高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室,高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用),第一步,第二步,第三步,第四步,准备,开,机,注意,事项,清洁,关机,步 骤,Agilent1100,系统组成,本系统由溶剂,输送泵,（四元泵，标配真空脱气机）,Rheodyne 7725i手动,进样阀,柱温箱,VWD紫外-可见,检测器,Agilent1100色谱数据,工作站,和,电脑,等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。,第一步、,准 备,1,、,准备所需的流动相，用合适的,0.45m滤膜,过滤，超声脱气20min。,2,、,根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。,3,、,配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45m滤膜过滤。,（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）,4,、,检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。,接通电源，依次开启不间断,电源,、,真空脱气机,、,四元泵,、,检测器,，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱,工作站,。,第二步、,开 机,一）,参数设定,1,、,波长设定,：,2,、,流速设定：,3,、,流动相比例设定：,4,、,梯度设定,：,二）,更换流动相并排气泡,1,：,将吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；,2,：,顺时针转动泵的排液阀180，打开排液阀；,3,：,运行泵，泵以,3ml/min,的流速冲洗,5min,（可设定）后泵流速设为0ml/min；,4,：,将排液阀逆时针旋转,适度拧紧,，关闭排液阀。,5,：,如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。,三）平衡系统,用检验方法规定的,流动相冲洗系统,，一般最少需6倍柱体积的流动相。,检查各管路连接处,是否漏液,，如漏液应予以排除。,观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应,不超过1MPa,。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按,检查管路后再,操作。,观察,基线变化,。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为25mmol/L,的缓冲液,4.,每天冲洗柱,5.,稳定进样条件,调节流动相,6.,采用保护柱,二、,保留时间缩短,1.,流速增加,2.,样品超载,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度增加,1.,检查泵,重新设定流速,2.,降低样品量,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,三、,保留时间延长,1.,流速下降,2.,硅胶柱上活性点变化,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度降低,1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡,2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱,3.流动相PH值保持在37.5检查柱的方向,4.防止流动相蒸发或沉淀,5.柱恒温,四、出现肩峰或分叉,1.样品体积过大,2.,样品溶剂过强,3.柱塌陷或形成短路通道,4.柱内烧结不锈钢失效,5.进样器损坏,1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.采用较弱的样品溶剂,3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.更换进样器转子,五、,鬼峰,1.,进样阀残余峰,2.,样品中未知物,3.,柱未平衡,4.,三氟乙酸,(TFA),氧化,(,肽谱,),5.,水污染,(,反相,),1.,每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗,2.,处理样品,3.,重新平衡柱,用流动相作样品溶剂,(,尤其是离子对色谱,),4.,每天新配,用抗氧化剂,5.,通过变化平衡时间检查水质量，用,HPLC,级的水,六、基线噪声,1.,气泡,(,尖锐峰,),2.,污染,(,随机噪声,),3.,检测器灯连续噪声,4.,电干扰,(,偶然噪声,),5.,检测器中有气泡,1.流动相脱气,加柱后背压,2.,清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂,3.更换氘灯,4.采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等),5.流动相脱气,加柱后背压,七、,峰拖尾,1.,柱超载,2.,峰干扰,3.,硅羟基作用,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,柱塌陷或形成短路通道,6.,死体积或柱外体积过大,7.,柱效下降,1.,降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相,2.,清洁样品,调整流动相,3.,加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相,PH,值,钝化样品,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,6.,连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管,7.,用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱,八、,峰展宽,1.,进样体积过大,2.,在进样阀中造成峰扩展,3.,数据系统采样速率太慢,4.,检测器时间常数过大,1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%,2.进样前后排出气泡以降低扩散,3.设定速率应是每峰大于10点,4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%,八、,峰展宽,5.,流动相粘度过高,6.,检测池体积过大,7.,保留时间过长,8.,柱外体积过大,9.,样品过载,5.增加柱温,采用低粘度流动相,6.用小体积池,卸下热交换器,7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱,8.将连接管径和连接管长度降至最小,9.进小浓度小体积样品,Thank You!,E-mail：,yangwuliang,Tel：[phone]（Office),0791-7118659 (Lab.),