GB 5009.255-2016 食品安全国家标准 食品中果聚糖的测定.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 6食品安全国家标准食品中果聚糖的测定2 0 1 6 - 0 8 - 3 1发布2 0 1 6 - 0 9 - 2 0实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 61 食品安全国家标准食品中果聚糖的测定1 范围本标准规定了食品中果聚糖含量的离子色谱法测定方法。本标准适用于乳及乳制品、 婴幼儿配方食品、 婴幼儿谷类辅助食品、 固体饮料、 配制酒中单独添加的低聚果糖、 多聚果糖或菊粉含量的测定。2 原理试样经热水浸提, 样液中的蔗糖经蔗糖酶水解成葡萄糖和果糖, 葡萄糖和果糖经硼氢化钠还原成相应的糖醇, 多余的硼氢化钠用乙酸中和。样液中的果聚糖经过果聚糖酶水解成果糖和葡萄糖, 经离子色谱-脉冲安培检测器测定果糖含量, 通过换算系数, 折算得到果聚糖的含量。3 试剂和材料3.1 试剂除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1.1 氢氧化钠(N a OH) 。3.1.2 马来酸(C4H4O4) 。3.1.3 蔗糖酶: 来源于酵母, 酶活力3 0 0U。3.1.4 硼氢化钠(N a B H4) 。3.1.5 冰乙酸(CH3C OOH) 。3.1.6 三水乙酸钠(CH3C OON a3 H2O) 。3.1.7 果聚糖酶: 来源于黑曲霉, 酶活力1 00 0 0U。3.1.8 5 0%氢氧化钠溶液(N a OH) : 色谱纯。3.1.9 无水乙酸钠(CH3C OON a) : 纯度9 9.0%。3.1.1 0 氮气(N2) : 纯度9 9.9%。3.2 试剂配制3.2.1 氢氧化钠溶液(1m o l/L) : 称取4 0g氢氧化钠( 精确至0.0 1g) , 溶于水并稀释至10 0 0m L, 室温下可放置2个月。3.2.2 马来酸钠缓冲溶液(1 0 0mm o l/L,p H6.5) : 称取1.1 6g马来酸( 精确至0.0 1g) 于1 5 0m L烧杯中, 加入约7 0m L水溶解, 用1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H6.5, 用水稀释至1 0 0m L。4保存, 可放置3个月。3.2.3 蔗糖酶溶液(4.5U/m L) : 将蔗糖酶( 活力为3 0 0U) 溶解于6 6m L马来酸钠缓冲溶液, 分装到2m L的离心管中,-2 0保存, 可放置6个月。使用前需测定酶活力。3.2.4 氢氧化钠溶液(5 0mm o l/L) : 称取2g氢氧化钠( 精确至0.0 1g) , 溶于水并稀释至10 0 0m L, 室G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 62 温下可放置2个月。3.2.5 硼氢化钠溶液(1 0m g/m L) : 准确称取适量硼氢化钠( 精确至0.0 0 1g) 于聚丙烯离心管中, 用5 0mm o l/L氢氧化钠溶液溶解, 最终质量浓度为1 0m g/m L, 用时现配。3.2.6 乙酸溶液(2 0 0mm o l/L) : 吸取0.6m L冰乙酸, 用水稀释至5 0m L,4保存, 可放置2个月。3.2.7 乙酸钠溶液(2 0 0mm o l/L) : 称取1.3 6g三水乙酸钠( 精确至0.0 1g) , 溶于水并稀释至5 0m L,4保存, 可放置2个月。3.2.8 乙酸钠缓冲溶液(p H4.5) : 吸取1 4m L乙酸溶液和1 1m L乙酸钠溶液混合, 并用水稀释至5 0m L, 用时现配。3.2.9 果聚糖酶溶液(4 5 5U/m L) : 将果聚糖酶( 活力为1 00 0 0U) 溶解于2 2m L乙酸钠缓冲溶液, 分装到2m L的离心管中,-2 0保存, 可放置6个月。使用前需测定酶活力。3.2.1 0 氢氧化钠溶液(2 0 0mm o l/L) : 取1 0.4m L5 0%氢氧化钠溶液, 用水稀释至10 0 0m L, 通入氮气保护, 缓慢摇匀, 室温下可放置7d。