DB21∕T 2592.2-2016 鸡传染性疾病检测方法 第2部分：鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR 诊断技术.pdf

ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2592.22016 鸡传染性疾病检测方法 第 2 部分：鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR 诊断技术 Detection method of chicken infectious disease Part2：Diagnostic technique of fluorescent RT-PCR for avian infectious bronchitis virus 2016 - 03 - 18 发布 2016 - 05 - 18 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 2592.2-2016 目 次 前言 . 2 1 范围 . 3 2 规范性引用文件 . 3 3 缩略语 . 3 4 仪器与器材 . 3 5 试剂与材料 . 4 6 操作步骤 . 4 6.1 样品的采集、保存和制备 . 4 6.1.1 采样工具 . 4 6.1.2 样品的采集 . 4 6.1.3 样品的保存 . 4 6.1.4 样品的制备 . 5 6.2 核酸的提取 . 5 6.2.1 编号 . 5 6.2.2 裂解 . 5 6.2.3 沉淀 . 5 6.2.4 洗涤 . 5 6.2.5 干燥 . 5 6.2.6 溶解 . 5 6.3 RT-PCR 检测. 5 6.3.1 反转录反应体系 . 5 6.3.2 PCR 反应体系. 6 6.3.3 检测条件设置 . 6 6.4 结果判定 . 6 6.4.1 结果分析条件设定 . 6 6.4.2 质控标准 . 6 6.4.3 结果描述及判定 . 7 附录 A（资料性附录） 磷酸盐缓冲生理盐水配方. 8 附录 B（规范性附录） 生物安全注意事项. 9 DB21/T 2592.2-2016 前 言 标准鸡传染性疾病检测方法按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 标准鸡传染性疾病检测方法分为三个部分： 鸡传染性法氏囊病毒荧光 RT-PCR 检测方法； 鸡传染性支气管炎病毒荧光 RT-PCR 诊断技术 鸡马立克氏病毒实时荧光 PCR 检测方法 本部分为标准鸡传染性疾病检测方法的第 2 部分 本部分由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本部分由辽宁省畜牧兽医局归口。 本部分起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本部分主要起草人：吴运谱、赵晓彤、薛树山、魏园园、石霖、李红魁、王宏燕、闫海滨、李井春、孙世宇、孙洪志、梁伟 DB21/T 2592.2-2016 鸡传染性疾病检测方法 第 2 部分：鸡传染性支气管炎病毒荧光 RT-PCR 诊断技术 1 范围 本部分规定了鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR诊断所用的引物、 反应程序、 判断标准等技术要求。 本部分适用于禽类及其产品中鸡传染性支气管炎病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 IBV：鸡传染性支气管炎病毒（avian infectious bronchitis virus） DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate） PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate buffer saline） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction) Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） Ct 值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold） 4 仪器与器材 4.1 荧光PCR扩增仪 4.2 高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000 g以上） 4.3 冰箱（2 8 ，-20 和-70 三种） 4.4 分析天平 4.5 组织样品研磨器 4.6 医用剪刀 4.7 镊子 4.8 微量移液器（1000 L、100 L和10 L三种） 4.9 吸头（1000 L、100 L和10 L三种） 4.10 1.5 mL离心管 4.11 15 mL离心管 DB21/T 2592.2-2016 4.12 0.5 mLPCR反应管 4.13 医用棉签 5 试剂与材料 5.1 Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4 8 保存。 5.2 氯仿：4 预冷。 5.3 异丙醇：4 预冷。 5.4 75%乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制，-20 预冷。 5.5 DEPC水：去离子水中加入0.1% DEPC，37 作用1 h，121 2 ，高压灭菌15 min。 5.6 RNA酶抑制剂（40 U/L）。 5.7 DNA聚合酶：HS Taq DNA聚合酶（5 U/L）。 5.8 dNTP (2.5 mmol/L)。 5.9 反转录酶：AMV反转录酶（5 U/L）。 5.10 阴性对照：DEPC水。 5.11 阳性对照：疫苗株 H120株 5.12 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（0.02 mol/L pH7.2）。 5.13 引物：用于RT-PCR反应引物浓度为10 mol/L， 引物见下表1。 表 1 鸡传染性支气管炎病毒荧光 RT-PCR 检测用引物 引物名称 引物序列 上游引物(5-3) 5-CAC AGAAGTATTTGACCCCTTTGA-3 下游引物(5-3) 5-CCGTTCTTAGGA AACTCGTTGACA-3 6 操作步骤 6.1 样品的采集、保存和制备 6.1.1 采样工具 离心管（1.5 mL、15 mL）经121 2 高压灭菌15 min；医用剪刀、镊子、组织样品研磨器经160 干烤2 h。 