枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物检测方法研究.pdf

宁夏农林科技，Ningxia Journal of Agri.and Fores.Sci.&Tech.2023，64（04）：64-69 农产品质量与安全 基金项目：宁夏回族自治区重点研发计划项目（2021BEF03003）、宁夏回族自治区农业科技自主创新资金农业高质量发展和生态保护科技创新示范项目（NGSB-2021-5）、2022 年宁夏回族自治区青年拔尖人才培养项目。作者简介：牛艳（1980），女，宁夏吴忠人，硕士研究生，副研究员，主要从事农产品质量安全相关研究。*通信作者：吴燕（1985），女，宁夏中宁人，高级试验师，主要从事农产品质量安全相关研究。收稿日期：2022-06-22枸杞产业是宁夏特色优势产业。枸杞子（Lyciumbarbarum L.）是我国传统名贵中药材，具有增强免疫力、防衰老、抗肿瘤、抗氧化等多方面的药理作用1-4。在枸杞生产过程中，为了防治枸杞虫害，通常会使用杀虫剂。溴氰虫酰胺（cyantraniliprole）第二代鱼尼丁受体作用剂类杀虫剂5，通过改变苯环上的各种极性基团具有更高效的作用6。其对豇豆豆野螟7、甜菜夜蛾8、玉米田小地老虎9、甘蔗螟虫10等有较好的防治效果。在中国，溴氰虫酰胺已在柑橘类、仁果类、茄果类等水果蔬菜上获准登记使用，并已制定了相关的临时最大残留限量11，但尚未制定检测方法标准。溴氰虫酰胺分析方法有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法12-15，并在少量作物上进行残留动态研究16-18。枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物检测方法研究目前尚未见报道。该方法建立了以乙腈为提取溶剂，经 C18 净化，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定枸杞中溴氰虫酰胺及其代谢物的分析方法，操作简枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物检测方法研究牛 艳1，2，张锋锋1，2，杨 静1，2，陈 翔1，2，赵子丹1，2，吴 燕1，2*1.宁夏回族自治区农产品质量安全标准研究与评价重点试验室，宁夏 银川7500022.宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏 银川750002摘要：【目的】研究建立枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物残留检测的液相色谱-质谱/质谱法。【方法】枸杞果实样品采用分散法处理，用乙腈提取，C18 净化，超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪检测，外标法定量。【结果】应用该方法检测枸杞鲜果、干果中溴氰虫酰胺及其代谢物，平均回收率为 83.9%108.8%，相对标准偏差（RSD）为 4.2%9.6%，定量限均为 0.01 mg/kg。【结论】该方法可以快速、准确测定枸杞果实中溴氰虫酰胺农药及其代谢物。关键词：枸杞；溴氰虫酰胺；超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）中图分类号：O657.63；TS207.5+3文献标识码：A文章编号：1002-204X（2023）04-0064-06doi:10.3969/j.issn.1002-204x.2023.04.014Study on Detection of Cyantraniliprole and Its Metabolites in WolfberryNiu Yan1,2,Zhang Fengfeng1,2,Yang Jing1,2,Chen Xiang1,2,Zhao Zidan1,2,Wu Yan1,2*(1.Ningxia Key Laboratory of Research and Evaluation of Agricultural Product Quality and Safety Standards,Yinchuan,Ningxia 750002；2.Ningxia Institute of Quality Standard and Testing Technology for AgriculturalProducts,Yinchuan,Ningxia 750002)AbstractObjective Cyantraniliprole and its metabolites residue in Lycium fruit was detected by ultra performanceliquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).Method The samples were processed using themethod,extracted with acetonitrile,purified with C18,detected by UPLC-MS/MS and quantified by externalstandard method.Result The recoveries were 83.9%108.8%,relative standard deviations(RSD)were 4.2%9.6%,and the quantification limit was 0.01 mg/kg.Conclusion This method can quickly and accurately detectcyantraniliprole pesticides and its metabolites.Key words Wolfberry;Cyantraniliprole;UPLC-MS/MS6464 卷 04 期单，结果准确。课题组开展枸杞中溴氰虫酰胺及其代谢物残留检测，旨在为中国制定溴氰虫酰胺及其代谢物在枸杞中的 MRL 值提供分析方法，对于枸杞产业的发展也具有重要意义。1材料与方法1.1试验材料、试剂、仪器设备供试材料为宁杞 7 号枸杞鲜果和干果，采自宁夏农林科学院农产品质量标准与检测技术研究所试验基地。试剂：溴氰虫酰胺（批号为 1052035，纯度为 93%，德国 Dr 公司）；溴氰虫酰胺代谢物 J9Z38（批号为20200417，纯度为 96.9%，上海甄准生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，美国默克试剂公司）；甲醇（色谱纯，美国默克试剂公司）；无水硫酸镁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氯化钠（分析纯，140 烘烤 4 h，国药集团化学试剂有限公司）；C18 吸附剂 4063m，美国安捷伦公司）；试验用水为去离子水。仪器设备：超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（Thermo TSQ Quantum），美国赛默飞公司生产；高速离心机（Heal Force Neofuge 18R 型），香港力康发展有限公司生产；涡流混合器（MS3 digital 型），德国 IKA 艾卡公司生产；电子天平（PL202-L 型），瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司生产；组织捣碎机（SMT-Y09 型），深圳斯玛特智能电器发展有限公司生产；水浴恒温振荡器（THZ-82A），金坛荣华仪器公司生产；超纯水机及精密移液枪及其他试验室常用仪器设备。1.2样品前处理将枸杞鲜果、干果样品放置冰箱中，于-18 冷冻保存。试验时将鲜、干枸杞样品取出，鲜样用高速组织捣碎机打浆，干样用高速万能粉碎机（可加少量的液氮）粉碎（30 g 样品粉碎时间为 30 s），分别置于样品瓶中，于-18 条件下冷冻备用。1.3样品的提取与净化称取经前处理的枸杞鲜果 10.00 g、干果 5.00 g（精确至 0.01 g）于 50 mL 离心管，加入 20 mL 乙腈，在水浴恒温振荡器上振荡 40 min；再加入 1.0 g 氯化钠、4 g 无水硫酸镁，盖上盖子，振摇约 1 min，放入离心机中，以 4 000 r/min 的转速离心 5 min，吸取 2 mL上清液于 15 mL 离心管中（提前称好 100 mg C18），涡旋净化后过 0.22 m 滤膜，用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定。1.4液相色谱条件色谱柱：Eclipse Plus C18 柱（100 mm2.1 mm，1.8 m），或性能相当者；柱温：35；流速：0.3mL/min；进样量：1 L；流动相梯度见表 1。1.5质谱条件的优化取 1 mL 10 mg/L 的溴氰虫酰胺及其代谢物标准工作液，在正离子模式下进行母离子全扫描，得到溴氰虫酰胺母离子M+（m/z 475.1）、代谢物母离子M+（m/z 456.87）。对母离子施加不同的碰撞能量，对产生的子离子进行全扫描，得到相对丰度较高的溴氰虫酰胺子离子M+（m/z 285.8）和M+（m/z 443.9），溴氰虫酰胺代谢物子离子M+（m/z 187.9）和M+（m/z 298.9）。质谱条件：离子源为电喷雾离子源 ESI；扫描方式为正离子源；离子喷雾电压为 3.5 kV；毛细管传输温度为300；碰撞压力为 1.5 mTorr；鞘气为 30 arb；辅气为10 arb；检测方式为多反应监测模式（SRM）。