3.2.1 1 氢氧化钠(1 5 0 mm o l/L) 乙酸钠(5 0 0 mm o l/L) 混合溶液: 称取4 1g无水乙酸钠( 精确至0.0 1g) , 用约5 0 0m L水溶解,0.2 2m滤膜过滤, 脱气1 0m i n, 加入7.8m L5 0%氢氧化钠溶液, 并用水稀释至10 0 0m L, 通入氮气保护, 缓慢摇匀, 室温下可放置7d。3.3 标准物质果糖标准物质(C6H1 2O6) : 纯度9 9.0%。3.4 标准溶液的配制3.4.1 果糖贮备溶液(20 0 0m g/L) : 准确称取0.0 5g( 精确至0.1m g)8 0烘干至恒重的果糖标准物质于5 0m L烧杯中, 加入约1 0m L热水, 待果糖溶解后, 冷却至室温, 用水稀释至2 5m L容量瓶中, 摇匀,4保存, 可放置1个月。3.4.2 果糖中间溶液(8 0.0m g/L) : 吸取果糖贮备溶液1m L, 用水稀释至2 5m L容量瓶中, 用时现配。3.4.3 果糖标准曲线工作溶液: 取适量果糖中间溶液, 用水配制成质量浓度为0.8 0 0m g/L、1.6 0m g/L、4.0 0m g/L、8.0 0m g/L、1 6.0m g/L的标准曲线工作溶液。3.5 材料3.5.1 净化柱: 反相固相萃取柱, 填料为苯乙烯二乙烯基苯,2.5m L。3.5.2 微孔滤膜: 水相,0.2 2m。4 仪器和设备4.1 离子色谱仪: 配有三元及以上梯度泵, 脉冲安培检测器,A u工作电极。4.2 天平: 感量为0.1m g、0.0 0 1g和0.0 1g。4.3 p H计: 精度为0.0 1p H。4.4 旋涡振荡器。4.5 恒温水浴摇床: 控温精度1。4.6 离心机: 转速30 0 0r/m i n。G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 63 5 分析步骤5.1 试样制备5.1.1 试样预处理5.1.1.1 固体样品: 用“ 四分法” 缩分至约2 0 0g样品经粉碎机粉碎, 混匀, 备用。5.1.1.2 液体样品: 将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中, 摇匀, 备用。5.1.2 提取准确称取1g 5g( 精确至0.0 0 1g, 至少含有果聚糖5m g) 试样于1 5 0m L锥形瓶中, 加入8 01热水约5 0m L, 置于8 01恒温水浴摇床中,1 5 0r/m i n振摇1 5m i n后, 取出, 冷却至室温, 转移至1 0 0m L容量瓶中, 用水分三次冲洗锥形瓶, 定容, 摇匀, 溶液经滤纸过滤或者离心, 滤液或上清液依据标准曲线的线性范围确定稀释倍数, 备用。取上述备用样液2 0 0L于1 0m L具塞玻璃试管中, 估算样液中可能的蔗糖含量, 按照每毫克蔗糖加入3 0 0L蔗糖酶溶液, 旋涡振荡混匀, 置于4 01恒温水浴摇床中,1 5 0r/m i n振摇6 0m i n后,加入3 0 0L硼氢化钠溶液, 旋涡振荡混匀, 置于4 01恒温水浴摇床中,1 5 0r/m i n振摇3 0m i n后, 取出, 冷却至室温。加入7 5 0L乙酸溶液, 静置1 0m i n。估算样液中可能的果聚糖含量, 按照每毫克果聚糖加入1.2m L果聚糖酶溶液, 旋涡振荡混匀, 置于4 01恒温水浴摇床中,1 5 0r/m i n振摇3 0m i n后, 取出, 冷却至室温。转移至1 0m L容量瓶中, 用水分三次冲洗玻璃试管, 定容, 摇匀。活化净化柱, 试样溶液依次通过0.2 2m水相滤膜和净化柱, 弃去前面3倍柱体积洗脱液, 收集后面洗脱液待测。同时做试剂空白试验。5.2 仪器参考条件5.2.1 仪器参考条件15.2.1.1 色谱柱: 可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换色谱柱。5.2.1.2 淋洗液:A: 水;B: 氢氧化钠溶液(2 0 0mm o l/L) ;C: 氢氧化钠(1 5 0mm o l/L) 乙酸钠(5 0 0mm o l/L)混合溶液。