SN∕T 5180-2021 微小病媒生物无损伤制备基因组DNA方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51802021中华人民共和国海关总署发 布ICS 11. 020CCS C 622021-06-18 发布2022-01-01 实施微小病媒生物无损伤制备基因组 DNA 方法Protocol for obtaining high quality genome DNA from tiny vector without damaging morphology of the vouchersISN/T 51802021前 言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国郑州海关。本文件主要起草人：邱德义、陈健、张勤、魏晓雅、刘德星、李婷婷、岳巧云。1SN/T 51802021微小病媒生物无损伤制备基因组 DNA 方法1范围本文件规定了微小病媒生物的基因组 DNA 制备方法，包含对标本的前处理、消化、裂解、提取、纯化基因组 DNA 的操作程序。本文件适用于利用 DNA 条形码等分子生物学技术对微小病媒生物进行种类鉴定或者其他需获取病媒生物基因组 DNA 的工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求SN/T 1876医学媒介生物标本采集、制作及保存规程SN/T 2752.4卫生检疫人员的自我防护规范第 4 部分：实验室人员SN/T 4278国境口岸医学媒介昆虫 DNA 条形码鉴定操作规程SN/T 4629检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1微小病媒生物tiny vector体型微小，难以通过部分组织获取足量基因组 DNA 进行后续分子鉴定的病媒生物。常见的种类有蜱、螨、蚤、虱等。3.2无损伤制备基因组 DNAobtaining genome DNA without damaging morphology of the vouchers在提取基因组 DNA 的过程中，对样本外观不造成损害，处理后的样本仍保持外观的完整性和可识别的形态特征，仍可采用形态学鉴定方法对其进行种类鉴定的基因组 DNA 的制备方法。4要求实验室的生物安全应符合 GB 19489 要求，实验室人员防护应符合 SN/T 2752.4 的要求，实验中用水应符合 GB/T 6682 的要求，PCR 扩增检测应符合 SN/T 4278 和 WS/T 230 的要求。2SN/T 518020215仪器设备及试剂耗材5.1仪器设备普通台式离心机（最大相对离心力大于 14 000 g） 、各量程可调移液器（10 L、20 L、100 L、200 L、1 000 L） 、可调式恒温浴、PCR 工作站或者超净工作台、PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱、核酸蛋白浓度测定仪等。5.2试剂耗材分析纯无水乙醇、磷酸缓冲液（0.05 mol/L pH 6.0） 、几丁质酶、蛋白酶 K、动物组织基因组 DNA提取试剂或试剂盒、琼脂糖、DNA 标准分子量标、双蒸水（ddH2O） 、硫氰酸胍（GuSCN） 、乙二胺四乙酸（EDTA） （0.5 mol/L pH 8.0） 、三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCL） （1 mol/L pH 8.0） 、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100） 、吐温 20（Tween-20）等。离心管（1.5 mL） 、PCR 管（0.2 mL） 、各量程的移液器吸头（10 L、20 L、100 L、200 L、 1 000 L） 、一次性无粉手套等。6操作程序6.1样本前处理将收集的样本用 90% 的乙醇保存，或者将活标本放置于 -80 冰箱中冷冻处死并临时保存。取单个微小病媒生物标本置于灭菌的 1.5 mL 离心管中，加入 0.5 mL ddH2O，低速旋涡振荡 30 s，清洗表面杂质或残余的乙醇，清洗 3 遍，吸净溶液后将样本放置在生物安全柜中晾干 15 min。6.2样本的消化对硬蜱、蚤等具有较厚几丁质外壳的微小病媒生物，将晾干的单个样本置于灭菌的 1.5 mL 离心管中，加入20 L浓度为1.00 mg/mL的几丁质酶磷酸缓冲液 （pH 6.0） ，25 金属浴中消化24 h。 对螨、虱等几丁质外壳较薄的微小病媒生物则略过此步骤。6.3样本的裂解将上述用几丁质酶处理过的样品取出，放入灭菌的 1.5 mL 离心管中，加入 20 L 裂解液（见附录 A）和 20 L 浓度为 20 mg/mL 的蛋白酶 K，混合均匀， 55 裂解过夜。