质谱检测参数见表 2。2结果与讨论2.1标准工作曲线将溴氰虫酰胺标准品配置成 1 000 mg/L 的标准溶液，为了消除基质效应的影响，将枸杞空白样品提取液作为溶剂，将 1 000 mg/L 的标准溶液逐级稀释为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.5、1.0 mg/L 系列标准溶液。在仪器条件下测定，以标准溶液浓度和峰面积做标准曲线，得出溴氰虫酰胺及其代谢产物线性回归方程分别为y=834 450 x，y=162 492 x，其相关系数分别为 0.999 6，0.9991。在 0.011.00mg/L 范围内，溴氰虫酰胺及其代谢产物的进样质量浓度（x）与色谱峰面积（y）间线性关系良好，定量限均在 0.01 mg/kg。详见图 1。表 1流动相洗脱条件时间/min0.1%甲酸水溶液/%甲醇/%0.009553.505958.0195510.00955表 2溴氰虫酰胺及其代谢物的多反应离子监测分析参数名称保留时间/min溴氰虫酰胺6.30溴氰虫酰胺代谢物 J9Z385.39定性离子/（m z-1）394.1/254.0394.1/310.1456.8/187.9456.8/187.9定量离子/（m z-1）394.1/310.1456.8/298.9滞留时间/s0.10.10.10.1碰撞能/eV31232838牛 艳，等枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物检测方法研究6564 卷 04 期牛 艳，等枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物检测方法研究图 1溴氰虫酰胺及代谢物标准溶液（浓度为 0.1 mg/L）LC-MS/MS 的多反应监测（MRM）色谱2.2提取溶剂的选择提取溶剂的选择应该是与残留分析的化合物有良好的溶解性和稳定性，适于样品制备和色谱分析，不仅要求目标物被提取充分，而且提取的杂质干扰越少越好。根据溴氰虫酰胺及其代谢物性质，采取常用的提取剂有乙腈、甲醇、乙醚。在提取溶剂研究中，对比了 3 种提取溶剂对枸杞鲜果、干果样品溴氰虫酰胺及代谢物的提取效果，结果见图 2。通过在不同溶剂中的提取率试验及色谱扫描峰面积与相当标准偏差值的比较可知，用甲醇或乙醚提取枸杞样品中的溴氰虫酰胺及其代谢物时，回收率均不能达到分析检测的要求；而有乙腈提取时，回收率在 83.9%108.8%，相对标准偏差（RSD）为 4.2%9.6%，完全能满足分析检测要求。因此，确定溶解性和稳定性最好的乙腈作为枸杞鲜果、干果样品的提取溶剂。同时，进行了不同提取次数对提取效果的影响研究试验。结果表明，提取 1 次与提取 2 次、3 次差异不大，从提取效率角度考虑，提取 1 次完全可以达到较好的效果，最终确定乙腈提取 1 次。6664 卷 04 期牛 艳，等枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物检测方法研究2.3吸附剂的优化针对目前常用的色谱前处理净化方法固相萃取（SPE）、分散法，通过测定添加回收率的方法，对各个净化方法进行筛选，结果（图 3）表明，固相萃取与分散法净化效果差异不显著。从前处理效率考虑，固相萃取较分散法用时长；从成本考虑，固相萃取较分散法费用高。综合后最终确定最佳净化方法为 C18 分散净化法。分别考察了不同质量的 C18 对净化效果和回收率的影响。结果（图 4）表明，选用 50、100、150 mg C18，鲜果、干果 2 种基质中溴氰虫酰胺及代谢产物的回收率分别为 66.2%84.1%、85.1%105.0%和 63.1%72.2%，最终选用 100 mg C18。鉴于 2 种基质中溴氰虫酰胺及其代谢产物均满足农药残留检测的要求，因此未进一步研究基质效应的影响。2.4回收率和精确度溴氰虫酰胺及其代谢产物在 0.01、0.1、1.0 mg/kg添加水平下，每个添加水平作 5 个重复，枸杞空白试样同时进行测定。枸杞鲜果、干果平均回收率为83.9%108.8%，相对标准偏差（RSD）为 4.2%9.6%（表 3）。符合农残分析的要求，方法高效、快速，具有可行性，溴氰虫酰胺及代谢物在枸杞鲜、干果空白及0.1 mg/L 添加回收总离子流图见图 5。图 2不同提取剂提取效果的研究图 3不同前处理方法效果的对比图 4不同质量吸附剂 C18 对净化效果的影响表 3枸杞（鲜果、干果）中溴氰虫酰胺及代谢物添加回收率、精密度（n=5）名称添加浓度/（mg kg-1）枸杞鲜果回收率范围/%相对标准偏差/%枸杞干果回收率范围/%相对标准偏差/%溴氰虫酰胺0.0180.4100.89.080.5105.110.00.182.6105.612.082.5100.68.91.089.8103.96.588.5100.25.5溴氰虫酰胺代谢物J9Z380.0186.8104.27.490.3108.87.20.191.2107.57.183.9106.09.61.085.6100.46.987.6104.17.66764 卷 04 期牛 艳，等枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物检测方法研究（b）枸杞鲜果添加色谱（c）枸杞干果空白色谱（a）枸杞鲜果空白色谱683结论枸杞鲜果、干果样品采用分散法处理，用乙腈提取，C18 净化，对方法的回收率、精密度进行了探讨。