广西巴马小型猪NLRP6基因的克隆、生物信息学及组织表达分析.pdf

-106-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期广西巴马小型猪NLRP6基因的克隆、生物信息学及组织表达分析江 山，张 帅，张 坤，许 迪，颜 港，邢天琦，王钰滨，王梦影，兰干球*，梁 晶*（广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004）摘 要：为探究 NLR Family Pyrin Domain Containing 6（NLRP6）在广西巴马小型猪的蛋白结构和组织表达水平，本实验以巴马小型猪为材料，通过克隆获取了NLRP6的 CDS 序列全长，并进行生物信息学和组织表达谱分析，同时采用 qRT-PCR 分析NLRP6基因在不同组织的表达分布情况。结果显示，NLRP6基因的 CDS 序列全长为 2 640 bp，编码 879 个氨基酸。生物信息学分析表明，NLRP6 蛋白分子式预测为C4294H6958N1234O1272S37，等电点为 8.12，为亲水性碱性蛋白质。经氨基酸序列比对和物种进化树分析发现，广西巴马小型猪NLRP6基因与猪的遗传距离最近，其次是牛，与小鼠的遗传距离最远。qRT-PCR 结果表明，NLRP6基因在肾脏组织表达最高，同时在小肠部位具有很高的表达水平，但在心脏和肌肉组织中表达量极低。本研究结果为进一步研究猪NLRP6基因提供了理论参考。关键词：NLRP6基因；抗菌功能；肠道中图分类号：S828 文献标识码：A DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20221101-04我国是养殖大国，生猪养殖作为民族产业，有力地维持着国民经济的正常运转1。2020 年以来，国家大力推行畜禽饲料禁止添加抗生素的政策，我国的畜禽业迈入了绿色发展的高速通道2。肠道健康一直是生猪产业发展的焦点，通过人为营养调控的方法，能够改善肠道菌群结构和免疫功能，增强消化肠道维持微生态平衡的能力，以此提高肠道的消化吸收效率，有效地提高了生产性能和减少肠胃疾病的发生3。猪的胃肠道定居着多种肠道菌群，它们参与体内的代谢调控，对成长阶段的猪在健康方面发挥着举足轻重的作用4-5。NLRP6最早由 Grenier 等6提出，NLRP6炎症小体广泛分布在肠道组织，可识别检测到多种来自肠道内部的危险信号，与众多下游信号通路关联，进而调控肠道的黏膜结构和微生态平衡7。寻找新型抗生素替代物是当今养殖生产刻不容缓的话题，抗菌肽以其独有的抗菌功能和耐药性引起了大家的广泛关注。目前关于NLRP6基因的研究主要集中在人类医学上，动物生产上的相关研究较少8-9。广西巴马小型猪作为广西地区的地方品种，毛色亮丽，肉质鲜美，具有广阔的市场前景。本研究通过对广西巴马小型猪NLRP6基因进行克隆，并进行生物信息学分析，对该基因在猪的不同组织表达情况进行分析，为进一步研究猪NLRP6基因的生物学功能提供理论基础。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 在广西大学巴马小型猪繁育中心随机选取 20 头 6 月龄健康正常的广西巴马小型猪公猪，取其心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、空肠、回肠、盲肠、直肠、结肠和十二指肠等 13 个组织备用。1.1.2 实验试剂 琼脂糖购自广西南宁市天地扬生物科技有限公司；Trizol 试剂、Taq Master Mix 酶、DL5000 DNA Marker 均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公收稿日期：2022-11-01；修回日期：2022-12-23资助项目：现代农业广西创新团队生猪首席专家（C334005 1510）；广西创新驱动发展专项（桂科 AA17204029）；广西科技重大专项（桂科 AA17292002）作者简介：江山（1998-），男，湖北恩施人，硕士，研究方向为猪遗传育种，E-mail：*通讯作者：兰干球（1963-），男，广西来宾人，博士，教授，主要从事猪遗传育种研究，E-mail：；梁晶（1989-），男，安徽淮北人，博士，助理教授，主要从事猪遗传育种研究，E-mail：-107-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 司；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，Code No.RR047A）购自 TaKaRa 公司。