Agela液相色谱技术介绍色谱柱使用.pptx

提高分离度R，需要分别增大n，k值n：柱效，易受柱长、填料粒径的影响：选择性，易受流动相和固定相影响；k：保留因子，受固定相和流动相的影响色谱分离基本方程色谱分离基本方程HPLC柱的“色品”表达式第1页/共49页柱效（柱效（n）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响以上两张谱图k,值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。“高富帅”第2页/共49页分离选择性（分离选择性（）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响 =1.04 =1.35 =1.50 改变分离选择性改变分离选择性的方法的方法 改变固定相固定相 改变流动相pH值值 改用不同的流动相流动相 改变柱温 第3页/共49页容量因子（容量因子（k）对分离度（）对分离度（R）的影响）的影响容量因子大于容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析时间将大大的改变不大，而分析时间将大大延长。因此，延长。因此，k的最佳范围是的最佳范围是1k20。改变容量因子的方法有：改变容量因子的方法有：减小柱死体积减小柱死体积改变柱温改变柱温改变流动相的配比改变流动相的配比梯度洗脱梯度洗脱第4页/共49页 k N 如何控制分辨率?第5页/共49页 影响色谱柱性能的因素影响色谱柱性能的因素6色谱柱与色谱填料的特性色谱柱与色谱填料的特性1、柱填料柱填料 硅胶纯度 粒径（及粒径分布）比表面积 孔径2、色谱柱的构型色谱柱的构型 色谱柱直径 色谱柱长度3、固定相固定相 键合类型 残余硅羟基的影响 反相键合相的保留行为 键合硅胶的稳定性物理因素物理因素化学因素化学因素第6页/共49页AggregationPolymerization堆砌法硅胶 Innoval、UHP、Bonshell 优点：高机械强度，耐污染共聚法硅胶 Venusil、Durashell 优点：分离效果佳 硅胶制作工艺硅胶制作工艺第7页/共49页硅胶基质反相色谱分离三要素固定相流动相反相作用氢键作用弱离子交换作用反相作用氢键作用弱离子交换作用-R-OH-O-H+甲醇/乙腈水缓冲盐溶液目目标物物A、B疏水部分（链烃和芳香烃）羟基、氨基离子化基团第8页/共49页109876543210pHk2486弱碱弱碱弱酸弱酸pH=pKOR C O HOR C OpH对分离的重要影响对分离的重要影响调节调节ph值对样品的值对样品的分离非常有效分离非常有效第9页/共49页色谱柱固定相稳定性色谱柱固定相稳定性400-6068-099 第10页/共49页400-6068-099 Agela 色谱柱最佳色谱柱最佳pH适用范围适用范围第11页/共49页中等中等pH下使用下使用 C18Venusil MP C18(2),孔径孔径110特点：亲水性、通用性、特点：亲水性、通用性、良好分离能力良好分离能力第12页/共49页双层表面处理技术减低硅胶表面硅羟基的活性第13页/共49页中等中等pH下良好的分离能力下良好的分离能力色谱柱：C18，5m，4.6250mm，样品：吗啡、可待因，脱氢吗啡的分离，流动相:乙腈-25 mM乙酸钠缓冲液（pH 3.5）=10：90，色谱柱A，硅羟基硅羟基pH=3.5流动相pH=3.5，未能抑制硅羟基的活性二次保留严重Venusil MP C18（2），硅羟基硅羟基pH=5.2流动相pH=3.5，能充分抑制硅羟基的活性抑制了二次保留效应400-6068-099 第14页/共49页100%水流动相的兼容性 样品：尿苷色谱柱：4.6*150mm,5m流动相：100%水流速：1mL/min温度：30第15页/共49页MP C18(2)pH2.6MP C18(2)pH5.8Atlantis T3 pH2.6Atlantis T3 pH5.8碱性化合物阿米替林在不同碱性化合物阿米替林在不同pH下保留时间的变化下保留时间的变化第16页/共49页YMC ODS-AQ pH2.6YMC ODS-AQ pH5.8Hydro RP pH5.8Hydro RP pH2.6第17页/共49页中等中等PH值范围，碱性化合物没有三乙胺添加剂也可提供更好的峰型值范围，碱性化合物没有三乙胺添加剂也可提供更好的峰型第18页/共49页耐污染，高寿命，高耐受性的XBP C18(L)孔径：150杂质不易进入空隙而强保留表面积减小，减小极性小物质的保留时间色谱柱：5m，4.6250mm；样 品：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄甲醚；流动相：甲醇:0.1%磷酸=80:20；波 长：254 nm；柱 温：室温；流 速：1.0 