溴氰虫酰胺及其代谢物在枸杞鲜果、干果中 3 个添加质量浓度水平的回收率为 83.9%108.8%，测定的相对标准偏差为 4.2%9.6%，定量限均为 0.01 mg/kg，表明方法的精密度和准确性较好，符合农残分析的要求19-20，具有可行性。参考文献：1 孙志刚.宁夏枸杞药理研究进展J.西北药学杂志，2001，16（3）：133-135.2 魏雪松，王海洋，孙智轩，等.宁夏枸杞化学成分及其药理活性研究进展J.中成药，2018，40（11）：2513-2520.3 ZHU W,ZHOU S X,LIU J H,et al.Prebiotic,im-muno-stimulating and gut microbiota-modulating effectsof Lycium barbarum polysaccharideJ.Biomedicine&Pharmacotherapy,2020,121:109591.4 SIMONYAN K V,AVETISYAN L G,CHAVUSHYANV A.Goji fruit(Lycium barbarum)protects sciatic nervefunction against crush injury in a model of diabeticstressJ.Pathophysiology,2016,23(3):169-179.5 胡译文，孙建昌，耿阳阳，等.溴氰虫酰胺研究进展及应用现状J.南方农业，2016，10（31）：24-27.6 郑雪松，赖添财，时立波，等.双酰胺类杀虫剂应用现状J.农药，2012，51（8）：554-557，580.7 黄耀亮，王祥林，许洪，等.溴氰虫酰胺防治豇豆豆野螟试验初报J.浙江农业科学，2013（5）：571-572.8 余慧灵，向兴，袁贵鑫，等.溴氰虫酰胺亚致死剂量对甜菜夜蛾生长发育及体内解毒酶活性的影响J.昆虫学报，2015，58（6）：634-641.9 徐春梅.溴氰虫酰胺种子处理防治玉米田小地老虎D.泰安：山东农业大学，2017.10 黄凤玲，温威，阳爱民.10%溴氰虫酰胺可分散油悬浮剂防治甘蔗螟虫田间药效试验J.广西植保，2014，27（3）：13-14.11 中华人民共和国国家卫生健康委员会，中华人民共和国农业农村部，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量：GB 2763-2021S.北京：中国标准出版社，2021.12 宋文芳.高效液相色谱法同时测定辣椒中氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺的残留J.现代食品，2020（7）：172-174.13 顾中怡，杨勇，金樱华，等.高效液相色谱法测定溴氰虫酰胺可分散油悬浮剂中有效成分含量J.农药，2015，54（5）：337-339.14 丁金凤，徐春梅，张薇，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定玉米植株和土壤中溴氰虫酰胺及其代谢物残留J.农药学学报，2018，20（1）：83-89.15 王思威，王潇楠，常虹，等.QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法检测荔枝中氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺及代谢物残留J.农药学学报，2022，24（2）：395-403.16 赵坤霞，孙建鹏，秦冬梅，等.溴氰虫酰胺及其代谢物在土壤和葱中残留行为J.环境科学与技术，2014，37（2）：89-95.17 何红梅，张春荣，朱亚红，等.溴氰虫酰胺及其代谢物在辣椒和土壤中的残留降解研究J.分析化学，2014，42（8）：1177-1182.18 杨玉霞，莫仁甫，周其峰，等.溴氰虫酰胺在甘蔗中残留和消解动态J.农药，2021，60（10）：743-746，750.19 李富根，董丰收.农药残留国家标准检测技术M.北京：科学出版社，2021.20 刘丰茂，潘灿平，钱传范.农药残留分析原理与方法（第二版）M.北京：化学工业出版社，2021.责任编辑：达海莉64 卷 04 期牛 艳，等枸杞果实中溴氰虫酰胺及其代谢物检测方法研究（d）枸杞干果添加色谱图 5溴氰虫酰胺及其代谢物在枸杞鲜、干果上空白及添加色谱69