荧光素&流式技术.ppt

荧光素&流式细胞术 杨 培 2014.02.11 荧光素介绍 流式细胞术基本原理 流式细胞术的应用 流式胞内因子的流式检测 流式多色Panel设计主 要 内 容 一.荧光素介绍荧光素（Fluorescein）是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多。荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。荧光素介绍荧光素的激发和发射光谱任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素的使用：选择正确的激光器确定所需荧光探测器（PMT）488nm 520nm异硫氰酸荧光素（FITC）荧光素介绍BlueBlue（488nm488nm）FITCAlexa Fluor 488PEPerCPPerCP-Cy5.5PE-Cy5PE-Cy7PI7-AADRedRed（633nm633nm）APCAPC-Cy7AF647AF700VioletViolet（405nm405nm）AmCyanBrilliant Violet 421Pacific BlueBrilliant Violet 510Brilliant Violet 570Brilliant Violet 605Brilliant Violet 650Brilliant Violet 711Brilliant Violet 785Qdot 605UV (360nmUV (360nm）DAPI常用荧光素荧光素介绍第二步：荧光素的选择荧光素光谱分析网络工具：http:/ Fluors,Cy dyes,Horizon,Dylight,etc蛋白蛋白 PE,PE,APC,GFP,APC,GFP,mCherry mCherry半导体纳米半导体纳米 Qdots,Qdots,Crystalplex,Crystalplex,eFluorN eFluorNC有机聚合物有机聚合物Brilliant VioletBrilliant VioletAlexa488PECy5Cy5Cy5荧光素家族CollisionalQuenching荧光素淬灭耦合荧光素耦合荧光素anti-Mouse CD3e,clone 145-2C11-PE/Cy5BioLegendCompetitor 1n 耦合荧光素不同厂家，抗体荧光强度不同：F:P值不同n 耦合荧光素对光、对固定剂更敏感Brilliant Violet TM 570Brilliant Violet TM 605Brilliant Violet TM 650Brilliant Violet TM 711Brilliant Violet TM 785耦合荧光素家族 PE-Cy7 Brilliant Violent TM简称“BV”，是诺贝尔奖获得者发明的“最新一代”的荧光染料，“BV”染料是有机聚合物，它有很强的光吸收能力（消光系数）和光转换能力（量子产率），这些物理特性使“BV”的亮度很强，更适合弱表达蛋白的检测。Brilliant Violent TM荧光素家族，包括：BV421，BV510,BV570，BV605，BV650，BV711，BV785 七个成员，充分利用流式细胞仪405nm激发管，与其它各种荧光素兼容性好。Biolegend公司可以提供最新最全的BV系列荧光抗体，BD 目前只推出了四种！Brilliant Violet TM荧光素家族 荧光素荧光强度激发光滤光片平行荧光素BrilliantVioletTM4215405nm450/50PacificBlueBrilliantVioletTM5104405nm510/50或525/50BDHorizonV500和AmCyanBrilliantVioletTM5703405nm585/40PacificOrangeBrilliantVioletTM6055405nm605/12或510/20eFluor605 和Qdot605BrilliantVioletTM6504405nm660/20eFluor650和Qdot650BrilliantVioletTM711 4405nm710/50eFluor700NC和Qdot705BrilliantVioletTM785 3405nm780/60Qdot800荧光强度。