技术讲座系列之色谱柱日常维护及应用解决方案.pptx

色谱柱的使用和维护色谱柱使用的六大误区异常色谱峰产生的原因和解决方案一一四四三三二二色谱柱的基本知识概概 述述四四色谱柱的使用和维护色谱柱使用的六大误区异常色谱峰产生的原因和解决方案四四色谱柱使用的六大误区四四一、色谱柱的基本知识一、色谱柱的基本知识分离原理分离原理当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)，由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。慢慢中等中等快快色谱分离淋洗液淋洗液优秀的色谱柱是一切的开始高效液相色谱柱发展史19世纪70年代中期，10m的无定型硅胶颗粒。80年代：粒径为510m球形硅胶。90年代早期：粒径为5m的高纯硅胶。90年代后期：发展了3m或3.5m的球形硅胶。21世纪早期：粒径小于2m的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的HPLC硅胶基质填料主要为B型硅胶。HPLC色谱柱及其填料的特征HPLC色谱柱的基质材料硅胶与聚合物等色谱柱结构柱体填料硅硅 胶胶 基质材料基质材料1.高机械强度和高的比表面积、高效。2.可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。3.重现性好。4.pH适用范围为pH28。5.具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。聚合物聚合物基质材料基质材料1.交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。2.pH稳定性好：pH113。3.可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。4.在中等pH条件下对强碱性物质具有更好的峰形。5.填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。6.分离效率相对硅胶而言比较低7.重现性不好硅硅 胶胶 外外 形形球形硅胶:n现代HPLC填料n粒径小(5m,3m,5m柱床稳定性差比表面积较小价格便宜Ultimate硅胶粒子l超纯全多孔球形硅胶（纯度99.999%）l均匀的孔径大小分布和均匀的粒径分布l以独特的表面修饰方法确保硅胶表面的惰性和均一性l比表面积大，对疏水性和极性化合物具有很强的保留能力l很好的机械稳定性l粒径范围从3m10m，满足从分析到制备分离规模的应用硅硅 胶胶 纯纯 度度n硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。n金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。硅胶纯度硅胶纯度M+表面金属能与螯合化合物络合MSiOH内部的金属对表面硅羟基具有活化作用强酸性A型硅胶C18B型硅胶C18用螯合剂对色谱柱中痕量金属的测定312色谱柱:UltimateTM XB-C18,4.6 x 150 mm,5 m 流动相:45%甲醇/55%20 mM 磷酸盐,pH 7.6流速:1 ml/min波长:215 nm温度:25 0C进样量:1 l样品:1)4,4-联吡啶 2)2,2-联吡啶 3)1,2-二羟基萘123pH2.7pH7.6与其它品牌色谱柱硅胶基质中金属含量的比较色谱柱:4.6x150mm,5m流动相:45%甲醇/55%20mM磷酸盐,pH7.6流速:1ml/min波长:215nm温度:250C进样量:1l样品:1)4,4-联吡啶2)2,2-联吡啶3)1,2-二羟基萘312312312312WelchUltimateTMXB-C18ThermoHypersilC18EliteSinoChromA-C18AnalyticalTechnologyChromC18PeakdisappearedPeaktailedPeaktailed硅硅 胶胶 粒粒 