6.1.2 样品的采集 对病死鸡或其他病死禽类的采样，可解剖后采集气管及其分泌物或肺脏；对活禽的采样，可将棉拭子（医用棉签）深入喉头上腭及上腭裂来回刮3次5次，使其蘸有咽喉分泌液，然后将咽喉拭子放入盛有1.0 mL PBS 的离心管中，编号备用。 6.1.3 样品的保存 DB21/T 2592.2-2016 样品应置于特定样品保存液中进行保存。可采用PBS液（pH7.07.4, 0.01mol/L）、0.85%生理盐水或不含有血清的细胞培养液作为保存液（含青霉素2000 IU/mL、链霉素2000 IU/mL、制霉菌素1000 IU/mL，BSA 5 mg/mL）。样品采集后应置于加冰的保温箱中、密封，24 h内送至实验室进行处理或置于-70 保存。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。 6.1.4 样品的制备 对气管或肺脏样品处理方法是:用医用剪刀将组织病料在研磨器中剪碎，按质量体积比（1:1）加入样品保存液进行研磨； 对棉拭子的处理方法是:将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中， 用镊子充分挤压后弃去拭子。以上样品室温静置作用30 min，4 3000 r/min离心5 min，取上清进行核酸提取。若样品为鸡胚增殖病毒的尿囊液，可直接采用尿囊液进行核酸提取。 6.2 核酸的提取 6.2.1 编号 取n个灭菌的1.5 mL离心管（n为被检样品数与阳性对照管数与阴性对照管数之和），并逐一编号。 6.2.2 裂解 每管加入750 L Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250 L，颠倒10次混匀，室温静置5 min；再加入250 L氯仿，混匀器上振荡混匀15 s（也可以用手反复颠倒混匀）。4 12000g离心15 min。 6.2.3 沉淀 取与6.2.1中相同数量灭菌的1.5 mL离心管，加入500 L异丙醇(4预冷)。取6.2.2中离心后的上清液约500 L转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置15 min。 6.2.4 洗涤 4 12000 g离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1 mL 75%乙醇，颠倒洗涤。 6.2.5 干燥 4 12000 g离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。4000 g离心10 s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥 10 min。 6.2.6 溶解 加入20 L经DEPC处理的水和2 L RNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2 h内进行荧光RT-PCR扩增；于-70 冰箱长期保存。 DB21/T 2592.2-2016 6.3 RT-PCR 检测 6.3.1 反转录反应体系 在反应混合物配制区进行，设所需荧光 RT-PCR 检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，反应体系见表 2，然后 42 水浴 1 h，冰浴 2min。 表 2 鸡传染性支气管炎病毒荧光 RT-PCR 检测反转录体系 试剂 用量 L 5Buffer 4L dNTP（10mM） 2L RNA 酶抑制剂 0.5L 下游引物 1L AMV 0.5L RNA 1L DEPC 水 11L 6.3.2 PCR 反应体系 在反应混合物配制区进行，每个样品 PCR 反应体系见表 3。盖紧管盖，500r/min 离心 30s。将离心后的 PCR 管放入荧光 RT-PCR 检测仪内，记录样本顺序。 表 3 鸡传染性支气管炎病毒荧光 RT-PCR 检测 PCR 反应体系 试剂 用量 L SYBR 12.25 L ROX 0.5 L cDNA 2.0 L 上游引物 0.8 L 下游引物 0.8 L ddH2O 8.4 L HS Taq DNA 聚合酶 0.25 L 6.3.3 检测条件设置 将检测模式设置为：第一阶段，预变性95 30s；第二阶段，95 10s, 65 30s 收集荧光，35个循环。保存文件，运行。 6.4 结果判定 6.4.1 结果分析条件设定 DB21/T 2592.2-2016 读取检测结果。 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点， 不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。 6.4.2 质控标准 1)阴性对照无Ct 值并且无扩增曲线。 2)阳性对照的Ct 值应28.0,并出现特定的扩增曲线。 3)如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。 6.4.3 结果描述及判定 1）阴性 无 Ct 值并且无扩增曲线，样品判为阴性。 2）阳性 Ct 值30，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。 DB21/T 2592.2-2016 A A 附 录 A （资料性附录） 磷酸盐缓冲生理盐水配方 A.1 A 液 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。 A.2 B 液 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液 称取磷酸二氢钠(NaH2PO42H20) 31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000 mL，混匀。 A.3 0.02 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)的配制 量取0.2 mol/L 的 A液360 mL，0.2mol/L 的 B液140 mL，称取氯化钠38 g，用无离子水溶解稀释至5000 mL，4保存。 DB21/T 2592.2-2016 B B 附 录 B （规范性附录） 生物安全注意事项 B.1 所有操作过程应在生物安全二级(biology security level 2： 能够安全操作， 对实验室工作人员和动物致病性低的，对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平)实验室中进行。 _