（检测灵敏度及联接蛋白数量）吸收光谱宽窄。（多色染色时不易漏光）光稳定性。（光漂白）Buffer稳定性。（PH值稳 定）机器兼容性。（激发光与接收光是否与大众化的机器相匹配）荧光素评价指标荧光素评价指标发射波长(nm)530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY5不同荧光素发射波长及波长宽窄不同不同荧光素发射波长及波长宽窄不同荧光素评价指标荧光素评价指标-荧光发射波长荧光发射波长荧光素评价指标荧光素评价指标-荧光强弱荧光强弱 二.流式细胞术基本原理流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种以流式细胞仪为检测手段，可以快速、准确、客观，同时检测单个生物微粒的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。特点:研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、人工合成微球等 快速、准确、高通量检测 多参数、多色荧光分析，对细胞特性的识别、计数更为准确 定性或定量分析细胞 分选特定性状或功能的细胞流式细胞术原理液流系统光学系统电子系统分选系统流式细胞仪的基本结构流式细胞仪-光学系统前向角散射光（FSC）：反映相对大小侧向角散射光（SSC）：反映细胞粒度及细胞内相对复杂性前向角检测器FSCLaser测向角检测器sSC激光光源信号检测 散射光信号外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）白细胞 淋巴细胞 单核细胞 粒细胞 根据散射光信号从人白细胞中鉴别出不同亚群：信号检测 荧光素荧光信号CD3-FITCCD19-PEPI-Fluorescence#Evnts正常正常G0/G1G0/G1期细胞期细胞直方图直方图 (Histogram)(Histogram)二维点图二维点图(Dot Plot)(Dot Plot)三维图（三维图（3D Plot3D Plot）等）等 直方图(Histogram)二维点图(Dot Plot)凋亡细胞峰凋亡细胞峰 等高线图等高线图(Contour Plot)(Contour Plot)密度图密度图 (Density)(Density)流式数据三维图（3D Plot3D Plot）流式细胞术常用分析软件BDcellquestBDFacsDiva。仪器自带分析软件 第三方分析软件三.流式细胞术的应用流式技术的应用流式技术的应用流式检测技术：了解细胞的特征细胞亚群细胞表型细胞粘附分子细胞因子受体细胞胞内因子细胞周期四.流式胞内因子的流式检测胞内检测(ICFCorICS)?l胞内检测指标主要包括：细胞因子 胞浆 转录因子 细胞核 细胞内抗原 或 细胞内结构标志物 信号分子,如：活化的蛋白激酶胞内流式检测操作表面指标检测固定/破膜胞内指标检测活化细胞细胞因子阻断5.201.81 37.53.921.0360.8IL-17IFN-流式细胞因子检测检测的细胞：是否分泌目标细胞因子 适合的细胞活化方法分泌细胞因子的阻断：阻断剂的添加与选择固定，破膜：固定/破膜试剂的选择尽量选择强荧光素抗体检测死细胞的去除细胞因子流式检测，需要考虑的因素：细胞活化细胞活化的一般方法：PMA/Ionomycin,PHA/ConA 模拟体内活化方法：MHC(抗原),TCR(CD3CD28),细胞因子(IL-2,IFN-r)，LPS细胞活化的protocols：分泌细胞因子的阻断细胞因子表达后快速分泌，如果不进行阻断，则细胞内因子含量很低，无法检测.阻断剂包括:Brefeldin A(#420601)Monensin(#420701)阻断剂对细胞有一定毒性，与细胞接触的时间越短越好(2-24h)。+Brefeldin A+Monensin细胞的固定与破膜 固定:多聚甲醛(PFA)浓度,时间,温度(例如.2%PFA,4C,10-15 min)与荧光素，细胞表面指标兼容 终止液：staining buffer+BSA BioLegend Fixation Buffer(#420801)破膜:皂素(0.05-0.2%)其他破膜剂(MeOH,Tween 20,Triton X-100)后续步骤都需要破膜剂:洗涤步骤 抗体孵育 BioLegend Permeabilization Wash Buffer(#421002)胞内因子与细胞核内指标检测，需选择不同的固定破膜剂！