梯度洗脱条件见表1。表1 梯度洗脱条件时间m i n流速m L/m i n淋洗液%ABC曲线02 01.08 02 00线性2 0.13 01.0001 0 0线性3 0.14 01.001 0 00线性4 0.15 01.08 02 00线性5.2.1.3 检测器: 脉冲安培检测器,A u工作电极,A g/A g C l参比电极, 检测池温度3 0, 果糖检测波形参见表2。G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 64 表2 果糖检测波形时间s电位V积分时间s电位V积分0.0 0+0.1 00.4 2-2.0 00.2 0+0.1 0开始0.4 3+0.6 00.4 0+0.1 0结束0.4 4-0.1 00.4 1-2.0 00.5 0-0.1 05.2.1.4 柱温:3 0。5.2.1.5 进样体积:1 0L。5.2.2 仪器参考条件25.2.2.1 色谱柱: 可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换色谱柱。5.2.2.2 淋洗液:A: 氢氧化钠溶液(9 0mm o l/L) ;B: 氢氧化钠(1 5 0mm o l/L) 乙酸钠(5 0 0mm o l/L) 混合溶液。梯度洗脱条件见表3:表3 梯度洗脱条件时间m i n流速m L/m i n淋洗液%AB曲线02 21.01 0 00线性2 2.13 51.001 0 0线性3 5.16 01.01 0 00线性5.2.2.3 脉冲安培检测器,A u工作电极,P d参比电极, 检测池温度3 5, 果糖检测波形参见表4:表4 果糖检测波形时间s电位V积分0.0 0+0.0 50.2 0+0.0 5开始0.3 0+0.0 5结束0.3 5+0.5 50.5 5-0.1 05.2.2.4 柱温:3 2。5.2.2.5 进样体积:2 0L。5.3 标准曲线的制作将标准曲线工作溶液从低到高依次注入离子色谱仪中, 测定相应的响应值( 峰面积) , 以标准工作液G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 65 中果糖的质量浓度为横坐标, 以响应值( 峰面积) 为纵坐标, 绘制标准曲线。标准溶液色谱图参见附录A。5.4 试样溶液的测定将试样溶液注入离子色谱仪中, 记录色谱图。根据保留时间定性, 记录峰面积, 根据标准曲线得到待测液中果糖的质量浓度, 平行测定次数不少于两次。同时测定试剂空白。6 分析结果的表述试样中果聚糖含量按式(1) 、 式(2) 、 式(3) 计算:X=k1k2(c-c0)V1 0m0.210 0 0(1)k1=1 8 0+1 6 2(n-1)1 8 0n(2)k2=nn-1(3) 式中:X 试样中果聚糖的含量, 单位为克每千克(g/k g) ;k1 对果聚糖水解过程中增加的水分子进行校正;k2 对于Fn型果聚糖末端果糖基被还原和G Fn型果聚糖末端葡萄糖不被检测进行校正;c 试样测定液中果糖的质量浓度, 单位为毫克每升(m g/L) ;c0 试剂空白测定液中果糖的质量浓度, 单位为毫克每升(m g/L) ;V 试样定容体积, 单位为毫升(m L) ;1 0 试样酶解液定容体积, 单位为毫升(m L) ;m 试样质量, 单位为克(g) ;0.2 用于酶解的样品溶液体积, 单位为毫升(m L) ;10 0 0 单位转换系数;n 平均聚合度, 对于低聚果糖, 按照n=4计算; 对于多聚果糖, 按照n=2 3计算; 对于菊粉, 按照n=1 0计算。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 0%。8 其他当称样量为5g时, 检出限为0.4g/k g, 定量限为2.0g/k g。G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 66 附 录 A果糖标准溶液、 奶粉样品色谱图A.1 果糖标准溶液色谱图( 参考条件1)果糖标准溶液色谱图( 参考条件1) 见图A.1。图A.1 果糖标准溶液色谱图A.2 奶粉样品色谱图( 参考条件1)奶粉样品色谱图( 参考条件1) 见图A.2。