基因工程知识点.pdf

基因工程期末考点基因工程期末考点1.格里菲斯实验：格里菲斯实验：用粗糙型（R，无毒）和光滑性（S，有毒）肺炎链球菌注射小鼠，用R 单独注射时，小鼠存活；S 则小鼠死亡；高温加热杀死的 S 则存活；R+高温加热杀死的 S 菌株混合注射，小鼠死亡：S 型菌种含有某种转化因子将 R 转变为 S，导致小鼠死亡2.艾弗里实验（体外转化实验）：艾弗里实验（体外转化实验）：分离出蛋白质、脂类、多糖和 DNA，转入到小鼠体内，初步证明 DNA 是遗传物质，但是存在争议（DNA 和蛋白质未完全分离）3.Alfred Hershey、Martha Chase（译赫尔希、蔡司）噬菌体侵染实验，噬菌体侵染实验，证明 DNA 是遗传物质4.Waston、Crick、威尔金斯、富兰克林 DNADNA 双螺旋模型双螺旋模型5.Matthew Meselson、Franklin Stahl DNADNA 半保留复制半保留复制6.Marshall W.Nirenberg、Har G.Khorana、Robert W.Holley 密码子破译密码子破译7.镰刀型贫血症：血红蛋白第六位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸8.胰岛素：加拿大科学家 Banting、Best、科利普、麦克莱德发现，是糖尿病治疗史上的里程碑（LiLy 公司）9.Stanley Cohen（斯坦福大学）+Herbert Boyer（加州大学）重组 DNA 技术，基因重组得人胰岛素（礼来和诺和诺德公司）10.1990 年，第一例临床基因治疗 患者为四岁女孩 Ashanti de Silva，缺乏腺苷脱氢酶ADA 基因而患有严重综合性免疫缺陷症，研究者 W.F.Anderson 将 ADA 基因导入患者淋巴细胞，再将改造后的淋巴细胞回输到患者体内11.HIV 唯一治愈病人 柏林病人 Timothy Ray Brown（同时患 HIV 和白血病，CCR5 受体）12.基因编辑技术：Zinc Finger；TALEN；CRISPR 1.1.基因操作工具酶：基因操作工具酶：酶在 DNA 分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对 DNA 进行切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具2.2.内切酶：内切酶：在 DNA 上核苷酸的特定连接处以特定的方式把 DNA 双链切开的工具酶酶，如EcoRI,HpaI。3.DNA3.DNA 聚合酶：聚合酶：以 DNA 为模板，沿 53方向将游离脱氧核苷酸不断连接到正在合成的新 DNA 链上的 DNA 合成酶。4.DNA4.DNA 连接酶（了解）：连接酶（了解）：催化 DNA 上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的 3羟基和 5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的 DNA裂口连接起来的工具酶（通常使用来自 T4 噬菌体的 DNA 连接酶和大肠杆菌连接酶；前者以 ATP 作为辅助因子，后者需要 NAD作为能源；二者都能连接平末端和黏性末端；T4 DNA 连接酶应用更广泛一些）5.鉴于对核酸的不同作用，将相关酶分为核酸水解酶类核酸水解酶类（核酸内切酶、核酸外切酶）、核核酸合成酶类酸合成酶类（DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、DNA 连接酶）以及核酸修饰酶类核酸修饰酶类（甲基化酶、核苷酸激酶、核苷酸转移酶、磷酸酶）6.常用工具酶及其功能7限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶：是指能识别双链 DNA 分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶。（一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将 DNA 分子切断）作用特点：作用特点：1）专一性（）专一性（一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割 DNA 分子）；2）多样性（多样性（限制酶有 200 多种）；3）限制酶识别的特定序列通常是由 4-6 个碱基对组成的具有回文序列的 DNA 片段，并在识别序列内或其附近水解 DNA 链中的磷酸二酯键；4）不同酶识别的碱基数目不同，一般为 4、5、6 个碱基对；5）识别序列碱基对越多，则这种酶在 DNA 上出现的频率越低；6）不同生物其碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同；7）大多数限制酶是错位切割双链 DNA 产生 5或 3粘性末端能在特异位点（酶切位点）上催化双链 DNA 分子的断裂,产生相应的限制性 DNA 片段。作用结果：作用结果：产生黏性末端或平末端 分类：分类：限制酶主要分布在微生物中，分为三类：即 I 型、II 型、III 型酶。