胞内因子与细胞核内指标检测，需选择不同的固定破膜剂！核内指标染色:FoxP3T Reg 细胞鉴定：细胞鉴定：CD4+CD25+FoxP3+BALB/c mouse splenocytes stained with Mouse Treg Flow Kit(FOXP3 Alexa Fluor 488/CD4 APC/CD25 PE)核内指标检测，需要破双层膜，固定/破膜剂不同于胞内指标使用的试剂！FOXP3 Fix/Perm Buffer(4x)(#421401)FOXP3 Perm Buffer(10 x)(#421402)如何节约您的时间？胞内检测流程胞内检测流程:需要大约需要大约1天天表面表面指标检测指标检测固定固定/破膜破膜胞内指标检测胞内指标检测刺激活化刺激活化细胞活化细胞活化固定固定破膜破膜检测检测 表面表面+胞内指标胞内指标 室温孵育抗体优于室温孵育抗体优于4C 检测指标下调检测指标下调如：如：CD4BioLegend Fixation buffer(#420801)Cyto-Last Buffer(#422501)4C 可保存至可保存至 2周周 哪些步骤可以保存及暂停实验？哪些步骤可以保存及暂停实验？固定/破膜后染色检测需注意！固定/破膜对表面指标的影响：Krutzik et al.JI 2005五.流式多色Panel设计带有不同荧光素的细胞细胞表面受体针对细胞不同蛋白的标记 不同荧光素单克隆抗体细胞与多种抗体共孵育流式多色检测概述1.1.多个激发光，滤光片，PMT 2.选择多种流式试剂 更加准确区分某一特定细胞群 多种参数，获得更多信息 省时，省钱，省标本 有助于发更好的文章流式多色检测的优势Th1随着科学的发展，细胞的标记在不断发现，数量在不断增加！所以在区分某一特定细胞群时,需要更多的细胞标记。需要功能强大的流式细胞仪 荧光素选择更加困难 补偿难调节流式多色检测的难点流式多色Panel设计第一步：了解您的流式仪器配置 型号,激发光，探测器，滤光片第二步：荧光素与流式仪器相匹配第三步：检测指标与荧光素相匹配第四步：查找&订购商业的荧光素抗体 流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及流式细胞仪主要厂商之一，分析分选均有，型号众多，科研临床领域都涉及分析型流式，科研临床领域都涉及分析型流式，有几种型号，临床领域为主Attune分析型流式，科研领域为主分析型流式，科研领域为主第一步：了解您的流式仪器配置FACS Calibur单激光三色，或双激光四色，市场覆盖率最高，分析型FACS Canto双激光六色，分析型FACS Aria双激光六色，或三激光八色，分选型为主，也可以分析FACS LSR双激光六色，三激光八色，或者更多激光，分析型最高配FACS Influx激光多个，高端分选型BD流式细胞仪CantoandARIAtypical光路图488 nm405 nm633 nm检测器组（激光器）PMT位置 长通透镜 带通/长通透镜 适用染料 八角形 A 735780/60 PE-Cy7（488nm蓝色激光）B 655670 LP PerCP-Cy5.5PerCP C 610空白可选框-D 556585/42PEE 502530/30FITCF 空白可选框 488/10SSCG 空白可选框 空白可选框-H 空白可选框 空白可选框-三角形 A 502510/50Amcyan,BV510（405nm)紫色激光）B 空白 540/50 PacificBlue,BV421三角形 A 735780/60 APC-Cy7（633nm红色激光）B 685空白可选框 C 空白 660/20 APC BD Canto 光路参数例 如：检测器组（激光器）PMT位置 长通透镜 带通/长通透镜 适用染料 八角形 A 735780/60 PE-Cy7（488nm蓝色激光）B 655670 LP PerCP-Cy5.5PerCP C 610空白可选框-D 556585/42PEE 502530/30FITCF 空白可选框 488/10SSCG 空白可选框 空白可选框-H 空白可选框 空白可选框-三角形 A 502510/50Amcyan,BV510（405nm)紫色激光）B 空白 450/50 PacificBlue,BV421三角形 A 735780/60 APC-Cy7（633nm红色激光）B 685空白可选框 C 空白 660/20 APC BD Canto光路参数第二步：荧光素与流式仪器相匹配 通常根据抗原的表达情况，可将其分为三大类：一类抗原：此类抗原高表达，且平行Panel中表达量变化不大.