图A.2 奶粉样品色谱图G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 67 A.3 果糖标准溶液色谱图( 参考条件2)果糖标准溶液色谱图( 参考条件2) 见图A.3。图A.3 果糖标准溶液色谱图A.4 奶粉样品色谱图( 参考条件2)奶粉样品色谱图( 参考条件2) 见图A.4。图A.4 奶粉样品色谱图G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 68 附 录 B酶活力测定方法B.1 蔗糖酶活力测定方法B.1.1 原理蔗糖酶(S u c r a s e,E C3.2.1.2 6) 又称转化酶, 可以从果糖末端切开蔗糖的果糖糖苷键, 使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖, 葡萄糖和果糖是还原糖, 其含量可通过3,5 -二硝基水杨酸比色法测定, 从而度量酶活力的大小。由于蔗糖酶在碱性条件下极易失活, 所以可用碱终止反应。3,5 -二硝基水杨酸和还原糖共热后生成棕红色氨基化合物, 在最大吸收波长5 4 0n m处测定, 在一定浓度范围内吸光值与还原糖含量呈线性关系, 因此可用于还原糖含量的测定, 从而测定蔗糖酶的活力大小。蔗糖酶活力定义为: 在3 7、p H6.5条件下, 每分钟水解产生1m o l葡萄糖所需的酶量( 活性) 定义为1个酶活力单位。B.1.2 试剂除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。B.1.2.1 葡萄糖标准物质(C6H1 2O6) : 纯度9 9.0%。B.1.2.2 蔗糖(C1 2H2 2O1 1) : 纯度9 9.0%。B.1.2.3 氢氧化钠(N a OH) 。B.1.2.4 马来酸(C4H4O4) 。B.1.2.5 二硝基水杨酸(C7H4N2O7) 。B.1.2.6 酒石酸钾钠(C4H4KN a O6) 。B.1.2.7 苯酚(C6H5OH) 。B.1.2.8 亚硫酸钠(N a2S O3) 。B.1.3 试剂配制B.1.3.1 2.5m o l/m L葡萄糖标准溶液: 准确称取0.0 4 5g( 精确至0.1m g)8 0烘干至恒重的葡萄糖标准物质于5 0m L烧杯中, 加入约1 0m L热水, 待葡萄糖溶解后, 冷却至室温, 用水稀释至1 0 0m L容量瓶中, 摇匀,4保存, 可放置1个月。B.1.3.2 氢氧化钠溶液(1m o l/L) : 称取4 0g氢氧化钠( 精确至0.0 1g) , 溶于水并稀释至10 0 0m L, 室温下可放置2个月。B.1.3.3 马来酸钠缓冲溶液(0.1m o l/L,p H6.5) : 称取1.1 6g马来酸( 精确至0.0 1g) 于1 5 0m L烧杯中, 加入约7 0m L水溶解, 用1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至6.5, 用水稀释至1 0 0m L,4保存, 可放置3个月。B.1.3.4 1.0m o l/L蔗糖溶液: 准确称取3 4.2g( 精确至0.0 1g) 蔗糖, 用约5 0m L水溶解, 用马来酸钠缓冲溶液稀释至1 0 0m L, 摇匀, 用时现配。B.1.3.5 氢氧化钠溶液(2m o l/L) : 称取8 0g氢氧化钠( 精确至0.0 1g) , 用水溶解并稀释至10 0 0m L,室温下可放置2个月。B.1.3.6 3,5 -二硝基水杨酸溶液: 将6.3g二硝基水杨酸和2 6 2m L2m o l/LN a OH溶液, 加到5 0 0m L含有1 8 5g酒石酸钾钠的热水溶液中, 再加5g苯酚和5g亚硫酸钠, 搅拌溶解, 冷却后用水稀释至G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 69 10 0 0m L, 贮于棕色瓶中备用。B.1.4 仪器和设备B.1.4.1 恒温水浴锅: 控温精度1。B.1.4.2 分光光度计: 带1c m玻璃比色皿。B.1.4.3 微量移液器:1 0 0L、10 0 0L。