I 型和 III 型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性，又因其识别位点与切割位点不固定，所以价值不大；II 型酶切割 DNA 片断活性和甲基化作用是分开的，且核酸内切作用又具有序列特异性，识别、切割特殊的回文序列，在基因克隆中广泛使用。（通常所用的限制性核酸内切酶都是指 II 型）8.8.粘性末端：粘性末端：被限制酶切开的 DNA 两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端平末端：平末端：部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割 DNA 双链，产生平末端限制性内切酶酶切产生两种结果（粘性末端和平末端）/三种结果（5、3粘性末端和平末端），粘性末端效率高9.9.命名（了解）命名（了解）采用 Smith 和 Athens 提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名 用来源细菌的英文缩写斜体符号命名：它的第一个字母大写，来源细菌属名的第 1 个字母；第二、三字母小写，来源细菌种名的头 2 个字母；第四个字母代表菌株；最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号（如 Hind III，H 为属名第一个字母 in 为种名头两个字母 d 为菌株名 Rd 中的 d，III 说明是在该菌株中发现的第三种限制性核酸内切酶）10.同尾酶：同尾酶：来源不同、识别序列不同但可以产生相同粘性末端的酶称为同尾酶（BamH I和 Bgl II Sal I 和 Xho I）同位酶：同位酶：识别相同序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶（相同序列不同末端 SmaI和 XmaI）11.11.影响内切酶酶切反应的条件（简答题）影响内切酶酶切反应的条件（简答题）温度：一般 37 盐离子浓度：Na，Mg2 缓冲体系：具有稳定 pH 环境的 Tris-HCl 缓冲体系 DTT（二硫苏糖醇）用于保持酶稳定性和活性 反应体积和甘油浓度：商品化的限制性内切核酸酶均加 50甘油作为保护剂，一般在-20保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的 10，否则甘油浓度过高，影响酶切反应 反应时间：通常为 1h；进行大量 DNA 酶切反应时一般让酶解过夜 DNA 纯度和结构：一个酶单位定义：1h 内完全酶解 1g 噬菌体 DNA 所需的酶量 DNA 样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA 等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度 酶切的底物一般为双链 DNA，DNA 的甲基化位置会影响酶切反应12.“星星”活性活性：酶特异性改变或特异性降低而呈现的活性（非特异性切割）13.DNA 连接酶连接的部位是磷酸二酯键（梯子的扶手），其作用过程分为 3 步：（简答题）连接酶与辅助因子 ATP 或 NAD形成酶-AMP 复合物AMP 作用于 DNA 缺口的 5-末端磷酸基团缺口 3-OH 对活跃的磷原子作亲核攻击，形成新的磷酸二酯键，封闭切口13.DNA 连接酶的反应条件 连接反应的温度连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的 Tm 值在15以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是 37，但在该温度下粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的 Tm 值和连接酶最适温度的折中，所以连接反应一般采用 1616过夜过夜 DNADNA 浓度：浓度：外源片段浓度比载体 DNA 浓度高 10-20 倍；由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在平末端连接反应中，T4 DNA 连接酶的浓度和外源 DNA 及载体 DNA浓度均要求较高 防止环化：防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 时间：时间：过夜最好14.平末端 DNA 片段的连接直接用 T4 DNA 连接酶连接：效率不高，较少采用同聚物同聚物连接平末端 DNA 片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端 DNA 分子加上同聚物尾巴后再用 DNA 连接酶进行连接用衔接物衔接物连接平末端 DNA 分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的 DNA 连接（衔接物：指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段）15.