如：CD3,CD4,CD8,CD56,CD11c等，通常选择弱荧光素：Pacific Blue,APC-Cy7,Alexa Fluor 700,BV785等 二类抗原：这类抗原是表型分型所必须的，平行Panel中表达量是变化的，如：活化的抗原，细胞因子等，通常选择中强荧光素：如：BV510，BV650，FITC,PerCP-Cy5.5，BV570等 三类抗原：抗原表达量非常低，或是我们根本不知道的抗原表达情况，而且通常仅能找到纯化抗体或是有限的几种荧光素标记。通常选 择最强的荧光素：BV421，PE，APC,BV605，Alexa Fluor 647等第三步：检测抗原与荧光素相匹配例如：Th1/Th2/Th17/Treg 检测 CD3，CD4；IFN-r，Foxp3；CD25，IL-4,IL-17A强表达抗原，选弱荧光素，也可选择强荧光素弱表达抗原，一定要选强荧光素常用的荧光素强度1.1.弱表达抗原，一定选择最强的荧光素；2.如果您对所检测的抗原表达量不清楚，对于Panel内重要的抗原选择最强的荧光素；人免疫细胞表面常用Marker的表达量荧光素亮度检测抗原表达量背景优先使用频率BV4215最低最高Pacific Blue1中到高高FITC/AF4883低到中渗出到PE 高APC/AF6475低到中高BV5704中渗出到PE 和 BV421中Percp-Cy5.53中Crossbeam到AF700中PE5低到中中AF7002中到高中PE-Cy74低到中渗出到大部分PE的耦合荧光素及Crossbeam到APC-Cy7中到低V5001很高低PE-Cy55低Crossbeam到APC 和渗出到PE 和 Percp-Cy5.5低APC-Cy72中渗出到APC低Pacific Orange1很高很低PE-TR2中渗出到PE和PE-Cy5很低荧光素亮度不是选择的唯一标准 荧光素荧光强度BV4215PE5APC5BV510 4PE-Cy74Percp-Cy5.53FITC3APC-Cy72BD Canto 8色色 1.耦合荧光素：如：Percp-Cy5.5,PE-Cy7，APC-Cy7等，对光及固定剂稳定性差：Percp-Cy5.5对乙醇固定敏感 APC-Cy7 对多聚甲醛固定敏感 耦合荧光素固定后，光谱可能发生改变1.2.FITC 对较低的PH敏感3.APC&PE不能冻存例 如：Th1/Th2/Th17/Treg 检测例 如：仪器：BD Canto 检测器组（激光器）长通透镜 带通/长通透镜 适用染料 八角形 735780/60 PE-Cy7（488nm蓝色激光）655670 LP PerCP-Cy5.5PerCP 610空白可选框-556585/42PE502530/30FITC空白可选框 488/10SSC空白可选框 空白可选框-空白可选框 空白可选框-三角形 502510/50Amcyan,BV510（405nm)紫色激光）空白 450/50 PacificBlue,BV421三角形 735780/60 APC-Cy7（633nm红色激光）685空白可选框 空白 660/20 APC 检测指标：CD3，CD4，IFN-r，IL-4 Foxp3，CD25，IL-17APanel：IndexFluoresceinCD3BV510CD4PerCP/Cy5.5CD25BV421FoxP3AF647IL-4PE-Cy7IFN-rFITCIL-17APELive/deadZombieNIRFixableViabilityKit10colorfullpanelexample指标荧光素CD3AF700CD4PE-Cy5CD8Qdot 605CD45RAPE-Cy7CD45ROAF488IL-4PEIFNgBV570IL-2APCIL-17aBV421第四步：查找&订购商业的荧光素抗体公司网站搜索：BioLegend：http:/ 非特异荧光信号的排除去除死细胞的干扰 死细胞因细胞膜已失去完整性，所以很容易与抗体结合，造成非常强的非特异性染色。