B.1.5 分析步骤B.1.5.1 待测酶的制备准确称取测试酶样品约0.1g( 精确0.0 0 1g) , 用0.1m o l/L马来酸钠缓冲溶液溶解并稀释, 控制酶活力浓度在1U/m L5U/m L范围内。B.1.5.2 测定B.1.5.2.1 葡萄糖标准曲线的制作取6支1 0m L刻度试管, 编号, 按表B.1配制不同浓度的葡萄糖标准溶液:表B.1 葡萄糖标准溶液管号123456葡萄糖原液量/m L00.1 0 00.2 0 00.3 0 00.4 0 00.5 0 0加水量/m L1.0 00.9 0 00.8 0 00.7 0 00.6 0 00.5 0 0葡萄糖浓度/ (m o l/m L)00.2 5 00.5 0 00.7 5 01.0 01.2 5 在上述各试管中分别加入0.5m L 3,5 -二硝基水杨酸溶液, 混匀后于沸水浴中加热1 0m i n。取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温, 用水定容至5m L, 混匀, 以1号试管为空白, 用分光光度计测定波长5 4 0n m处的吸光值。以吸光值为纵坐标, 葡萄糖质量浓度为横坐标, 绘制标准曲线。B.1.5.2.2 蔗糖酶活力的测定取1 0m L刻度试管, 用微量移液器准确移取1.0m o l/L蔗糖溶液0.8m L, 准确加入待测酶0.1m L,在3 71恒温水浴保温3 0m i n, 取出后立即加入0.1m L1m o l/LN a OH溶液, 摇匀以终止酶促反应。在相同的条件下, 以沸水浴钝化酶液作为试剂空白。再向该溶液中加入0.5m L3,5 -二硝基水杨酸溶液, 混匀后于沸水浴中加热1 0m i n。取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温, 用水定容至5m L, 混匀。用分光光度计测定波长5 4 0n m处的吸光值, 由标准曲线计算待测酶测定液中和试剂空白测定液中葡萄糖的质量浓度。B.1.6 计算蔗糖酶活力按式(B.1) 计算:X=(c-c0)VVx3 0(B.1) 式中:X 蔗糖酶活力, 单位为活力单位每毫升(U/m L) ;c 待测酶测定液中葡萄糖的摩尔浓度, 单位为微摩尔每毫升(m o l/m L) ;G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 61 0 c0 试剂空白测定液中葡萄糖的摩尔浓度, 单位为微摩尔每毫升(m o l/m L) ;V 酶水解液最终定容体积(5m L) , 单位为毫升(m L) ;Vx 待测酶的用量, 单位为毫升(m L) ;3 0 反应时间, 单位为分(m i n) 。B.2 果聚糖酶活力测定方法B.2.1 原理果聚糖酶(I n u l i n a s e,E C3.2.1.8 0) 又称菊粉酶, 是能够水解- 2,1 - D -果聚糖果糖苷键的一类水解酶, 使菊粉水解生成葡萄糖和果糖, 葡萄糖和果糖是还原糖, 其含量可通过3,5 -二硝基水杨酸比色法测定, 从而度量酶活力的大小。3,5 -二硝基水杨酸和还原糖共热后生成棕红色氨基化合物, 在最大吸收波长5 4 0n m处测定, 在一定浓度范围内吸光值与还原糖含量呈线性关系, 因此可用于还原糖含量的测定, 从而测定果聚糖酶的活力大小。果聚糖酶活力定义为: 在5 5、p H4.5条件下, 每分钟水解产生1m o l果糖所需的酶量( 活性) 定义为1个酶活力单位。B.2.2 试剂B.2.2.1 果糖标准物质(C6H1 2O6) : 纯度9 9.0%。B.2.2.2 菊粉: 纯度9 0.0%。B.2.2.3 冰乙酸(CH3C OOH) 。B.2.2.4 三水乙酸钠(CH3C OON a3 H2O) 。B.2.2.5 二硝基水杨酸(C7H4N2O7) 。B.2.2.6 酒石酸钾钠(C4H4KN a O6) 。B.2.2.7 苯酚(C6H5OH) 。B.2.2.8 亚硫酸钠(N a2S O3) 。