Trizol法提取RNA实验步骤.doc

Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液 准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。静置过夜，然后高压灭菌。0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30C放置2-3分钟，然后离心 12,000 g，15 minutes ， 2 - 8C。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%。3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中， 加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30C，然后离心12,000 g ，10 minutes， 2 - 8C。离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。4、RNA洗涤去上清， 加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 g ，5 minutes，2 -8C。5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio 1.6。用无RNase 水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55-60C。测浓度后-20C保存。6、测浓度： 取2l 储存液加入另一个EP管中，再加入98l无RNase水，离心混匀，以无RNase水作空白对照，测OD260/280值。1 OD=40g RNA。OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml较准。浓度太高要稀释以后再测定。7、RNA鉴定：甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。注意事项:在使用TRIZOL的时候要带手套和眼罩，避免接触到皮肤和衣服，使用化学通风橱，防止蒸汽吸入。除非特别说明，所有的操作均在15-30C下进行，所用的试剂均放置于15-30C。组织在加入氯仿之前是可以在-60-70C放置一个月 。RNA沉淀在75%乙醇中在2-8C下至少可以放置一周，在5 -20C至少可能放置一年。