径径粒径作用和效能5m目前应用最广泛，可以满足从分析到半制备的分离33.5m常用于分析柱上的快速分离，色谱柱短，节省溶剂2m常应用于超快速分离，分离度高710m常用于半制备色谱柱1020m常用于制备色谱柱硅胶孔径硅胶孔径孔径作用和效能60对HPLC分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率60150对小分子的分离效果理想(MW1,000对聚合物的分离效果理想，如DNA和生物大分子Ultimate 硅胶基质材料的孔径分布硅胶基质材料的孔径分布l孔径120l孔径分布小且均匀l彻底消除了可使色谱性能降低的直径小于50的微孔l分析应用中分离度高，制备应用中载样量大键键 合合 相相n键合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;Cyano,5%,苯基柱5%,正相:20%;硅胶、-NH2、-CN其它(手性柱,离子交换柱):10%n反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。nC18和C8在反相色谱中应用得最为广泛。为什么反相色谱应用如此广泛为什么反相色谱应用如此广泛?n它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。n适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。n保留机制可以用分子的疏水性进行描述和解释。n所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。n选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。UltimateTM不同键合相的选择性不同键合相的选择性 色谱柱:4.6x150mm,5m流动相:78%20mM磷酸盐,pH2.7/22%甲醇流速:1ml/min波长:215nm温度:400C样品:1.硫脲2.苄胺3.3-氨基喹啉4.2,3-二氮杂萘5.咖啡因6.4-乙基苯胺7.苯甲醇2134567213456752134676251347UltimateTMXB-C18UltimateTMXB-C8UltimateTMXB-PhenylUltimateTMXB-CN封封 尾尾n封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进行进一步的反应。n由于硅烷相对很大的体积，使得C18和其它键合相在发生键合反应时只能覆盖不到硅胶表面的50%。n硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。n封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代n封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形AnalyticalTechnologyChromC18EliteSinoChromA-C18N=6854,Tf=1.78N=5312,Tf=1.98N=10840,Tf=1.18WelchUltimateTMXB-C18413254132541325色谱柱:4.6x150mm,5m流动相:80%MeOH/20%20mMp磷酸盐,pH7.0流速:1ml/min波长:215nm温度:250C样品:1)尿嘧啶2)心得安3)去甲替林4)丙咪嗪5)阿米替林色谱柱:4.6x100mm,5m流动相:80%甲醇/20%20mM磷酸盐,pH7.0流速:1ml/min波长:215nm温度:250C样品:1)尿嘧啶2)心得安3)去甲替林4)丙咪嗪5)阿米替林WatersXTerraMS-C18AgilentRx80XDB-C18N=6272,Tf=1.20N=3891,Tf=1.25N=7256,Tf=1.05413254132541325WelchUltimateTMXB-C1841325PhenomenexLunaC18(2)N=6258,Tf=1.27为什么色谱柱会失去作用?1.部分原因是色谱柱塞板或柱床被堵塞导致色谱柱背压上升、峰形拖尾和柱效下降。2.吸附了样品杂质导致柱效下降、选择性和保留时间改变。3.色谱柱没装填好导致柱效下降和峰形拖尾。4.物理损伤或受热引起的缺口导致柱效下降和峰形拖尾。5.对硅胶基质或键合相的化学腐蚀导致选择性变弱、峰形拖尾、保留能力下降（或对碱性化合物的保留能力增强）。二、色谱柱的正确使用和维护二、色谱柱的正确使用和维护正确的温度范围正确的温度范围正确的正确的PH范围范围正确的维护正确的维护正确的流动相正确的流动相组成组成正确的保存正确的保存良好的使用习惯良好的使用习惯仔细阅读仔细阅读说明书说明书样品前处理样品前处理正确安装正确安装色谱柱色谱柱正确的温度范围正确的温度范围正确的正确的PH范围范围正确的维护正确的维护正确的流动相正确的流动相组成组成正确的保存正确的保存良好的使用习惯良好的使用习惯仔细阅读仔细阅读说明书说明书样品前处理样品前处理正确安装正确安装色谱柱色谱柱正确的温度范围正确的温度范围正确的正确的PH范围范围正确的维护正确的维护正确的流动相正确的流动相组成组成正确的保存正确的保存良好的良好的使用习惯使用习惯使用前的使用前的准备工作准备工作干净的样品干净的样品阅读使用说明书阅读使用说明书1）使用注意事项）使用注意事项2）pH使用范围使用范围3）保存流动相）保存流动相按箭头方向连接色谱柱按箭头方向连接色谱柱用流动相走基线至平稳用流动相走基线至平稳进进 样样使用前的准备工作使用前的准备工作按说明书要求活化色谱柱按说明书要求活化色谱柱使用缓冲盐时需要特别注使用缓冲盐时需要特别注意置换，意置换，不要使缓冲盐析出不要使缓冲盐析出特殊样品检测，需用样品溶液特殊样品检测，需用样品溶液进行色谱柱老化进行色谱柱老化色谱柱的正确连接色谱柱的正确连接如果伸出的管线长度过长，可能漏液如果伸出的管线长度过长，可能漏液 螺母坡度不匹配，密封性差螺母坡度不匹配，密封性差 死体积区死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积HPLC的色谱柱接头的色谱柱接头HPLCHPLC常用色谱柱接头：常用色谱柱接头：厂家厂家WelchWaters shimadzu PhenomenexAgilentdikma管前端长管前端长度度/mm2.03.32.42.02.332.350 m mL 柱外体积（管线）柱外体积（管线）4321Time(min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.010 m mL 柱外体积柱外体积Time(min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.04321样品样品:1.苯丙胺酸 2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe 4.天冬甜素4321Time(min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.010 m mL 柱外体积柱外体积Time(min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.043210.12mm内径管线用于毛细管内径管线用于毛细管HPLC中中2.1mm内径色谱柱内径色谱柱0.17mm内径管线用于分析型内径管线用于分析型HPLC中中2.14.6mm内径色谱柱内径色谱柱0.25mm内径管线用于半制备型内径管线用于半制备型HPLC中中9.4mm内径色谱柱内径色谱柱0.5mm内径管线用于制备型内径管线用于制备型HPLC中中21.2mm内径色谱柱内径色谱柱正确的正确的PH使用范围使用范围 1 1、禁止在色谱柱、禁止在色谱柱PHPH值要求值要求范围以外使用范围以外使用2 2、避免在色谱柱临界、避免在色谱柱临界PHPH值值处长期使用处长期使用在什么样的在什么样的PH值范值范围内使用色谱柱是正围内使用色谱柱是正确的？确的？保留时间保留时间酸性组份酸性组份中性组份中性组份碱性组份碱性组份 方法稳定区方法稳定区 方法波动区方法波动区(pKa+1.5)方法稳定区方法稳定区液相柱液相柱-保留值与保留值与pH的关系的关系不同填料基质对不同填料基质对PH不同的耐受表现不同的耐受表现 有机无机杂化硅胶基质(pH1.0-12.5）硅胶基质（pH2-8）Al2O3nH2O(pH1-14）聚合物基质(pH1-14）高柱效高机械强度宽PH高或低pH下,硅胶会溶解化学修饰困难 柱效不够高Welch公司反相色谱柱使用范围；Ultimate是1.5-10.0CN填料是1.5-9.0Xtimate是1.0-12.5Welchrom是1.5-10.0LP系列填料是1.0-8.0常见缓冲盐的常见缓冲盐的PH值值 缓冲液pKapH范围磷酸盐pK12.11.13.1柠檬酸盐pK13.12.14.1甲酸盐3.82.84.8柠檬酸盐pK24.73.75.7乙酸盐4.83.85.8柠檬酸盐pK35.44.46.4磷酸盐pK27.26.28.2羟甲基甲胺8.37.39.3氨9.28.210.2硼酸盐9.28.210.2甘氨酸9.88.810.81-甲基-哌啶10.39.311.3四氢化吡咯10.59.511.5二乙胺10.59.511.5三乙胺10.79.711.7磷酸盐pK312.311.313.3正确的温度范围正确的温度范围问：为什么色谱柱有温度要求？答：1、得到良好的时间重复性；2、适当的提高柱温，可以减小流动相的粘度，降低色谱柱背压；升高柱效；3、柱温过高，会加快填料的溶解，缩短色谱柱使用寿命.问问:色谱柱的正确使用温度是多色谱柱的正确使用温度是多少？少？答：答：40（正常寿命）（正常寿命）；40（缩短寿命）（缩短寿命）。正确的正确的正确的正确的流动相流动相流动相流动相的组成的组成的组成的组成良好的化学性能良好的化学性能各相之间良好的互溶性各相之间良好的互溶性合适的缓冲盐浓度合适的缓冲盐浓度适宜的适宜的PH值范围值范围适宜的有机相比例适宜的有机相比例相塌陷相塌陷甲醇水下的碳链形状100%水下的碳链形状水乙腈0.1%的醋酸柱子加压270bar持续10分钟水/乙腈(40/60)1ml/min30min0.1%的醋酸普通C8柱0.1%的醋酸阿莫西林的检测：正确的保存正确的保存色谱柱内不含缓冲盐或离子对试剂长期保存80%左右有机相保存（甲醇或乙腈）（短期保存，可以用不含缓冲盐的流动相保存）塑料堵头拧紧典型的有机物分析流程图典型的有机物分析流程图采集样品处理仪器分析收集提取储存浓缩分离定性定量样品前处理样品前处理的重要性的重要性提高检测限保护仪器色谱柱提高选择性样品前处理的一般原则：样品前处理的一般原则：a、尽可能的除去样品杂质；b、使用流动相溶解样品；c、使用预处理柱（如：SPE小柱）除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质；d、使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。二、色谱柱的维护色谱柱的维护特殊维护日常维护日常维护每次分析完成后的色谱柱维护正向使用正向使用反向冲洗反向冲洗特殊维护色谱柱出现异常时的维护柱压升高柱效降低固体颗粒物质堵塞缓冲盐析出填料污染固定相的流失强保留物质的累积正常升高异常升高什么是柱压正常升高？缓慢升高柱压在短时间内快速上升什么是柱压的异常升高？固体颗粒物质堵塞筛板固体颗粒物质堵塞筛板流动相和样品中的固体颗粒物质流动相抽滤过0.45um滤膜样品针筒过滤0.45um滤膜泵密封圈和管路磨损产生的固体颗粒物质接保护柱接在线过滤器保护柱和在线过滤器保护柱和在线过滤器缓冲盐的析出缓冲盐的析出缓冲盐析是怎么析出的？怎样防止缓冲盐析出？有机溶剂有机溶剂/饱和缓冲液饱和缓冲液70/30 ABC100%有机溶剂有机溶剂A+B C盐析出缓冲盐析出原理缓冲盐的正确使用方法流动相走基线流动相走基线过渡流动相过渡过渡流动相过渡进样进样分析完成后用过渡流动分析完成后用过渡流动相相反向反向冲洗冲洗40min用甲醇或乙腈水溶液用甲醇或乙腈水溶液反反向向冲洗冲洗40min过渡流动相：过渡流动相：指有机相和水相比例与分析流动相相同，或者指有机相和水相比例与分析流动相相同，或者水的比例水的比例”大于大于“分析流动相中缓冲盐溶液的比例分析流动相中缓冲盐溶液的比例固定相的流失固定相的流失硅胶基质溶解规律高水、高温度、高pH键合相流失规律低pH、高水流动相pH、水相需限定在色谱柱允许范围内强保留物质累积的维护方案强保留物质累积的维护方案一.流动相中不含缓冲盐分析完成后，用纯甲醇或乙腈冲洗色谱柱45min；二.流动相中含有缓冲盐分析完成后，先用过渡流动相冲洗45min，然后再用纯甲醇或乙腈冲洗色谱柱45min；强保留物质累积的维护方案强保留物质累积的维护方案Welch公司色谱柱最佳维护方案公司色谱柱最佳维护方案一.流动相中不含缓冲盐分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水90：10反向冲洗色谱柱45min；二.流动相中含有缓冲盐分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水90：10反向冲洗色谱柱45min；色谱柱再生色谱柱再生（用下列每种溶剂2030倍柱体积冲洗）反相色谱柱100甲醇甲醇-100乙乙腈腈-75乙乙腈腈/25异丙醇异丙醇-100异丙醇异丙醇-100二氯甲烷二氯甲烷-100正己烷正己烷-100异丙醇异丙醇 正相色谱柱50：50正己烷正己烷/氯仿氯仿-甲醇甲醇-二氯甲烷或者二氯甲烷或者100%醋酸乙酯醋酸乙酯油脂类物质，可用异丙醇清洗油脂类物质，可用异丙醇清洗处理正相色谱柱试剂严格除水色谱柱柱体积色谱柱柱体积4.6 x 500.83 mL 0.624.6 x 300.5mL 0.374.6 x 2504.15 mL 3.114.6 x 1502.5 mL 1.872.1 x 500.17 mL 0.132.1 x 300.10 mL 0.08色谱柱色谱柱 空柱管空柱管 柱柱 尺寸尺寸体积体积 体积体积 (mm)（mL）（ml）三、异常色谱峰产生的原因和解决方案常见异常色谱峰：常见异常色谱峰：前延峰；拖尾峰；叉峰（裂峰）；宽峰/馒头峰。前延峰解决方案前延峰解决方案几种常见的前延峰峰前延解决方案峰前延解决方案1.样品过载前拖、后拖或平头峰2.溶剂效应-使用流动相溶解样品a.用纯甲醇溶解样品Tf0.891b.用流动相溶解样品Tf1.072流动相为乙腈：4%冰醋酸水溶液48：52姜黄素标准品用流动相溶解样品的替代方案用流动相稀释至原来浓度的1/4倍a.用纯甲醇溶解样品Tf0.811b.将a图中的样品用流动相稀释至原来浓度的1/4倍Tf=0.980c.用流动相溶解样品Tf1.028石杉碱甲标准品的测定石杉碱甲标准品的测定色谱柱：UlitmateXBC18，4.6250mm；流动相：甲醇：缓冲盐溶液(0.08M醋酸铵水溶液，冰醋酸调节PH至6.0)25：75；检测波长：308nm；温度：室温26度；流速:1ml/min；进样量：20ul3.缓冲盐浓度较低-增加流动相中缓冲盐的浓度a.乙腈：3%磷酸：无水乙醇80：10：10Tf0.737b.（乙腈：3%磷酸：无水乙醇）80：10：10）：50mM磷酸二氢钠80：20Tf0.930注射用苦参碱的测定色谱柱：UltimateXB-NH2-2,5um,4.6250mm；柱温：室温24度；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；进样量：20ul；4.流动相中加入适量的四氢呋喃a.50mM磷酸二氢钾（用2mol/L的KOH溶解调节pH5.0）/乙腈97.5/2.5Tf0.873c.50mM磷酸二氢钾（用2mol/L的KOH溶解调节pH5.0）/乙腈/THF97.5/2.5/1Tf0.986阿莫西林胶囊的测定色谱柱：UltimateAQC18，5um，4.6250mm；检测波长：254nm；温度：室温28度；流速：1.0ml/min；进样量：20ul；5）柱温太低-适当升高柱温的温度有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖。2）柱外死体积大色谱柱反冲，修复色谱柱；选择性能良好的色谱柱。硬件原因：1）色谱柱损坏(筛板阻塞和柱头塌陷)、装填不当用细径管路和小体积流通池，各接口连接紧密。拖尾峰解决方案拖尾峰解决方案几种常见的拖尾峰地红霉素：Tf=1.268二甲基苯氧乙酸：Tf=1.991头孢地嗪钠：Tf=3.109拖尾峰解决方案拖尾峰解决方案通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有COOH、NH2、NHR、NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾拖尾产生机理与分子结构有关这些基团的离子态COO、NH3、NH2R、NHR2拖尾峰解决方案拖尾峰解决方案拖尾产生机理与残余硅羟基有关硅羟基的特性：1）具有一定的极性SiOH2）SiOH的pKa为4.54.73）硅羟基的离子态SiO拖尾峰解决方案拖尾峰解决方案头孢尼西钠的测定50mg/100ml用流动相溶解样品Tf2.248头孢尼西钠的测定0.5mg/100ml用流动相溶解样品Tf1.068头孢尼西钠的测定色谱柱：UltimateXBC18，5um，4.6250mm波长：272nm流动相：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节PH3.5）：乙腈84：16温度：室温17流速：1.0ml/min进样量：20ul样品过载对峰形的影响色谱柱：UltimateXBC18，5um，4.6250mm波长：280nm磷酸盐缓冲溶液的配制：准确称取磷酸二氢钠7.8g溶于1000ml水中，搅拌均匀，使之溶解，用磷酸将pH值调至2.50温度：室温26流速：1.0ml/min进样量：20ul流动相：甲醇：磷酸盐缓冲溶液=70：30（混合好后，测得pH为4.07）N15633Tf1.15流动相：甲醇：磷酸盐缓冲溶液=70：30（甲醇和磷酸盐缓冲溶液混合好后用磷酸调节pH至2.49）N16719Tf1.105二甲基苯氧乙酸结构式流动相中加入酸峰形后拖解决方案峰形后拖解决方案3.增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度溴化氢高乌甲素结构式色谱柱：UltmateXB-C18,5um,4.6250mm波长：252nm流动相：甲醇：水75：25温度：室温15流速：1.0ml/min进样量：20ul用流动相溶解样品N1281Tf1.444色谱柱：UltmateXB-C18,5um,4.6250mm波长：252nm流动相：甲醇：50mmol/L磷酸二氢钠溶液75：25（混合好后，用三乙胺调节pH至8.40，即200ml混合好的溶液中加入75ul三乙胺）温度：室温15流速：1.0ml/min进样量：20ul用流动相溶解样品N9230Tf0.987头孢噻肟钠 结构式色谱柱：UltimateXB-C18,5um,4.6250mm波长：254nm流动相：磷酸盐缓冲溶液：甲醇80：20（混合好后，测得pH为8.4）缓冲盐的配制：准确称取60mg磷酸二氢钾和磷酸氢二钠1.2g溶于1000ml水中，搅拌均匀柱温：室温12流速：1.0ml/min进样量：20ulN3422Tf2.503色谱柱：UltimateXB-C18,5um,4.6250mm波长：254nm流动相：磷酸盐缓冲溶液：甲醇：三乙胺80：20：2（混合好后，用磷酸调节至pH8.4）缓冲盐的配制：准确称取60mg磷酸二氢钾和磷酸氢二钠1.2g溶于1000ml水中，搅拌均匀柱温：室温12流速：1.0ml/min进样量：20ul流动相中加入三乙胺流动相中加入三乙胺2）柱外死体积大色谱柱反冲，修复色谱柱，选择性能良好的色谱柱。硬件原因：1）色谱柱损坏(筛板阻塞和柱头塌陷)，装填不当用细径管路和小体积流通池，各接口连接紧密。3）色谱柱被强保留物质污染充分冲洗色谱柱。峰分叉（裂峰）峰分叉（裂峰）反向反向冲洗冲洗进样次数少进样次数多进样次数多柱污染保护柱或分析柱被固体颗粒阻塞a、取下保护柱再进行分析；b、更换保护柱；c、柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施；d、反向冲洗色谱柱。峰分叉（裂峰）峰分叉（裂峰）最有可能最有可能的原因的原因修补色谱柱柱头塌陷峰分叉（裂峰）峰分叉（裂峰）进样溶剂化效应进样溶剂化效应峰分叉（裂峰）峰分叉（裂峰）样品溶剂极性小于流动相样品溶剂尽可能与流动相匹配用流动相溶解样品其他原因及解决方案其他原因及解决方案保护柱填料与分析柱填料不一致保护柱填料与分析柱填料不一致-更换保护柱，最好使用相同更换保护柱，最好使用相同厂家相同品牌的保护柱和分析柱厂家相同品牌的保护柱和分析柱流动相碱性过强流动相碱性过强-由于硅胶溶解使柱塌陷由于硅胶溶解使柱塌陷峰分叉（裂峰）峰分叉（裂峰）宽峰宽峰/馒头峰馒头峰物质在色谱柱扩展宽峰宽峰/馒头峰馒头峰流动相柱外效应色谱柱比例改变流速太低缓冲盐浓度低样品池过大记录仪响应时间太长色谱柱与检测器间管路不适合色谱柱或保护柱污染柱头塌陷色谱柱过载柱温过低比例改变流速太低缓冲盐浓度低比例改变流速太低流动相缓冲盐浓度低比例改变流速太低柱外效应样品池过大色谱柱与检测器间管路不适合柱外效应样品池过大记录仪响应时间太长色谱柱与检测器间管路不适合柱外效应样品池过大色谱柱色谱柱或保护柱污染柱头塌陷色谱柱色谱柱或保护柱污染色谱柱过载柱头塌陷色谱柱色谱柱或保护柱污染柱温过低色谱柱过载柱头塌陷色谱柱色谱柱或保护柱污染色谱柱使用过程中的不良习惯高流速再生色谱柱纯水才能冲干净缓冲盐使用缓冲盐时，不过渡色谱柱污染后，不对仪器进行清洗用极性相差太大的流动相互换使用过程中突然增加或减小柱压样品或流动相看不见杂质就不过滤塑料瓶装水或有机溶剂纯水或缓冲盐使用多天流动相混匀过滤、脱气后，又摇晃四、色谱柱使用六大误区四、色谱柱使用六大误区色谱柱使用六大误区：色谱柱使用六大误区：1、HPLC色谱柱不能反转使用：反转后会出现填料塌陷、键合相无法展开 错误错误!装填色谱柱压力，约8000psi；装填方向和使用方向相反；某些厂家前后筛板孔径不一致；月旭公司的色谱柱两端筛板孔径是一致。色谱柱使用六大误区：色谱柱使用六大误区：2、保护柱不影响分离效果：错误错误!填料选择不当，引起保留时间漂移，甚至导致不同的 选择性；安装不正确，死体积加大，使峰形变差。色谱柱使用六大误区：色谱柱使用六大误区：3、提高温度有利于分离效果：错误错误!使低k值的物质几乎无保留,很难定量；不同化合物对温度变化相应不一致；缩短色谱柱使用寿命；温差较大，使峰变形。色谱柱使用六大误区：色谱柱使用六大误区：4、碳载量越高反相色谱柱就越好：错误错误!保留能力取决于被分析分子的相对疏水性；容易发生相塌陷；保留时间的重现性较差。色谱柱使用六大误区：色谱柱使用六大误区：5、新柱柱压越低，色谱柱越好：错误错误!分离度（R）、柱效（N）、选择因子（）和柱压没有关系；填料越密柱压越高；装柱压力约8000psi。1.色谱柱两端的压力降不应超过公式计算所得的30。2.硅胶粒径对色谱柱的压力具有很大的影响；硅胶粒子越小，色谱柱的背压越大。3.色谱柱的背压还与流动相的粘度有关。P是色谱柱背压(psi)，L是色谱柱的长度(cm),流动相的粘度(cP)，t0是色谱柱死时间,dp是粒子的直径(m)各品牌柱压状况比较（以各品牌柱压状况比较（以C18为例）为例）最低：迪马钻石一代岛津VP-ODS色谱柱较低：Welch（WelchromC18）依利特（Sino-ChromC18）较高：Waters（Xterra、Xbrige、Symmetry），Agilent（Zorbax）Phenomenex（Luna、Gemini）迪马二代（DiamonsilC18II）Welch（Ultimate、Xtimate）色谱柱使用六大误区：色谱柱使用六大误区：6、色谱柱应紧紧密封以防填料与空气接触而损坏：错误错误!色谱柱两头的微孔的直径不到0.2英寸；部分进入色谱柱，很难扩散接触足够多的填料；少量空气，在高压下会立即溶解，流出色谱柱。欢迎提问！疏水作用存在状态流动相的PH值酸性物质：pKa-pH2碱性物质：pH-pKa2离子状态分子状态