1.2 实验方法1.2.1 引物设计及合成 根据 GenBank 网站中猪NLRP6基因预测序列（登录号：XM_021082529.1）利用 Oligo7.0软件设计克隆和定量引物，同时设计GAPDH（登录号：NM_001206359.1）的定量引物（表 1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2.2 RNA 提取及 cDNA 合成 将广西巴马小型猪的13 个组织用 Trizol 法提取 RNA，操作严格参照试剂说明书的方法进行。并用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA，分析 RNA 的完整性和降解程度，-80保存。使 用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒逆转录合成 cDNA，-80保存。1.2.3 NLRP6基因克隆 以广西巴马小型猪的 13 个组织 cDNA 为混池进行 PCR 扩增。反应体系 10 L：2Rapid Taq Master Mix 5 L，上下游引物（10 mol/L）各 0.4 L，ddH2O 3.2 L，cDNA 模板 1 L。反应程序：95预变性 5 min；95变性 15 s，59.7退火 15 s，72延伸 10 s，共 40 个循环；72终延伸 5 min。将带有目的基因的 PCR 扩增液送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.2.4 生物信息学分析 测得的序列利用 SeqMan 进行拼接；采用 DNAStar10.0 软件中的 MegAlign 比对广西巴马小型猪NLRP6基因与其他物种的同源性并构建进化树；运用 ProtParam、ProtScale 和 SignalP 5.0 进行理化性质、亲疏水性和蛋白信号肽分析，通过 TMHMM server 2.0、Prabi SOPMA 和 SWISS-MODEL 在线软件预测广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白跨膜结构、二级结构及三级结构。采用 STRING 10.0 和 SMART 在线软件分别进行 NLRP6 编码蛋白互作预测和结构分析。1.2.5 NLRP6基因组织表达分析 以广西巴马小型猪 13个组织反转录的 cDNA 为模板，通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测NLRP6基因的表达情况，相对表达以GAPDH作为内参基因。qRT-PCR 反应体系 10 L：上、下 游 引 物 各（10 mol/L）0.4 L，2Taq Master Mix 5L，ddH2O 3.2 L，cDNA 1L。反 应 条 件 为：95，30 s；95，5 s；60，30 s；38 个循环。1.2.6 数据分析 本实验采用相对定量法，运用 2-CT的方法计算基因在各组织中的相对表达量，并使用SAS 9.2软件进行单因素方差分析，P0.05 为差异显著。运用Graphpad Prism 8.0 进行可视化。2 结 果2.1 NLRP6基因克隆 PCR 产物通过 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果在 2 711 bp 处有一条明亮的条带（图 1），与预期结果一致，说明在广西巴马小型猪上成功克隆出了NLRP6基因。用 SeqMan 软件对测序序列进行剪切比对，获得了NLRP6的 CDS 全长 2 640 bp，编码 879个氨基酸。2.2 广西巴马小型猪NLRP6基因生物信息学分析2.2.1 同源性分析及进化树构建 使用 DNAStar 软件将测序结果与 GenBank 上已有的 7 条不同的NLRP6基因编码的氨基酸序列进行同源性比对（图 2），并据此构建系统发育树（图 3）。结果表明广西巴马小型猪与猪的参考序列一致性最近，其次是牛，与小鼠的遗传距离最远。广西巴马小型猪NLRP6基因编码的氨基酸序列与 GenBank 上猪（Sus scrofa，登录M：DL5000 DNA Marker；1：NLRP6。图 1 广西巴马小型猪NLRP6基因 PCR 扩增结果表 1 引物序列信息及合成用途引物序列（53）长度,bp最适温度,用途NLRP6F:GTAGAGCGCTACCCAGCTTT;R:AATGGAGCCCTCCCAGGTT271159.7普通 PCRq-NLRP6F:CTGCAAACCCTCAGGCTAAC;R:TCGTGTGTGATGACCAGTCC10160.0实时荧光定量 PCRq-GAPDHF:CAGGTTGTGTCCTCTGACTT;R:ACCCTGTTGCTGTAGCCAA13460.0实时荧光定量 PCR1MNLRP65000 bp3000 bp2000 bp1500 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp-108-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期号：XM_021082529.1）、狗（Canis lupus，登录号：XM_038423977.1）、大鼠（Rattus norvegicus，登录号：NM_134375.5）、小鼠（Mus musculus，登录号：NM_133946.2）、人（Homo sapiens，登录号：NM_001276700.2）、黑猩猩（Pan troglodytes，登录号：XM_016919943.2）、猕 猴（Macaca mulatta，登 录 号：NM_001114114.1）、牛（Bos taurus，登录号：XM_002683733.6）的一致性依次是 99.8%、75.4%、71.7%、70.2%、77.7%、77.9%、77.4%和 79.8%。2.2.2 NLRP6 蛋 白 理 化 性 质 分 析 广 西 巴 马 小 型 猪NLRP6基因编码蛋白分子式为 C4294H6958N1234O1272S37，原子总数 13 796，理论等电点（PI）为 8.12，表明该蛋白为碱性蛋白，不稳定系数为 53.23，脂溶指数为92.95，亲水性平均系数（GRAVY）为-0.251。氨基酸组成分析发现（表 2），天冬酰胺（Asn）和色氨酸（Trp）含量最低为 0.5%，亮氨酸（Leu）含量最高（15.5%）；不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸，带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）共 111 个，占比为 12.6%；而带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）共 116 个，占比为 13.2%。如果所有的半胱氨酸（Cys）残基都形成胱氨酸，NLRP6蛋白水溶液在 280 nm 处的消光系数为 50 570；假设所有的 Cys 残基都被还原，其水溶液在 280 nm 处的消光系数则为 48 820。该多肽链总平均亲水性为-0.578，属于亲水性蛋白质（图 4）。图 4 广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白质亲/疏水性分析表 2 广西巴马小型猪 NLRP6 氨基酸种类及组成 图 3 广西巴马小型猪NLRP6基因序列的系统进化树图 2 8 个物种的NLRP6基因编码的氨基酸序列同源性比对结果图人Homo sapiens NM_001276700.2 黑猩猩 Pan troglodytes XM_016919943.2 猕猴 Macaca mulatta NM_001114114.1 大鼠 Rattus norvegicus NM_134375.5 小鼠 Mus musculus NM_133946.2 广西巴马小型猪 Guangxi bama mini pig 猪 Sus scrofa XM_021082529.1牛 Bos taurus XM_002683733.6 狗 Canis lupus XM_038423977.1广西巴马小型猪 Guangxi bama mini pig 猪 Sus scrofa XM_021082529.1 狗 Canis lupus XM_038423977.1大鼠 Rattus norvegicus NM_134375.5 小鼠 Mus musculus NM_133946.2 人Homo sapiens NM_001276700.2 黑猩猩 Pan troglodytes XM_016919943.2 猕猴 Macaca mulatta NM_001114114.1 牛 Bos taurus XM_002683733.6氨基酸数量,个占比,%氨基酸数量,个占比,%Ala（A）869.8Lys（K）424.8Arg（R）748.4Met（M）80.9Asn（N）40.5Phe（F）303.4Asp（D）354.0Pro（P）515.8Cys（C）293.3Ser（S）586.6Gln（Q）536.0Thr（T）374.2Glu（E）768.6Trp（W）40.5Gly（G）596.7Tyr（Y）182.0His（H）151.7Val（V）495.6Ile（I）151.7Pyl（O）00.0Leu（L）13615.5Sec（U）00.0相似性差异度123456789199.875.471.770.277.777.977.479.8120.275.671.970.377.978.277.680.12329.829.569.768.274.875.573.674.83435.535.138.784.873.473.872.970.24537.937.741.317.071.872.371.667.65626.626.230.732.935.398.594.775.66726.225.929.732.334.61.594.675.97827.026.732.633.735.65.55.675.38923.523.230.738.042.429.629.129.9912345678927.525 20 15 10 5 0Hphob./Kyte&Doolittle分值位置3210-1-2-3-40 100 200 300 400 500 600 700 800-109-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 2.2.3 NLRP6 蛋白跨膜结构、信号肽预测 分析广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白跨膜结构（图 5）和信号肽（图 6），结果表明该蛋白不含跨膜结构和信号肽。2.2.4 NLRP6二级结构和三级结构预测 Prabi SOPMA软 件 分 析 该 蛋 白 含 有-螺 旋（54.04%）、-折 叠（8.08%）、-转角（4.55%）和无规则卷曲（33.33%）等 二 级 结 构（图 7）。用 SWISS-MODEL 软 件 预 测NLRP6蛋白三级结构，其结构以无规则卷曲为主（图8）。2.2.5 NLRP6 编码蛋白互作蛋白和结构分析 STRING 预测分析与NLRP6基因编码蛋白的互作蛋白（图 9），主要有 CNPY3、DDX21、DHX15、ASC、MEPV、IL-18、NLRC4、CASP1、NLRC5、ENSSSCP00000026110。SMART 预测发现，第 889 个氨基酸有一个热蛋白结 构 域，第 154165、第 304320、第 340351、第593615 和第 219（重复没有显示）共 5 个低复杂区，第 714741、第 742769 和 798825 共有 3 个富亮氨酸的重复序列（图 10）。2.3 广西巴马小型猪NLRP6的组织表达分析 选取广图 8 广西巴马小型猪 NLRP6 三级结构预测图 7 广西巴马小型猪 NLRP6 二级结构预测图 6 广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白信号肽预测图 5 广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白跨膜结构预测MEPLAAAARELLLVALEDLSQEQLKRFCHKLRDAPLDGRSIPRGRLEGSDAVDLAEQLIHFYGPELALEVh h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c h h h h h h h h h h h c c c t h h h h hARKTLKRADVRDVAAQLKEQQLQRLGPRSSALLSASEYKKKYREHVLRQHAKVKERNARSVKISKRFTKVh h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h c c c c c c t t c h h h h h h h h h h e e e e h c c c c c cLIAPETLEHRTLGPAEEPEPERARRSDTHTFNRLFSRDAEGQRPLTVVLQGPAGIGKTMAAKKILYDWAAc c c h h h h h h h h h h h h h h h h c c c c c c c c h h h h h h e e c c c c c c c c c c e e e e e c c t t c c c h h h h h h h h h h h h tGKLYHGQVDFAFFMPCRELLERSGTCSLADLILEQCPDRSAPVPQILAQAERLLFILDGVEELPAPGPSEt c c c h t t h e e e e e e c h h h h h h h h h h h h h h h h h h h c c c c c c c c h h h h h c c t t h e e e e e c c c c h h c c c c c c cAVPCTDPLEAASGARVLGGLLSKVLLPAARLLVTTRAAAPGRLQGRLCSPQCAEVCGFSDKDKKKYFYKFc c c c c c c c c c c c c h h h h h h h h h h t c c c c c e e e e e c c c c c h h h h h h h h c c c c h h h e e e c c h t t h h h h h h h hFRDERRAEQAYRFVKENETLFSLCFVPFVCWIVCTVLRQQLELGQDLSRTSKTTTAVYLLFVASFLSSAPh c c t h h h h h h h h h h h t t c c e e e e e c c c c e e e e h h h h h h h h h c t t c c c c c c c c c h h h h h h h h h h h h c c c c cAADGPQLQDELRKLCRLACEGVLGRRAQFSQKDLERLELLHSQVQTPFLSKKELPGVLETEVTYQFIDQSc c c c c c c h h h h h h h h h h h h t t c c h h h e e e c h h h h h h t t c c c c c h h h h h h h h h h c c c c c c c c c h e e e h h h hFQEFFAALSYLLEDEGSPRAPAGGVGALLRGDAEPRCHLALTTRFLFGLLSAERMRDIERHLGCSVSKRVh h h h h h h h h h e e c c c c c c c c c h h h h h h h h h h h c c c c c c h h h h h h h h h h h c c h h h h h h h h h h h h h h c c h h hKQDVLRWVQEQGQGCPRAGPEGTKETQALQGAEEPEEEEDEELSYPLELLYCLYETQEEAFVRQALRGLPh h h h h h h h h h h h c c c c c c c c c c c c c c c h h h t c c c c h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h c c c h h h h h h h h h h h hELALERVHFSRMDLAVLSYCIRCCPVGQALRLDSCRLAIRQEKKKKSLVKRLQGSLGGSASRATVRKPLGh h h h h h c c c c c h h h h h h h e e e h c c c c h h h e e e h h c c c c c c l h h h h h h h h h c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c cSPLRPLCEAMVDQQCGLSSLTLSHCKLPDSVCGDLSEALRKAPALTELGLLHNGLSEAGLRALSEGLAWPc c h h h h h h h h h c c c c c c h h h e c c c c c c c h h h h h h h h h h h h t t t c h h h e e h c c c c c c h h h h h h h h h h h c c tECQVQTLRMQQPGLQGTPQYVAGLLQHSPALATLDLSGCQLSERMVTYLCAALRYPGCRLQTLRLTSVELt c c h h h e e c c c c c c h h h h h h h h h h h h c c c c h e e e e h c c c c c c h h h h h h h h h h h c c t t c h h h h e e e c c t h cSERSLQELQAVGTAKPGLVITHEALGSRPKPPEGFDSALc h h h h h h h h h h h h t c c h e e e e e h c c c c c c h t t h h h h h h h概率1.210.80.60.40.20100 200 300 400 500 600 700 800transmembraneinsideoutsideSP(Sec/SPI)CSOTHERProbability0.80.40MEPLAAARELLLVALEDLSQEQLKRFCHKLRDAPLDGRSIPRGRLEGSDAVDLAEQLIMFYGPELALEVXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXProtein sequence0 20 40 6010 20 30 40 50 60 70-110-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期西巴马小型猪的 13 个组织来进行NLRP6基因表达水平的比较分析。以肌肉NLRP6基因表达量作为基准，绘制相对表达变化柱形图（图 11），NLRP6基因在肾脏组织中表达量最高，在心脏和肌肉中几乎不表达，NLRP6基因在 6 个肠道组织中均具有较高的表达水平，同时，在小肠组织中的表达水平明显高于其在大肠组织中的表达水平。3 讨 论本实验预测出NLRP6在第 889 个氨基酸有一个热蛋白结构域，第 714741、第 742769 和 798825共有 3 个富亮氨酸的重复序列，与高小强等10研究结果相似。NLRP6属于胞浆内 NOD 样受体家族，其编码基因位于人 11 号染色体，位于鼠的 7 号染色体，而本研究中的NLRP6基因位于猪的 2 号染色体。NLRP6通过多通路维持肠道平衡，肠道代谢产物可以激活NLRP6，促进 IL-18 的分泌11，从而增加抗菌肽的表达量来清除病菌，还可以抑制 IL-22 结合蛋白的表达，增强 IL-22 参与 DNA 损伤修复的相关信号通路12；同时参与 Toll 样受体介导的肠黏膜黏液的分泌，肩标不同字母表示表示差异显著（P0.05）。图11 广西巴马小型猪NLRP6基因在不同组织中的相对表达量图 10 广西巴马小型猪 NLRP6 编码蛋白结构域预测图 9 广西巴马小型猪 NLRP6 编码蛋白互作蛋白预测 通过抑制杯状细胞 Notch 和 Wnt 信号通路，从而影响黏液的分泌13。NLRP6还参与 IL-6 信号通路，促进肠道上皮细胞的增殖14。NLRP6炎症小体在人和鼠的肝脏、肠道和肾脏等器官均有表达。在人体中，NLRP6炎症小体主要表达于十二指肠、空肠和回肠15，Gremel 等16研究发现人体NLRP6主要在小肠部位表达，这与本文的研究结果相同。而在小鼠中，NLRP6炎症小体在小肠和大肠中都有一定表达17。NLRP6可在小鼠各器官表达，如膀胱、肾脏、肝脏、肺、十二指肠、回肠、盲肠和结肠等，其中在结肠肌成纤维细胞表达最高，其次为结肠上皮细胞、肝细胞、CD4+T 细胞、树突状细胞、CD8+T 细胞、肥大细胞，此外，在外周巨噬细胞亦有少量表达18，与本文研究结果相似。研究显示，在野生小鼠的 24 个组织中，NLRP6在肾脏、肝脏、肺和胃肠道中显示出高表达19，这与本文研究中NLRP6在肾脏和肠道中表达量高的结果相同。综上所述，NLRP6主要表达在人和小鼠的小肠和肾脏部位，且与机体的免疫机制有着非常紧密的联系20，该基因在猪上也可能存在相似的作用机制。本研究对广西巴马小型猪NLRP6基因编码蛋白进行初步生物信息学预测分析，但在猪生长阶段的具体机制还需要进一步研究。4 结 论本实验以广西巴马小型猪为材料，成功克隆出ENSSSCP00000026110CNPY3DDX21DHX15NLRP6CASP1NLRC5NLRC4IL-18MEPVASC0 100 200 300 400 500 600 700 800PYRINPYRINLRRLRRLRR十二指肠空肠回肠盲肠结肠直肠脂肪肌肉肾肺脾肝心相对表达量300002500020000150001000050000abcdeeefggghh-111-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 NLRP6基因，并根据编码序列进行了一系列生物信息学分析。由不同物种间NLRP6基因编码区序列对比结果可知，广西巴马小型猪NLRP6基因与猪进化关系最近，与小鼠进化关系最远。NLRP6基因高表达于肾脏组织中，同时在小肠中具有较高的表达水平。本研究结果为进一步研究猪NLRP6基因提供了理论参考。参考文献：1 胡伟,唐中林.加强生猪种业自主创新,助力养猪产业高质量发展 J.猪业科学,2022,39(11):33-36,4.2 樊梅娜,张国珍,孟洁,等.禁抗背景下益生菌制剂在畜禽养殖中的应用研究进展 J.广东饲料,2022,31(4):38-41.3 李燕中,王玥,张振奇,等.浅析微生物发酵饲料对猪肠道健康的影响 J.中国畜牧业,2022(14):52-53.4 Lin L,Zhang J Q.Role of intestinal microbiota and metabolites on gut homeostasis and human diseasesJ.BMC Immunol,2017,18(1):2.5 Yoon M Y,Yoon S S.Disruption of the gut ecosystem by antib-ioticsJ.Yonsei Med J,2018,59(1):4-12.6 Grenier J M,Wang L,Manji G A,et al.Functional screening of five PYPAF family members identifies PYPAF5 as a novel regulator of NF-kappaB and caspase-1J.FEBS Lett,2002;530(1-3):73-78.7 聂源,朱萱.NLRP6 炎症小体与肠道微生态研究进展 J.微生物学杂志,2021,41(3):113-119.8 杜江峰,吴瑶,向祥,等,脑出血患者血清中 miR331-3-p 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