按照存栏比例分配到不同栋舍后随机抽样。 血清 生产母猪 后备种猪 按照证明无疫公式计算采样数量（置信度 95 %，预期流行率3 %） ；随机抽样，覆盖不同猪群。 血清 抗体检测 gB-ELISA 生产母猪 按照预估期望值公式计算采样数量（置信度 95 %，预期合格率 90 %，相对误差 10 %） 。将采样数量按照存栏比例分配到不同栋舍后随机抽样。 血清 后备种猪 按照预估期望值公式计算采样数量（置信度 95 %，预期合格率 90 %，相对误差 10 %） 。将采样数量按照存栏比例分配到不同栋舍后随机抽样。 血清 表A.2 猪伪狂犬病净化抽样参考数量 群体数量 （N） 感染情况评价 感染情况评价 预期流行率（P） 预期流行率（P） 3 %（猪） 5 %（猪） 50 43 37 100 63 47 150 73 51 200 78 54 300 84 56 400 88 58 500 90 59 750 93 60 1000 94 60 1500 96 61 2000 96 61 3500 97 62 5000 98 62 7500 98 62 10000 98 62 99 62 DB37/T 36762019 8 B B 附 录 B （资料性附录） 猪伪狂犬病净化评估实验室检测方法及抽样要求 表B.1 猪伪狂犬病净化评估实验室检测方法及抽样要求 检测项目 检测方法 抽样种群 抽样数量 样本类型 抗体检测 gE-ELISA 种公猪 生产公猪存栏 50 头以下，100 %采样；生产公猪存栏 50 头以上， 按照证明无疫公式计算 （置信度 95 %，预期流行率 3 %） 。将采样数量按照存栏比例分配到不同栋舍后随机抽样。 血清 生产母猪 后备种猪 按照证明无疫公式计算采样数量 （置信度 95 %，预期流行率 3 %） ；随机抽样，覆盖不同猪群。 血清 _