B.2.3 试剂配制B.2.3.1 2.5m o l/m L果糖标准溶液: 准确称取0.0 4 5g( 精确至0.1m g)8 0烘干至恒重的果糖标准物质于5 0m L烧杯中, 加入约1 0m L热水, 待果糖溶解后, 冷却至室温, 用水稀释至1 0 0m L容量瓶中,摇匀,4保存, 可放置1个月。B.2.3.2 乙酸溶液(2 0 0mm o l/L) : 吸取0.6m L冰乙酸, 用水稀释至5 0m L,4保存, 可放置2个月。B.2.3.3 乙酸钠溶液(2 0 0mm o l/L) : 称取1.3 6g三水乙酸钠( 精确至0.0 1g) , 溶于水并稀释至5 0m L,4保存, 可放置2个月。B.2.3.4 乙酸钠缓冲溶液(p H4.5) : 吸取1 4m L乙酸溶液和1 1m L乙酸钠溶液混合, 并用水稀释至5 0m L, 用时现配。B.2.3.5 1 0%菊粉溶液: 准确称取1 0g( 精确至0.0 1g) 菊粉, 用约5 0m L热水溶解, 冷却至室温, 用乙酸钠缓冲溶液稀释至1 0 0m L容量瓶中, 摇匀,4保存, 可放置1个月。B.2.3.6 氢氧化钠溶液(2m o l/L) : 称取8 0g氢氧化钠( 精确至0.0 1g) , 溶于水中并稀释至10 0 0m L,室温下可放置2个月。B.2.3.7 3,5 -二硝基水杨酸溶液: 将6.3g二硝基水杨酸和2 6 2m L2m o l/LN a OH溶液, 加到5 0 0m L含有1 8 5g酒石酸钾钠的热水溶液中, 再加5g苯酚和5g亚硫酸钠, 搅拌溶解, 冷却后用水稀释至10 0 0m L, 贮于棕色瓶中备用。G B5 0 0 9.2 5 52 0 1 61 1 B.2.4 仪器和设备B.2.4.1 恒温水浴锅: 控温精度1。B.2.4.2 分光光度计: 带1c m玻璃比色皿。B.2.4.3 微量移液器:1 0 0L、10 0 0L。B.2.5 分析步骤B.2.5.1 待测酶的制备用乙酸钠缓冲溶液稀释测试酶样品, 控制酶活力浓度在1U/m L5U/m L范围内。B.2.5.2 测定B.2.5.2.1 果糖标准曲线的制作取6支1 0m L刻度试管, 编号, 按表B.2用去离子水配制不同浓度的果糖标准溶液。表B.2 果糖标准溶液管号123456果糖原液量/m L00.1 0 00.2 0 00.3 0 00.4 0 00.5 0 0加水量/m L1.0 00.9 0 00.8 0 00.7 0 00.6 0 00.5 0 0果糖浓度/ (m o l/m L)00.2 5 00.5 0 00.7 5 01.0 01.2 5 在上述各试管中分别加入0.5m L3,5 -二硝基水杨酸溶液, 混匀后于沸水浴中加热1 0m i n。取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温, 用水定容至5m L, 混匀, 以1号试管为空白, 用分光光度计测定波长5 4 0n m处的吸光值。以吸光值为纵坐标, 果糖质量浓度为横坐标, 绘制标准曲线。B.2.5.2.2 菊粉酶活力的测定取1 0m L刻度试管, 用微量移液器准确移取0.9m L1 0%菊粉溶液, 准确加入待测酶0.1m L, 在5 51恒温水浴保温2 0m i n, 沸水浴中加热5m i n, 以终止酶促反应。在相同的条件下, 以沸水浴钝化酶液作为试剂空白。再向该溶液中加入0.5m L3,5 -二硝基水杨酸溶液, 混匀后于沸水浴中加热1 0m i n。取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温, 用水定容至5m L, 混匀。用分光光度计测定波长5 4 0n m处的吸光值, 由标准曲线计算待测酶测定液中和试剂空白测定液中果糖的质量浓度。B.2.6 计算果聚糖酶活力按式(B.2) 计算:X=(c-c0)VVx2 0(B.2) 式中:X 果聚糖酶活力, 单位为活力单位每毫升(U/m L) ;c 待测酶测定液中果糖的摩尔浓度, 单位为微摩尔每毫升(m o l/m L) ;c0 试剂空白测定液中果糖的摩尔浓度, 单位为微摩尔每毫升(m o l/m L) ;V 酶水解液最终定容体积(5m L) , 单位为毫升(m L) ;Vx 待测酶的用量, 单位为毫升(m L) ;2 0 反应时间, 单位为分(m i n) 。