mL/min第19页/共49页高高pH值流动相优势值流动相优势流动相pH对RPC保留的影响与样品类型（酸、碱、中性）的关系色谱柱：4.6*250mm，5m，C18，流动相：0.025M磷酸盐、40%甲醇；样品：1 水杨酸；2 苯巴比妥；3 非那西丁；4 尼古丁；5 甲基丙苯丙胺400-6068-099 第20页/共49页核心技术-表面杂化技术n 宽泛的pH使用范围(2.0-12.0)n 低硅羟基活性n 高pH下拥有良好的寿命n 对碱性化合物有很大的载样量，适用于制备Durashell 液相色谱柱：液相色谱柱：Durashell C18，C18(L)，C8第21页/共49页高高pHpH条件首选条件首选 老化条件老化条件流 动 相：甲醇:pH=12 三乙胺溶液=40:60流 速：1.0 ml/min;柱 温：40;色谱柱：4.6150；5m；200 测试条件测试条件流 动 相：甲醇:水=85:15流 速：0.8 ml/min检测波长：254 nm;柱 温：30;进 样 量：1L色谱柱：4.6150；5m；200 样 品：尿嘧啶、苯酚、硝基苯、萘250 h后初始：0h第22页/共49页强酸下使用的ASB C18色谱柱R=异丙基，异丙基，防止键合相流失防止键合相流失优势 适用于适用于pH 0.8-4的流动相的流动相使得对pH较敏感的分离得到优化极低pH有较好的柱效和使用寿命第23页/共49页酸性条件下的良好寿命酸性条件下的良好寿命第24页/共49页酸性条件分离酸性物质酸性条件分离酸性物质第25页/共49页 亲水作用液相色谱柱亲水作用液相色谱柱Venusil HILIC第26页/共49页与被分析物极性基团相互作用：与被分析物极性基团相互作用：增加极性化合物的保留与硅胶表面残余硅羟基相互作用：与硅胶表面残余硅羟基相互作用：改善拖尾，改善极性化合物的峰型，提高分离效率；分离机理分离机理反相液相色谱（RPLC）是最广的色谱分离技术，可解决多种分析应用问题，但对某些分析物，特别是极性和亲水性化合物却无法或很少保留。长期以来，人们采用正相液相色谱(NPLC)，并使用不利环保的非水溶性流动相如己脘或环己脘来分析这些物质。但是在这种实验条件下，很多极性和亲水化合物往往很难溶解，从而限制了NPLC的应用范围。从现在起有了另一种新的解决办法，即选用亲水作用液相色谱-HILIC。第27页/共49页Venusil HILIC色谱柱：色谱柱：益母草中盐酸水苏碱的测定（中国药典益母草中盐酸水苏碱的测定（中国药典2010版修订品种）版修订品种）对照品：理论板数（22757）、对称性（0.94）供 试 品：理 论 板 数（17400）、对 称 性（0.80）色谱柱：色谱柱：Venusil HILIC柱柱(丙基酰胺键合硅胶丙基酰胺键合硅胶)，100，4.6250mm，5m流动相：乙腈-0.2冰醋酸溶液（80:20）；流 速：0.5 ml/min检 测：蒸发光散射检测器（ELSD）；进样量：20l；柱 温：20盐酸水苏碱第28页/共49页葡萄糖分析葡萄糖分析流动相：乙腈水（8020）流 速：1ml/min柱 温：30检测器：蒸发光散射检测器-D-葡萄糖-D-葡萄糖氨基柱：氨丙基键合硅胶Venusil HILC：丙基酰胺键合硅胶第29页/共49页分离水溶性维生素分离水溶性维生素Time样品样品:VB1,VB6,VC,VB2色谱柱色谱柱:Venusil HILIC 4.6 x 150 mm,5um流动相流动相:0.1%TFA:ACN=90:10流速流速:1.0mL/min;检测波长检测波长:280nm;Temp:30；第30页/共49页地西他滨和杂质的分离地西他滨和杂质的分离色谱柱:Venusil HILIC 4.6150mm,5m，流动相:ACN:H2O96:4;1ml/min;UV:244nm;room temp第31页/共49页Agela 极其丰富的键合相极其丰富的键合相各种专用柱（阿奇霉素专用柱、左卡尼丁专用柱、糖柱）定制色谱柱（期待与您合作，开发属于您的专用柱）第32页/共49页 超高效液相色谱技术UHPLC 色谱柱/Core-shell 色谱柱第33页/共49页 UHPLC色谱柱1.9m粒径：比1.7m压力低，耐污染耐压800bar键合相：UHP ASB C18 UHP AQ C18 UHP C18第34页/共49页 Bonshell填料技术 内部为1.7 um实心球 外部为0.5 um多孔外壳耐污染耐污染:粒径大同时物质不会进入硅胶实心球内部造成堵塞，较全多孔颗粒寿命更长。耐高压耐高压:1.7 um实心球较普通3 um硅胶更高的耐压性，耐压到 800bar(12000 psi),为高流速分离提供支持。