重组 DNA 实验的一般程序 选用一种对载体 DNA 只具唯一限制识别位点的限制酶（如 EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性 DNA 分子 再将外源 DNA 片段也用同一种酶作相同的消化 混合，加入 DNA 连接酶。由于具有相同的（如 EcoR I）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA 连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种 DNA 分子16.逆转录酶：亦称为反转录酶，是依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，以 RNA 为模板指导三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）合成互补 DNA 链（cDNA）的酶。17.碱性磷酸酶功能功能：催化去除 DNA、RNA、rNTP 和 dNTP 上的 5端磷酸基团,以防发生自身连接 用途：用途：在用-P32 磷酸和多核苷酸激酶在 5端标记 DNA 或 RNA 之前，进行碱性磷酸酶处理；在 DNA 连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接18.其他功能酶（了解）磷酸激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶 作用：作用：放射性标记 DNA 链 5末端，探针标记 Maxam-Gilbert 化学法的 DNA 序列分析 使缺少 5磷酸的 DNA 片段和合成接头磷酸化 特性：特性：很难纯化，酶制品常不纯；铵离子是该酶的强烈抑制剂；低浓度的磷酸也可抑制该酶的活性末端脱氧核苷酸转移酶：来自小牛胸腺 作用：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着 53加到 DNA 链的 3-OH 末端。该过程不需要 DNA 模板，对双链、单链 DNA 都适用。经常用于人工粘性末端的构建甲基化酶：能识别限制酶识别的序列，识别顺序中的某个碱基发生甲基化（常见使限制酶识别序列中的 C 或 A 甲基化修饰），属修饰酶类。经修饰的 DNA 不再被限制酶降解；细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶（methylase）来完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序，真核生物中目前只发现 5 甲基胞嘧啶（m5c）1 12.2.载体载体 ：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体(Vector);即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的 DNA 分子载体三元件：载体三元件：能在宿主细胞中复制并稳定地保存-具复制原点复制原点(ori)(ori):在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能与携带的外源 DNA 一起复制 能与目的基因连接-具多个限具多个限制酶切点制酶切点，而每一个这样的酶切位点在载体 DNA 中只有一个（广泛、特异）便于筛选鉴定-具有标记基因标记基因，这种选择标记基因通常是抗菌素基因或某种酶基因，而宿主细胞并不具有按作用分：按作用分：将载体分为克隆载体克隆载体（可以克隆和运载目的基因并转移到宿主细胞中进行复制和扩增）、表达载体表达载体（克隆、运载和转移目的基因到受体细胞中进行复制和扩增）和穿梭穿梭载体载体（能在两种不同的生物中复制的载体，既能在原核生物又能在真核生物复制）3.各种 DNA 载体比较（master）4.4.质粒质粒 ：质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链 DNA 分子。（质粒是基因工程中最常用的运载体，而最常用的质粒的是大肠杆菌的质粒）质粒载体的修饰改造：质粒载体的修饰改造：去掉不必要的 DNA 区域,只保留质粒复制必须部分，以提高外源DNA 装载量 减少质粒内限制性内切酶位点，质粒酶切位点过多，给克隆外源 DNA 造成不便 加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标记，常用的有抗生素抗性标记。