收集裂解后的溶液备用，提取基因组 DNA。6.4标本的制作和保存裂解处理后的标本，按照 SN/T 1876 和 SN/T 4278 确定的要求进行标本制作和保存。6.5提取基因组 DNA裂解后的溶液按动物组织 DNA 酚三氯甲烷法（见附录 B）或用动物组织基因组 DNA 提取试剂盒进行基因组 DNA 的提取、纯化。3SN/T 518020217DNA 提取质量的判定和保存7.1紫外分光光度法检测 DNA 浓度和纯度以溶解DNA的溶液做参比，分别测定样品溶液在260 nm、280 nm、230 nm、270 nm处的吸收值，计算 A260/A280、A260/A230、A260/A270的值，同时满足以下条件的 DNA 样品可视为质量高的基因组 DNA ： A260/A280为 1.81.9，A260/A230 2.0，A260/A270为 1.11.3。参照 A260=1 相当于 50 g/mL 的双链 DNA 计算提取 DNA 的浓度，最终要求提取的基因组 DNA 浓度大于 20 ng/L。若未达到要求的浓度，可依据自身实验条件重新提取，或使用冷冻干燥机或样品浓缩仪进行 浓缩。7.2基因组 DNA 的保存提取纯化的 DNA 样品置于 -20 冰箱中保存备用，基因组 DNA 不宜反复冻融，建议将所得DNA 进行分装保存于 -20 冰箱中，使用时取出，冰浴融化备用；使用后剩余的 DNA 可放于 4 冰箱短期保存，时间不宜超过 14 d。如果需要长期保存，按照 SN/T 4629 确定的要求进行操作。4SN/T 51802021附录A（规范性）裂解液的配制A.1裂解液的配制A.1.1试剂GuSCN（硫氰酸胍） 16.5 g0.5 mol/L EDTA（乙二胺四乙酸） ，pH 8.0 12 mL1 mol/L Tris-HCL（三羟甲基氨基甲烷） ，pH 8.0 6 mLTriton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚） 1 mLTween-20（吐温 20） 10 mLA.1.2配制将所有的试剂加入到烧杯中，加入 180 mL 的去离子水，使用加热磁力搅拌器充分搅拌溶解、混匀。用去离子水定容至 200 mL，室温保存备用。A.2裂解液各成分的工作浓度裂解液各成分的工作浓度见表 A.1。表 A.1裂解液各成分的工作浓度成分浓度备注GuSCN700 mmol/LEDTA30 mmol/LpH 8.0Tris-HCL30 mmol/LpH 8.0Triton X-1000.5%Tween-205%5SN/T 51802021附录B（规范性）裂解后使用酚三氯甲烷法提取基因组 DNA 的操作程序B.1裂解后的溶液 14 000 g 离心 2 min，将上清液转移至一新的离心管中。B.2加入等体积的饱和酚，颠倒混匀，14 000 g 离心 5 min，转移上清液至一新的离心管。B.3加入等体积的饱和酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇（25241） ，颠倒混匀，14 000 g 离心 5 min，转移上清液至一新的离心管。B.4加入等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液（三氯甲烷异戊醇 =241） ，颠倒混匀，14 000 g 离心 5 min，转移上清液至一新的离心管。B.5加入 0.6 倍体积的异丙醇或 2 倍体积经过 -20 冷冻的无水乙醇，加入 3 moL/L 的醋酸钠至终浓度0.3 mol/L ；颠倒混匀，置冰浴中 15 min30 min，14 000 g 离心 5 min，弃上清液，收集白色沉淀。B.6加入 500 L 的 75 %（体积比）乙醇，14 000 g 离心 1 min，洗涤白色沉淀，弃上清液，重复该步骤一次。B.7室温或者 37 彻底干燥离心管，加入 20 L 经高压灭菌的 ddH2O 溶解 DNA。B.8提取的 DNA 保存在 4 备用；长期保存按照 SN/T 4629 的要求进行操作。中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 16 千字2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷印数 1500书号：155175108 定价 16.00 元微小病媒生物无损伤制备基因组 DNA 方法行 业 标 准SN/T 51802021*SN/T 51802021北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：[phone]-7531中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址