第35页/共49页填料粒径对色谱柱柱效的影响第36页/共49页保持与1.9m色谱柱相同分离速度和效果，却维持较低的系统压力第37页/共49页Bonshell-缩短了保留时间缩短了保留时间样品:太古霉素5m传统C18,流速:1.0mL/min 2.7m Bonshell ASB C18 流速:2.5mL/min 第38页/共49页流动相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254 nm流速:1.0 mL/min.30C进样量:5 L响应时间:4.0秒响应时间:2.0秒响应时间:1.0秒响应时间:0.5秒响应时间:0.1秒1.尿嘧啶2.乙酰水杨酸3.N-乙酰苯胺1.Uracil2.Acetylsalicylic acid3.Acetanilide缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）检测器的响应时间对分离度的影响在检测器的响应时间对分离度的影响在UHPLC上值得重视上值得重视第39页/共49页HPLC色谱柱的日常保养与维护第40页/共49页新HPLC色谱柱的使用1.查看说明书，确定新色谱柱的保存溶剂(氨基柱，HILIC等)2.确定与检测所需流动相是否互溶3.使用互溶溶剂过渡，正反相溶剂过渡使用异丙醇4.流动相含有盐使用90%甲醇水过渡5.使用检测流动相平衡色谱柱10-20倍柱体积6.色谱柱使用后的保存溶剂（正相建议同说明书，反相纯乙腈或纯甲醇）强烈建议进行色谱柱使用分类（由样品类型来归类）第41页/共49页色谱柱不锈钢毛细管接头如果伸出的管线长度过长，可能漏液如果伸出的管线长度过长，可能漏液 螺母坡度不匹配，密封性差螺母坡度不匹配，密封性差 死体积区死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积第42页/共49页0.13mm内径(红)用于毛细管HPLC中2.1内径色谱柱0.18mm内径(黄)用于分析型HPLC中2.14.6内径色谱柱0.25mm内径(蓝)用于半制备型HPLC中10.0内径色谱柱0.5mm内径(橙)用于制备型HPLC中21.2内径色谱柱PEEK连接管线与接头色谱柱:4.6 x 30 mm,3.5 mm 流动相:85%H2O with 0.1%三氟乙酸 :15%ACN 流速:1.0 mL/min 温度:35C50 mL 柱外体积（管线）4321Time(min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.010 mL 柱外体积Time(min)0.0 0.5 1.0 1.5 2.04321样品:1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe 4.天冬甜素第43页/共49页色谱柱柱内体积和平衡时间4.6 x 500.5 mL5 min4.6 x 1501.5 mL15 min4.6 x 2502.5 mL25 min 2.1 x 300.06 mL3 min36 sec2.1 x 500.10 mL5 min60 sec2.1 x 1000.20 mL10 min120 sec色谱柱柱内 平衡时间 尺寸体积 流速(mm)(Vm)1.0 mL/min色谱柱柱内 平衡时间 尺寸体积 流速(mm)(Vm)0.2 mL/min 1.0 mL/min第44页/共49页颗粒物堵塞筛板引起柱压上升颗粒物来源：样品离心，过0.45m或0.22m滤膜，注意滤膜性质泵和进样阀密封圈磨损更换配置流动相过0.45m或0.22m滤膜，注意滤膜性质缓冲盐析出注意梯度运行和进样时盐的溶剂环境改变，甲醇对缓冲盐溶解性高于乙腈流动相滋生细菌现用现配（特别是buffer水溶液），冰箱保存第45页/共49页化学污染物污染填料化学污染来源主要是样品：分子量很大的化合物、盐类、脂质、蜡类、油脂、腐殖酸、蛋白质等其它生物来源的物质污染性：生物样品、发酵液颗粒剂、注射液胶囊柱头累积：柱压升高 峰拖尾或峰分叉 污染物作为新固定相对分析物起作用，引起保留时间改变化学污染主要累积在柱头第46页/共49页物理与化学污染的预防采用SPE固相萃取连接保护柱：保护柱是分析柱的延伸，在填料类型和粒径上应于分析柱一致，才能最大限度起保护作用，又不影响色谱性能。一个设计和装填良好的保护柱，还可增加分析柱的分离效率。如果因某种原因需在保护柱中用不同的填料，也应选择比其所保护的分析柱保留能力弱的固定相，这时的保护柱完全用于截住强保留物质第47页/共49页清洗液相色谱柱反相色谱柱：用以下溶剂至少各冲洗10-20倍柱体积不含缓冲盐的流动相100%甲醇100%乙腈75%乙腈+25%异丙醇100%异丙醇(粘度大，注意压力)100%二氯甲烷 100%正己烷100%异丙醇不含缓冲盐的流动相正相色谱柱：用以下溶剂至少各冲洗10-20倍柱体积100%异丙醇50%甲醇+50%三氯甲烷100%乙酸乙酯100%丙酮不建议反冲色谱柱系统中固体颗粒再次污染，正冲堵塞流通池柱床变得不稳定，可能永久破坏色谱柱第48页/共49页谢谢谢谢!第49页/共49页