如：氨苄青霉素抗性标记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等 安全性能改造：不能随便转移，以免污染环境 改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子发展概况（了解）：第一阶段发展概况（了解）：第一阶段（1977 年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101,colE1,pCR,pBR313 和 pBR322 第二阶段第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如 pUC 系列载体 第三阶段第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp 系列载体，含 T3，T7，sp6 启动子载体，表达型载体及各种探针型载体（pBR322pBR322 载体载体：分子量小、拷贝数高、含四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记、对多种常见的限制性核算内切酶仅有一个切割位点pUCpUC 质粒系列质粒系列：Puc18/19 为代表，以 pBR322 为基础，去除包括四环素在内的 40%DNA，换用了 M13 噬菌体的一个片段，内含有 lacZ 的 5序列以表达半乳糖苷酶的 片段，lacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子 P 和操纵基因 O）；具有一个改进的 pMB1 复制子且有很高的拷贝数，保留氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记，双功能检测质粒载体（青霉素抗性基因+蓝白斑筛选）分子量更小；拷贝数更高；多克隆位点 MCS 由人工合成的多个单一酶切位点构成5.5.蓝白斑筛选原理：蓝白斑筛选原理：pUC18/pUC19 上含有一个 LacZ 基因的调控序列和编码-半乳糖苷酶N 端 146 个氨基酸的序列（-互补肽）的 DNA 序列（标记为 lacZ），多克隆位点就存在于 lacZ上；-半乳糖苷酶的 C 端编码基因却位于相应的宿主菌上；当这两个部分基因产物（缺陷型-半乳糖苷酶）结合才会形成一个有活性的-半乳糖苷酶。这种机制称为-互补作用。X-gal 是-半乳糖苷酶的指示剂，在诱导物 IPTG（乳糖类似物，效应物）存在下，-半乳糖苷酶催化 X-gal 形成蓝色化合物，导致菌落呈现蓝色；而当多克隆位点成功插入目的基因，则 lacZ被破坏，无法合成-互补肽与宿主合成的相应片段互补形成具有活性的-半乳糖苷酶，就无法与底物 X-gal 发生反应产生蓝色颜色反应，所以对应的菌落应该为白色。所以基因工程实验中，白色菌落为重组子，蓝色菌落是空载体转化子6.6.噬菌体载体：噬菌体载体：1 1）噬菌体分类：）噬菌体分类：根据与宿主的关系，可分为烈性烈性和温和噬菌体温和噬菌体（烈性噬菌体仅有溶菌生长周期；温和噬菌体既能进入溶菌生长周期，又能在感染过程中不产生子代噬菌体颗粒，噬菌体 DNA 整合到寄主细胞染色体 DNA 上，即进入溶源生长周期。噬菌体载体与质粒载体比较结构更加复杂，但感染细胞更为有效）2）噬菌体是一种温和噬菌体，遗传结构研究比较清楚，且装载量较质粒大，可以用来构建基因文库。入侵大肠杆菌后可以按裂解裂解或溶源溶源两种方式生存和繁殖（噬菌体在宿主内进行独立复制，在 1 个菌体内生长出 100 个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为溶菌溶菌 噬菌体侵入菌体后，把自身 DNA 加进细菌 DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶源溶源3 3）热启动：）热启动：噬菌体从溶原状态转变为裂解状态时一种可诱导过程，实验室常用的是热热诱导。诱导。低温时（30）建立溶原，高温（42）则出现裂解。噬菌体的 c1 基因是温度敏感突变型的，称为 c1ts。c1ts 可作为组件插入质粒 DNA 内，目的基因插入在其下游，重组体的目的基因在 42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关4 4）噬菌体载体分类）噬菌体载体分类：插入型载体插入型载体和替换型载体替换型载体（插入型仅有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点；替换型具有两个对应的酶切克隆位点）5 5）噬菌体构建：噬菌体构建：相较于野生型 噬菌体 DNA，人工构建的 DNA 缩短了自身的长度缩短了自身的长度，增大了装载量；删除或诱变重复的酶切口删除或诱变重复的酶切口，防止重复的酶切口影响后续外源 DNA 的组装；加加装了选择标记装了选择标记，如蓝白斑筛选的 lacZ6 6）DNADNA 作为载体的优点作为载体的优点1).DNA 可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌 2).DNA 作为载体，其装载外源 DNA 的能力可达 25kb，远远大于质粒的装载量 3).它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建7.7.柯斯质粒载体柯斯质粒载体 ：柯斯质粒(Cosmid)载体又叫粘粒载体，这是一种由人工构建的含有 噬菌体 DNA 的 cos 位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体,具有质粒和噬菌体的双重特征，被称为 cosmid，指带有粘性末端位点的质粒。（柯斯质粒在结构组成上具有 噬菌体的特性,也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入 3540kb 的外源基因，是构建真核生物基因文库的主要载体）8.8.表达载体的特点：表达载体的特点：具有克隆载体所具有的基本特性；具有可被宿主细胞识别的基因表达调控元件：启动子、核糖体结合位点、转录终止序列9.9.原核生物表达载体：原核生物表达载体：复制子序列，允许其在宿主细胞内自由复制 选择性标记，筛选载体是否进入到受体细胞 多克隆位点，方便目的基因的插入和整合 控制转录的启动子，如Lac、trp、tac 启动子及 T7、SP6 噬菌体启动子，经诱导后能从克隆化基因产生大量 mRNA 转录调控序列，合适的核糖体结合位点、起始密码 ATG 和转录终止序列1 1）启动子（客观题）启动子（客观题）大肠杆菌表达载体中常用的启动子：（1）trp-lac 启动子（又称 tac 启动子）：tac 启动子是一种人工构建的双杂合启动子，由 trp 启动子、lac 操纵子的操纵基因和 SD 序列融合而成。受 lac 阻遏蛋白的抑制，异丙基硫代半乳糖苷的诱导表达。（2）噬菌体 PL 启动子 特点：受温度的控制，低温（37C）下被阻遏而抑制，高温（42 C）下去阻遏而激活（3）T7 噬菌体启动子2 2）核糖体结合位点（）核糖体结合位点（RBSRBS）：）：RBS 由 SD 序列、核糖体小亚基识别序列和起始密码（ATG）组成，但有时也将 SD 序列称为核糖体结合位点（SD 序列：存在于原核生物起始密码子 AUG上游的一种 4-7 个核苷酸保守片段，它与 16S-rRNA 3端反向互补，所以可将 mRNA 的 AUG起始密码子置于核糖体的适当位置便起始翻译作用。由首次识别其功能意义的科学家Shine-Dalgarno 命名）3）转录终止机制两种 依赖依赖 因子的转录终止因子的转录终止和不依赖不依赖 因子的转录终止因子的转录终止4）原核表达系统：大肠杆菌和枯草芽孢杆菌（填空）5）愿和宿主高效表达策略：SD 序列与起始密码子的距离 原核序列融合表达（密码子优化）减轻宿主代谢负担：生长于表达阶段分开，蛋白分泌6）Ecoli 中的高校表达策略 优化表达载体的设计 优化密码子 提高 mRNA 的稳定性 提高目的蛋白的稳定性 优化发酵过程1010真核表达载体：真核表达载体：穿梭载体：指能在两种不同的生物中复制的载体（指能在两种不同的生物中复制的载体（通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在真核细胞中用于基因表达分析）1）真核表达优势（与原核比较）大肠杆菌不能表达结构复杂的蛋白质酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化且具有原核生物生长快、操作简便的特点，又具备哺乳类细胞翻译后加工和修饰的功能；而原核表达如大肠杆菌不能表达结构复杂的蛋白质，不具备真核细胞的翻译后修饰功能，表达得到的蛋白质与目标蛋白存在一定差异。哺乳细胞、昆虫细胞表达系统能表达结构复杂的细胞蛋白，但操作复杂，表达水平低2）启动子：诱导性中诱导性中 AOXAOX 醇氧化酶（最强启动子）和组成型中醇氧化酶（最强启动子）和组成型中 GAPGAP（甘油醛（甘油醛-3-3-磷酸脱磷酸脱氢酶）氢酶）3 3）性结合因子：MF-MF-含含 8888 个个 aaaa，效率高，效率高4 4）糖基化修饰：）糖基化修饰：N-N-糖基化：糖基化：天门冬酰胺上的酰胺氮进行糖基化【发挥功能作用发挥功能作用】O-O-糖基化：糖基化：苏/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化（甘露糖）【增加糖蛋白增加糖蛋白】5)5)酵母表达系统：酵母表达系统：酿酒酵母，酿酒酵母，甲醇酵母，甲醇酵母，克鲁维酵母，克鲁维酵母，汉逊酵母汉逊酵母酿酒酵母：1 安全性 2 遗传背景清楚 3 DNA 导入方便 4 易于高密度发酵 5 翻译后修饰甲醇毕赤酵母：1 生长迅速 2 pAOX1 强启动子 3 可诱导表达6）Mut+：甲醇利用快型 Mut-（既没有 AOX1 也没有 2）Muts（只有 AOX2 没有 1）7）zeocin 筛选（Zeocin 是一种属于争光霉素家族的糖蛋白抗生素，在体内能作用于大多数细菌（包括 E。coli）、真菌（如：酵母菌）、植物细胞、动物细胞、细胞培养级。）8）毕赤酵母高效表达策略：提高转录水平（启动子）；信号肽；基因剂量（基因拷贝数）；整合位点；发酵条件（培养基成分、pH、溶氧、消泡等）；表达产物的稳定性（蛋白酶缺陷菌株、降低 pH、竞争性抑制）11.昆虫表达载体（判断）Sanger 测序法：蛋白质的结构和功能是由氨基酸序列所决定的第四章1.分子克隆：亦称 DNA 克隆：为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体 DNA 重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的 DNA 片段。2.DNA 重组：在转化、转导、转染或转座过程中，整段 DNA 在细胞内、细胞间或不同物种间进行转移，并发生 DNA 分子间的共价连接，简称重组。3.基因文库：来自某一生物基因组 DNA（或来自某一组织所有不同的 mRNA 的每一种 cDNA分子）经酶切所形成的全部 DNA 片段克隆在细菌中增殖后的集合体或应用 DNA 重组技术构建的含有基因组的全部基因的 DNA 克隆群体。4.cDNA 文库：将生物某一组织细胞中的总 mRNA 分离出来作为模板，在体外用反转录酶（Reverse Transcriptase）合成互补的双链 DNA（Complementary DNA，cDNA），而后接到合适的载体上，导入受体细胞后形成的所有克隆就叫 cDNA 文库。5.转化：将质粒载体 DNA 分子或其它外源 DNA 导入感受态原核细胞(大肠杆菌)的过程。6.转导：把以噬菌体为载体的重组 DNA 分子引入受体细胞的过程。克隆载体 T 载体7.热激转化：用化学试剂（如 CaCl2 处理）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体 DNA分子导入受体细胞。8.电激转化：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲短暂作用于细胞,将载体 DNA 分子导入受体细胞,从而显著提高转化效率。9.感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生暂时的变化，成为能容许外源 DNA 的载体分子通过的的细胞状态，称为感受态细胞。10.原生质体：植物细胞通过质壁分离后，和细胞壁分开的那部分细胞物质。11.农杆菌介导转化：将含重组 Ti 质粒载体的农杆菌与受体共培养，使外源基因导入并整合到染色体。12.分子克隆路线：13.基因文库的构建过程：14.cDNA 文库构建过程：15.逆转录过程：以 mRNA 为模板逆转录合成 cDNA 第一条链；合成 cDNA 第二条链有两种方法:一是用大肠杆菌的 RNaseH 切割 RNA-DNA 杂交分子产生 RNA 短片段，DNA 聚合酶 I 以 RNA 短片段为引物合成新的 DNA 链（置换合成法）;二是利用 cDNA 第一链的 3端出现的发夹环结构，即第一链末端返折为合成 cDNA 第二条链提供引物（自身引导法）。16.筛选：A.表型特征筛选（遗传检测法）：1.抗药性标志选择：常用的质粒抗性基因有氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选2.标志补救（表达产物与营养缺陷互补）原理：转化进入的编码外源 DNA 的基因，能对受体细胞所具突变性状体内起到抑制互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。3.蓝白斑筛选（互补）B.基因水平检测：1.限制性酶切图谱：凝胶电泳法筛选重组质粒分子量比未插入外源 DNA 片段的质粒空载体要大。而质粒 DNA 的电泳迁移率与分子量大小成比例，带有外源 DNA 插入序列的分子量较大的重组体 DNA 在凝胶中的迁移速率比空载体质粒 DNA 慢。通过分离提取质粒 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳可检测具外源 DNA 的重组质粒。2.PCR 法筛选3.核酸分子杂交：原位杂交，southern 杂交等从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是，应用放射性标记的特定的 DNA 或 RNA 作探针，进行 DNA/DNA 或 DNA/RNA 的原位杂交检测。即应用放射性标记的探针，原位筛选重组体菌落。C.免疫学方法筛选1.放射性抗体检测法：同菌落杂交技术在程序上十分类似，但不使用放射性标记的核酸作探针，而是用抗体鉴定那些产生外源 DNA 编码的抗原的菌落或噬菌斑。只要当一个克隆的目的基因，能够在大肠杆菌寄主细胞中实现表达，合成出外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。2.免疫沉淀检测法：用来鉴定产生蛋白质的菌落。方法：在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体。如果有些菌落的细菌会分泌出某种蛋白质，那么在它周围会出现一条由抗体-抗原沉淀物形成的白色的圆圈。D.DNA-蛋白质筛选法：用于检测能同 DNA 特异性结合的蛋白质因子操作程序：用硝酸纤维素薄膜进行噬菌斑转移，使其中的蛋白质吸附在滤膜上再将此滤膜同放射性标记的含有 DNA 结合蛋白质编码序列的双链 DNA 寡核苷酸探针杂交根据放射自显影的结果筛选阳性反应克隆17.利用理化方法分离基因：密度梯度超速离心法18.简并引物：指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。PCR为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。简并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择简并性小的氨基酸，并避免引物 3末端简并。19.转化影响因素：1.载体：载体性质、空间结构、分子大小等2.受体细胞3.转化过程20.（判断）基因组文库公式：21.基因枪：基因枪技术,又称为生物弹道技术或微粒轰击技术，是用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了 DNA 的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的组织或者细胞中的一种技术。其基本原理就是采用一种微粒加速装置,使裹着外源基因的微米级的金或钨颗粒获得足够的动量打入靶细胞或组织。已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。第五讲一、名词解释一、名词解释探针探针：能与核酸分子中特定片段互补结合并带有能检测标记物的已知核酸序列探针标记探针标记：使探针带上可检测标记物的过程核酸分子杂交核酸分子杂交：核酸分子杂交是指来源不同的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下，按碱基配对原则结合成杂化双链的过程。杂交的双方分别称为探针和待测核酸Southern 杂交：杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链 DNA 或 RNA 探针的杂交作用检测这些被转移的 DNA片段，这种实验方法叫做 DNA 印迹杂交技术Northern 杂交：杂交：这是一种将 RNA 从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法原位杂交：原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交Western 杂交：杂交：SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，再将蛋白质从凝胶转移到一种固相支持物(硝酸纤维膜上)，通过抗体与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异性反应进行检测的杂交技术RNAi：是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA 诱发的特异性降解现象PCR：在试管中，利用 DNA 聚合酶、一对引物和四种 dNTP，对模板 DNA 反复多次地进行复制，从而得到大量扩增特定产物的反应过程，称为 PCRK.Mullis(PCR,1985)polymerase chain reaction 聚合酶链式反应RT-PCR：即以 mRNA 作为模板，进行反转录合成 cDNA 的 PCR 方法Q-PCR：是用 PCR 方法对样品起始模板浓度进行定量分析的一种方法通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量转录组学转录组学：从 RNA 水平研究基因表达的情况,即一个活细胞所能转录出来的所有 RNA 的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段蛋白质组学蛋白质组学：一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质，指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等生物芯片生物芯片：是将细胞、蛋白质、DNA 及其他生物组分，通过微加工技术和微电子技术集中点在一个平方厘米大小的固体芯片表面，以实现对它们的准确、快速、高效、敏感的大信息量的检测、分析和处理二、电泳电泳1 电泳染色原理电泳染色原理溴化乙锭（EB）在紫外光照射下发射荧光。用 EB 对 DNA 样品染色时，会插入 DNA 分子的碱基对中形成荧光结合物。荧光的强度同 DNA 片段的大小（或数量）成正比2 凝胶电泳影响因素凝胶电泳影响因素：除与 DNA 本身相关外，还有凝胶类型和浓度：琼脂糖凝胶电泳能分辨大小在 0.1-60kb 之间的 DNA 片段（聚丙烯酰胺凝胶：0.001-1kb）。琼脂糖浓度越低，大 DNA 片段分辨越清楚，反之，小DNA 片段越清楚缓冲液：常用 pH 在 8.0 左右，离子强度为 0.02-0.05。常用 TBE（硼酸缓冲液）和TAE（醋酸缓冲液），TBE 比 TAE 的缓冲能力大。对高分子量的 DNA，TAE 的分辨率要高于 TBE，而对低分子量的 DNA，TAE 分辨率较低电压：用琼脂糖凝胶电泳测定 DNA 分子大小时，应尽量减少电荷效应，使分子的迁移速度主要决定于凝胶受阻滞的程度，这样 DNA 片断的迁移率则与电压成正比，DNA 片段能得到很好的分辨电泳时间：时间不宜过长，否则会出现扩散现象，影响观察效果三、核酸分子杂交1 标记目的标记目的：用标记的核苷酸替代探针上原有的核苷酸探针标记方法探针标记方法：切口平移标记、随机引物标记、PCR 标记法、末端标记法探针的主要用途探针的主要用途（1）从基因文库中筛选特定克隆，获得某一重组体（2）确定基因组中的同源序列（3）基因在染色体上的定位（4）基因诊断（5）法医学中的应用（6）其它2 Southern 杂交过程杂交过程3 Northern 杂交杂交处理对象：为单链的 RNA（区别于 Southern 杂交）RNA 的变性处理：RNA 虽为单链，但分子中存在二级结构，必须除去，采用RNA 变性电泳方法，在分离 RNA 的同时消除二级结构，且保证 RNA 按照分子大小分离RNA 变性电泳方法：甲醛变性电泳、羧甲基汞变泳、乙二醛变性电泳转移和杂交方法同 Southern 杂交4 Northern 和和 Southern 杂交区别杂交区别5 原位杂交原位杂交检测对象：直接以菌落或噬菌斑为对象来检测重组子实验方法：在琼脂平板上放一张硝酸纤维膜，将菌点在滤膜上倒置平板，37培养至菌落生长至0.5-1.0mm 的大小。也可先在平板上生长细菌再通过影印将菌落转移到滤膜上用 0.5M NaOH 裂解菌落释放变性的 DNA 并使 DNA 结合于滤膜上，用 Tris-HCl，pH7.4中和并转移到一张干的滤纸上，置于室温 30min，干燥滤膜。将滤膜夹在两张干的滤纸之间，80烤干固定 DNA。杂交方法同 Southern6 Western 杂交杂交杂交对象：蛋白质方法：是一种检测蛋白质的免疫化学方法 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，再将蛋白质从凝胶转移到一种固相支持物(硝酸纤维膜上)，通过抗体与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异性反应进行检测应用：基因在蛋白质水平上的表达研究7 四种杂交方法的比较四种杂交方法的比较四、四、PCR1 PCR 技术的基本原理技术的基本原理模拟 DNA 的天然复制过程，由变性复性延伸三个基本反应步骤构成：根据目的 DNA 片段两端的碱基序列，合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与 DNA 的两条链互补配对将适量的寡聚核苷酸引物与 4 种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、DNA 聚合酶及含有目的 DNA 的模板 DNA 分子混合，经过高温变性（使 DNA 双链解开）、低温复性（使引物与模板附着）和中温延伸（合成新的 DNA 片段）三个阶段的一次循环，DNA 的量即可以增加 1倍，则 30 次循环后，DNA 的量增加 230倍2 PCR 的三个阶段的三个阶段模板 DNA 的变性：模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 经加热至 94一定时间后，解离变性成单链，以便与引物结合模板 DNA 与引物的复性：温度降至 55左右，等于或小于引物 Tm 时，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合引物的延伸：DNA 模板引物结合物在 Taq DNA 聚合酶作用下，以 4 种 dNTP 为反应原料，目的 DNA 序列为模板，按碱基配对与半保留复制原则，从引物 3端催化复制链以53方向延伸,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性复性延伸，就可获得更多的半保留复制链，而这种新链又可成为下次循环的模板出错概率：1/2104，对分子克隆实验有影响3 PCR 污染措施：污染措施：防污染（1）设置不同的操作区（2）分装试剂（3）严格操作过程五、五、Sanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧终止法是由 Sanger 于 1977 年建立的 DNA 序列测定方法，也称为引物合成法或酶促合成法原理：利用 DNA 聚合酶合成 DNA，在 DNA 的聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序反应的终止依赖于底物 2,3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。在 DNA 聚合酶作用下能通过其 5三磷酸基团掺入到正在增长的 DNA 链中，形成磷酸二酯键，但由于缺乏3羟基而不能同后续的 dNTP 或 ddNTP 形成磷酸二酯键，因此，一旦 ddNTP 掺入DNA 的新生链中，聚合反应就会终止 基因编辑技术基因编辑技术：锌指核糖核酸酶（zinc finger nuclease,ZFN）TALENs 转录激活因子样效应物核酸酶 transcription activator-like(TAL)effector nucleasesCRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），规律成簇间隔短回文重复酵母双杂交酵母双杂交：细胞起始基因转录需要反式转录激活因子的参与酵母转录因子 GAL4 在结构上由两个功能上相互独立的结构域构成:DNA 结合功能域（DNA binding domain,BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）这两个结合域分开时仍具有功能，但不能激活转录，当两者在空间上较为接近时，才能呈现完整的 GAL4 转录因子活性，激活激活序列的下游启动子，使下游基因转录