一般来说，当细胞标本中的死细胞数目超过5%时，需重新采集标本，或使用“死细胞排除试剂盒”来排除死细胞的干扰。实验计划试剂选择（死活细胞检测）进行活细胞检测，无需细胞固定（如细胞分选）PI,或者7-AAD,或者 Zombie Aqua，Zombie NIR,Zombie Yellow先固定细胞，在进行流式抗体染色Zombie Aqua，Zombie NIR,Zombie Yellow先进行流式抗体染色，再固定细胞Zombie Aqua，Zombie NIR,Zombie Yellow做胞内流式检测Zombie Aqua，Zombie NIR,Zombie YellowTruStainFcX(anti-mouseCD16/32),#101319humanTruStainFcX,#422301去除非特异荧光信号 FcR 封闭如：单核细胞，B细胞，DC细胞，NK，巨噬细胞，粒细胞，肿瘤细胞等高表达 FcR，在检测这些细胞时，会出现假阳性或假阴性的结果：样本管样本管加入正常抗体加入正常抗体同型对照同型对照加入同型抗体加入同型抗体阴性对照阴性对照加加PBS抗体抗体FCFC段非特段非特异性结合位点异性结合位点（普遍存在）（普遍存在）检测抗原位点检测抗原位点荧光组成荧光组成1 1、细胞自发荧光、细胞自发荧光2 2、非特异性标记荧光、非特异性标记荧光3 3、特异性标记荧光、特异性标记荧光荧光组成荧光组成1 1、细胞自发荧光、细胞自发荧光2 2、非特异性标记荧光、非特异性标记荧光荧光组成荧光组成1 1、细胞自发荧光、细胞自发荧光对照的设置同型对照u 为什么要设同型对照?用于消除由于抗体非特异性结合 到细胞表面的Fc受体及静电结 合而产生的背景染色.u 如何选择同型对照?与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度例如例如:标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应选用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1-FITC和IgG2a-PE.FMO对照及门的设置FullpanelIFNgunstimFMOIFNgBV570FullpanelIL-2unstimFMOIL-2APCFullpanelIL-4unstimFMOIL-4PEFullpanelIL-17aunstimFMOIL-17aBV421AntibodyCloneDilutionIL-17aBV421BL1681:50Live/DeadAquaIFNgBV5704S.B31:20CD8QD605LT81:100IL-4PEMP4-25D21:5CD45ROAF488UCHL11:5CD45RAPE-Cy7HI1001:10CD4PE-Cy5RPA-T41:5IL-2APCMQ1-17H121:10CD3AF700UCHT11:50 FMO 荧光扣除对照（Fluorescence Minus One）荧光补偿调节荧光溢出CD44 PE-Cy5 补偿微球CD44 PE-Cy5 单荧光对照?补偿对照:细胞 vs.补偿微球荧光补偿调节足够大的电压，才能将阴性阳性区分开如果电压过高，不但不能得到更好的结果，反而会加大背景噪音补偿是受电压影响的，电压不同，补偿会不同PESSC电压PMT 电压荧光补偿调节例如：FITC 与 PE 荧光补偿的调节从PE通道中去除FITC的荧光信号：1.检测两管样品：空白管;FITC 单标管 2.调节补偿（PE-%FITC),使得两群 细胞 FL2的Mean值相同相同的Mean值荧光补偿调节例如：FITC 与 PE 荧光补偿的调节从FITC通道中去除PE 的荧光信号：1.检测两管样品：空白管;PE 单标管 2.调节补偿（FITC-%PE),使得两群 细胞 FL1的Mean值相同相同的Mean值补偿不足及过补偿补偿不足过补偿FITCPEEmail: