固态发酵条件对纳豆激酶活性的影响及发酵条件的优化.pdf

粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工23年第48卷第5期粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工鄢基金项目：甘肃省大学生创新创业训练计划项目（S202210740101）收稿日期：2023-07-05作者简介：王刚（1970-），男，工程师，从事食品抽捡方面研究。通信作者：董瑞丽（1984-），女，高级工程师，从事食品检测工作。高慧娟（1977-），女，副教授，硕士，研究方向：食品微生物及发酵工程。纳 豆 激 酶(Nattokinase)来 源 于 传 统 发 酵 食品纳豆，纳豆中含有丰富的纳豆激酶，具有高效的溶栓作用1，很好的稳定性2，疗效不会受人体的胃肠等特殊环境影响。纳豆激酶在人体内的半衰期较长，无需大量服药，由于其特殊的溶栓机理3-4，病人固态发酵条件对纳豆激酶活性的影响及发酵条件的优化鄢王刚1,王芝玉2,安荣荣2,滕玉婷2,古梅2,刘霞2,高慧娟2,3,董瑞丽1（1.攀西钒钛检验检测院，四川 攀枝花617000；2.河西学院生命科学与工程学院，甘肃 张掖734000；3.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖734000）摘要：为获得在黄豆基质上生长良好的纳豆杆菌分泌的纳豆激酶最优的发酵条件，以A和B两种不同的纳豆芽孢杆菌为发酵菌种，在固体培养基上，在优化黄豆粉碎方式、纳豆杆菌接种量和发酵时间3个单因素条件下，通过BoxBehnken实验设计，优化纳豆激酶的发酵条件。结果表明，纳豆杆菌在黄豆固体培养的最佳发酵条件为：固体培养基于121，30 min灭菌，1/2粒黄豆上接种11%的纳豆杆菌，发酵45 h后，纳豆激酶酶活达到1 408 U/g，较未优化之前酶活提高了668U/g，说明通过优化发酵条件，可以提高纳豆激酶酶活。关键词：纳豆激酶；固体培养；酶活；黄豆；纳豆芽孢杆菌中图分类号：TS201.3文献标识码：A文章编号：1007-6395（2023）05-0033-05Effect of Solid Fermentation Conditions onNattokinase Activity and Optimization of Fermentation ConditionsWANG Gang1,WANG Zhiyu2,AN Rongrong2,TENG Yuting2,GU Mei2,LIU Xia2,GAO Huijuan2,3,DONG Ruili1(1.Panxi Vanadium and Titanium Inspection and Testing Institute,617000 Panzhihua Sichuan,China.2.Life Science&Engineering College,Hexi University,734000 Zhangye Gansu,China.3.Key Laboratory of Characteristic Resource Utilization in Hexi Corridor,Gansu Province,734000 Zhangye Gansu,China)Abstract：In order to obtain the optimal fermentation conditions for Bacillus natto and nattokinase that growwell on soybean substrate,two different Bacillus Natto strains,A and B,were cultured on soybean solid medium.Under the three single factors of optimized soybean comminability,inoculation amount of Bacillus natto and fer鄄mentation time,the Box-Behnken experiment was designed.The fermentation conditions of nattokinase were op鄄timized.The results showed that the optimum fermentation conditions of Bacillus natto in soybean solid culturewere as follows:After solid culture,1/2 soybeans were inoculated with 11%Bacillus natto for 30 min and steril鄄ized at 121.After 45 h fermentation,the activity of nattokinase enzyme reached 1 408 U/g,which was 688 U/ghigher than before,indicating that the activity of nattokinase enzyme could be improved by optimizing the fer鄄mentation conditions.Key words：Nattokinase,solid fermentation,enzyme activity,soybean,Bacillus Natto Strains服用后不会引发体内出血现象。由于目前市场上销售的溶栓剂如尿激酶、链激酶重组纤溶酶原激活剂等存在半衰期短、副作用大与价格昂贵等缺点5。纳豆激酶生产成本较低，安全性好，具有开发为新一代溶栓药物的潜力6。目前纳豆激酶的生产方法主要通过液体深层发酵等获得7。具有发酵周期短、易于控制发酵条件的优点，但是成本高，污染大，现在逐渐被固态发酵技术取代。固态发酵具有生产成本低、设备简单、产酶33粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工23年第48卷第5期粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工活力高、易推广的优点8。通过A、B两株纳豆芽孢杆菌在黄豆固体培养基产酶活性的研究，获得最佳发酵条件，旨在为固体发酵生产纳豆激酶提供一定的理论依据9。1材料与仪器1.1实验材料A、B纳豆芽孢杆菌均由河西学院生命科学与工程学院微生物实验室提供。1.2仪器及试剂1.2.1仪器HH-S28s恒温水浴锅，金坛市大地自动化仪器厂；V-1200型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；AL104电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；S70-CJ-18u洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；ZHWY-200B恒温培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；FSD-100SA型电动粉碎机，台州市新恩精密粮仪有限公司。1.2.2试剂酪蛋白分析纯（上海化学试剂厂），钨酸钠、铂酸钠、浓盐酸、硫酸锂、溴水、无水碳酸钠、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯。2实验方法2.1福林-酚试剂配制方法称 取50 g Na2WO42H2O、12.5 g Na2MoO42H2O，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加350 mL水、25mL85%磷酸、50 mL浓盐酸，文火微沸回流10 h，取下回流冷凝器，加50 g Li2SO4，25 mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15 min，驱除残余的溴，冷却，用水稀释至500 mL备用。2.2菌种活化将A、B两种纳豆芽孢杆菌粉接入新鲜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于38 恒温培养箱中培养24 h后，再转接至液体培养摇瓶中，在震荡培养箱38 培养24 h，配置为107CFU/mL的菌悬液，置于4 冰箱中备用。2.3纳豆制备工艺精选黄豆清洗浸泡高压蒸煮(121，30min)晾置接种发酵成熟纳豆精选黄豆。选用颗粒饱满、大小均匀、蛋白质含量高的市售黄豆。称重清洗。每份称取20 g，用清水冲洗。浸泡。用1.5倍的蒸馏水浸泡24 h，室温，沥干水分。灭菌。把浸泡好的不同粒度的大豆装入250 mL的锥形瓶，包扎，在121 下灭菌30min。接种。将灭菌的锥形瓶放在自然条件下晾置至30 左右，在无菌条件下接入纳豆杆菌，摇匀，使纳豆芽孢杆菌充分与黄豆接触。发酵。放入38 培养箱培养一定时间后，即为纳豆。2.4粉碎方式对纳豆激酶活性的影响精选黄豆，洗净、浸泡过夜，除去多余水份后，将黄豆的整粒、1/2粒、1/4粒、1/8粒和粉末50 g，分别置于250 mL的锥形瓶中，在121 灭菌30 min，自然冷却，按固体培养基重量的9%比例接种A、B两种纳豆芽孢杆菌菌液，在38 下培养48 h，每种粉碎方式做3次平行，将发酵好的纳豆研碎，加入缓冲液提取粗酶液，测定纳豆激酶的活性，以确定最佳的粉碎方式。2.5接种量对纳豆激酶活性的影响在250 mL锥形瓶中，加入50 g浸泡过夜的黄豆，包扎，在121 下灭菌30 min，待其冷却至30 后，接入A、B两种纳豆芽孢杆菌菌液，按固体培养基重量的5%、7%、9%、11%和13%接种量分别接种，每个平行设定3次重复。置于38 的培养箱中，培养48 h后取出，将发酵好的纳豆研碎，加入缓冲液提取粗酶液，测定纳豆激酶的活性，以确定最佳的接种量。2.6发酵时间对纳豆激酶活性的影响在250 mL锥形瓶中，加入50 g浸泡过夜的黄豆，包扎，在121 下灭菌30 min，待其冷却至30 后接入A、B两种纳豆芽孢杆菌菌液，按固体培养基重量的9%接种量接种，放在培养箱中培养，在培养箱中分别培养12、24、36、48和60 h后，每个培养时间3次重复，将发酵好纳豆研碎，加入缓冲液提取粗酶液，测定纳豆激酶活性，以确定最佳发酵时间。2.7纳豆杆菌发酵黄豆产酶活性的正交实验设计在单因素实验基础上，为了获得纳豆杆菌产酶活性最高的工艺条件，采用Box-Behnken实验设计方法，以粉碎度、接种量和发酵时间为变量，分别以A1、B2和C3表示，并以-1，0，1分别代表变量的水平，以测得提取液酶活性(Y)为响应值，通过响应曲面分析进行制备条件的优化，从而得到最优发酵条件。Box-Behnken设计实验因素和水平见表1，采用Design Expert软件对试验数据进行回归分析。表1Box-Behnken设计实验因素与水平因素A粉碎方式/粒B接种量/%C发酵时间/h-11/4粒73601/2粒9481整粒1160水平34粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工23年第48卷第5期粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工2.8纳豆激酶活性的测定方法2.8.1粗酶液的提取准确称取1.00 g纳豆，放入酒精消毒后的研钵中研磨，研成糊状物后，加入50 mL的pH 7.2磷酸缓冲液，用水定容至200 mL，于常温下浸取30 min，随时摇动，在5 000 r/min下离心10 min，取上清液，即为粗酶提取液。2.8.2水解液的制备取1 mL的1%酪蛋白溶液，于40 水中预热5min，加1 mL粗酶液，于40 水中反应20 min，加2mL的0.4 mol/L的三氯乙酸溶液，于40 水中沉淀10 min，在5 000 r/min下离心10 min后取上清液为水解液。空白液先加2 mL的0.4 mol/L的三氯乙酸溶液，后加1 mL的粗酶液，其余操作同上。2.8.3酶液比色测定取5 mL的0.4 mol/L碳酸钠溶液，加1 mL水解液，最后加1 mL的13稀释的福林-酚试剂，于40水浴20 min，以不加酶液为空白，在680 nm，1 cm比色皿，V-1200型分光光度计测定光密度。2.8.4酶活力的计算蛋白酶活力的定义：在30，pH 7.2的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1 g为1个酶活力单位。蛋白酶活力=EK410N1W式中：E为样品吸光度，K为吸收系数，4为水解液总体积，mL；10为反应时间，min;N为稀释倍数，W为纳豆取量,g；吸收系数K值取100 g10。3结果与分析3.1粉碎方式对纳豆激酶活性的影响在不同颗粒度的固体培养基上接种9%的A、B两种纳豆芽孢杆菌后，38 下培养，产生的纳豆激酶活性随着颗粒度粉碎度的增加，出现降低的趋势，变化不大，在黄豆为整粒时，两种菌产生的激酶活性最大，分别为836 U/g和920 U/g，较徐强11用液体发酵 法 得 到 的 纳 豆 激 酶 酶 活720.7 U/g分 别 高 出15.9%和27.6%，结果见图1。3.2接种量对纳豆激酶活性的影响在黄豆固体培养基中接入发酵后的A、B两种菌种，随着接种量的增加，纳豆激酶活性先增加，后出现下降的趋势，在接种浓度为9%时，A、B两种菌液产生的酶活性最强，分别达到852 U/g和1 128 U/g，其中B菌种产生的酶活性比A菌种高32.3%，确图1粉碎方式对纳豆激酶活性的影响定9%为两种菌产生纳豆激酶的最佳接种量，并且B菌种在相同接种浓度下的产酶活性比A菌种高，结果见图2。图2接种量对纳豆激酶活性的影响图3发酵时间对纳豆激酶活性的影响3.3发酵时间对纳豆激酶活性的影响在黄豆固体培养基质量一定时，随着发酵时间的增加，纳豆激酶活性呈现先缓慢增加后急剧下降趋势，当发酵时间为48 h时，A、B两种菌种的产酶活性最强，分别为1 140 U/g和1 448 U/g，B菌种的产酶活性比A菌种高27%，确定48 h为两种菌液产生纳豆激酶的最佳发酵时间，并且得知B菌种在相同发酵时间下产酶活性比A菌种高，结果见图3。35粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工23年第48卷第5期粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工3.4响应面曲面法优化发酵条件在。同时线性项不显著，平方项极显著，交互作用项显著，表明曲线弯曲度较高，该模型已在最优区域进行拟合。表明该二次回归模型能拟合粉碎方式、接种量和发酵时间对纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶影响。图4a显示接种量与粉碎方式的交互作用，随着粉碎程度的增加，产生的酶活力逐渐下降，所以为了-10100-110010-11-10001-111000000-1-1-10100101-11-1011-1-1110011表2响应面实验设计和结果试管号A1B2C3酶活性U/g195221 01631 26441 04851 408698471 18481 36891 376101 224111 09612968131 32014944151 016161 384171 352通过单因素实验，可以清楚地看到在相同条件下，B菌种的产酶活性高于A菌种，选取B菌种进行后续优化实验。根据Box-Behnken的中心组合设计原理，设计了三因素三水平共17个实验点的响应面分析实验，响应面实验结果见表2。表2中的数据经Design-Expert统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表3。经方差分析，方程一次项A和C，以及二次项影响都是显著的，失拟项不显著（P0.05），说明方程拟合较好，模型稳定。利用软件Design Expert8.0对实验结果进行分析得到多元二次回归方程：Y1=1366.40-24A+143B-15.00C+12.00AC-10BC-182.2A2-100.2B2-140.2C2。式中Y1为纳豆芽孢杆菌酶活性，A、B和C为上述3个变量的编码值。回归系数R2=0.9875说明回归拟合程度较好。P0.0001，说明此方程极显著，模型中的B、A2、B2、C2达到极显著水平，A达到显著水平，C、AB、AC、BC影响不显著。由F值可知，影响纳豆激酶酶活的主要因素依次为BAC，即接种量粉碎方式发酵时间。利用Design Expert8.0软件可以得到3个因子之间的响应面分析图和相应的等高图。等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从表3方差分析结果可看出，模型的F=61.65403，P0.01，表明实验所采用二次模型是高度显著的，在统计学上是有意义的。失拟项用来表示所用模型与实验拟合程度，即二者差异的程度。本实验失拟项P=0.13160.05，对模型有利，无失拟因素存简化纳豆杆菌的固体发酵工艺，选择粉碎方式应该为整粒时，纳豆杆菌的酶活性最高；图4b显示发酵时间与粉碎度的交互作用，随着发酵时间和粉碎程度的升高，酶活性也逐步提高，发酵时间和粉碎程度似乎存在着协同效应；图4c显示的是接种量与发酵时间的交互作用，随着纳豆杆菌接种量的增加，酶活表3响应面实验的方差分析结果方差来源平方和自由度均方F-Value%P-Value模型4.646E+05951 618.78%0.0001A-粉碎度4 60814 608.00%0.0423B-接种量1.636E+0511.636E+05%0.0001C-发酵时间1 800.0011 800.00%0.1653AB%0.0001000.00%1.0000AC%5761576.00%0.4100BC%400.001400.00%0.4890A21.398E+05%11.398E+05%0.0001B242 273.85142 273.85%0.0001C282 762.27182 762.27%0.0001残差5 251.207750.17失拟项4 432.0031 477.33%0.0432纯误差819.204204.80总和4.698E+0516注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响高度显著，P0.05表示影响不显著。68.816.14218.072.400.0000.76780.5332186.3356.35110.327.2136粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工23年第48卷第5期粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工粮 食 加 工力越高，但接种量达到9%时，随着接种量的增加，酶活力不再增加，当发酵时间在48 h左右时，酶活力提高，从经济方面认为，发酵48 h，这个时间段是最佳效益时间。对回归方差进行岭迹分析，可得到响应面最佳条件为，A=1/2-0.3071/8，B=9%+0.98852%，C=48-0.232212，在最佳条件基础之上将优化条件调整为：颗粒度A=1/2，接种量B=11%，发酵时间C=45h，对优化条件做验证实验，在该条件下所测得纳豆激酶活性为1 408 U/g，与发酵时间为48 h时纳豆激酶活性相同，从优化的角度选择45 h。而理论预测值为1 399 U/g，预测值较实测值低9 U/g，两者之间相差较小，说明预测值与实验值之间良好的拟合性证实了模型的有效性。4结论在单因素实验的基础上，应用响应面分析法进行纳豆芽孢杆菌固态培养基优化，结合理论模型和实验得到发酵培养基最佳组成为：粉碎方式1/2粒、接种量11%和发酵时间45 h时，在121 下灭菌30 min，经培养优化后纳豆激酶酶活性最高为1 408U/g较未优化之前提高了688 U/g。图4各因素交互作用对纳豆激酶活性影响的响应面图a.粉碎方式与接种量b.粉碎方式与发酵时间c.发酵时间与接种量参考文献：1闫泉香,冯利,徐峰,等.纳豆激酶的溶栓作用及其机制研究J.食品工业科技,2021（24）:340-346.2于晓淼,赵允章,王锋超,等.通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性J.微生物学杂志,2023（2）:21-27.3吴丹.纳豆激酶的作用机理研究进展J.药物生物技术,2019（6）:562-564.4刘瑞娟,张叶,帖卫芳.纳豆激酶的研究进展J.黑龙江科学,2019,10（2）):40-41.5乔斌.纳豆激酶发酵优化及体外模拟胃肠消化吸收的研究D.济南：山东大学,2020.6姚启悦,赵永亮,李飞寰,等.油莎豆粕为原料生产纳豆激酶的工艺研究J.中国调味品,2023,48（3）:104-108.7陈晓飞，向凌云，李珊珊，等.液体发酵高产纳豆激酶菌株的复合诱变选育J.河南科学,2020,38（5）:715-720.8洪奕,夏海华,田洁萍,等.响应面法优化豆粕固体发酵产纳豆激酶培养条件J.中国调味品,2022,47（8）:41-45.9周雪琴,刘良忠.枯草芽孢杆菌筛选及其产纳豆激酶的液态发酵条件优化J.食品工业科技,2022，43（7）:163-169.10刘丽,殷金莲,胡雪芬.固体发酵产纳豆激酶工艺条件的研究J.中国残伤医学,2010，18（13）：34-36.11许强,薛建.纳豆激酶液体发酵培养基优化研究J.北京农业，2014,33：32-33.37