细菌药物敏感性试验和标准化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,药敏试验的意义,查出耐药，减少治疗错误，便于医生选择个体化疗方案、节省费用,进行,耐药监测,为医院感染控制部门提供防治依据，为经验用药提供可靠依据。,2006细菌数据-xiugai.xls,利用耐药监测结果控制抗菌药物应用，减少耐药菌株的出现，延长新药使用寿命。,为新药的研究和评估提供有价值的信息。,药物敏感试验规则,我国主要以临床实验室标准委员会(CLSI),NCCLS-2007英文版-M100S17E.pdf,的规则为规则,德国、欧洲标准,根据主要作用靶位的不同，抗菌药物的作用机制可分为；,干扰细菌细胞壁的合成，使细菌不能生长、繁殖；,损伤细菌细胞膜，破坏其屏障作用；,影响细菌细胞蛋白质的合成，使细菌丧失生长、繁殖的物质基础；,影响核酸的代谢，阻碍遗传信息的复制；其他。,抗生素的作用机制,表1抗菌药物的主要作用部位,细胞壁合成,细胞膜渗透性,细菌蛋白质合成,核酸合成,叶酸合成,-内酰胺类,多粘菌素B,四环素,利福霉素类,磺胺类,万古霉素,两性霉素B,氯霉素,灰黄霉素,甲氧苄啶,磷霉素,制霉菌素,大环内脂类,喹诺酮类,环丝氨酸,吡咯类,林可霉素类,甲硝唑,米糠唑,氨基糖甙类,呋喃类,酮康唑,夫西地酸,新生霉素,杆菌肽,莫比罗星,香豆霉素,抗菌药物品种,1、,-内酰胺类,2、氨基糖甙类,3、喹诺酮类,4、大环内酯类,5、多肽类,6、抗真菌类,内酰胺类抗生素包括青霉素类、头孢霉素和不典型的内酰胺类抗生素，主要抑制粘肽合成的第3步，阻止粘肽链的交叉连接，使细菌无法形成坚韧的细胞壁。,第二代头孢菌素的抗菌谱比头孢唑林（cefazolin）等第一代头孢为广。对耐药金葡菌等革兰阳性菌的抗菌作用稍次于第一代，但对革兰阴性菌的作用更强，头孢呋辛（cefuroxime）是第二代头孢中较好的品种。,第三代头孢菌素的主要特点是对各种革兰阴性杆菌包括绿脓杆菌的抗菌作用突出，肾毒性低，对-内酰胺酶稳定。,头孢噻肟（cefotaxime）对肠杆菌科细菌的作用优于其他第三代品种，对酶稳定，毒性低；但在体内代谢，抗菌作用减弱，严重感染用药量需高；此外，对绿脓作用较差。,头孢他啶（ceftazidime）是头孢菌素中对绿脓杆菌作用最优的品种，对不动杆菌属、葡萄糖不发酵革兰阴性杆菌也有一定作用；毒性低，几无肾毒性；对-内酰胺酶稳定；对免疫功能不全者感染具有良好疗效。,第四代头孢菌素主要特点抗菌谱广，如头孢吡肟，对肠杆菌科细菌的抗菌活性要强于头孢他啶，对铜绿假单胞菌活性要优于头孢噻肟，但略低于头孢他啶。对革兰阳性球菌，特别是其中的耐青霉素肺炎链球菌的杀菌活性较第三代头孢菌素明显增强。但对厌氧菌和甲氧西林耐药的金葡菌(MRSA）作用仍不理想。,非典型-内酰胺类,主要包括头霉素、头孢烯类、碳青霉烯类、单环-内酰胺类和-内酰胺酶抑制剂等,头孢西丁（cefoxitin）并非头孢菌素，实属头霉素类。其抗菌谱与第二代头孢相似，但对包括脆弱类杆菌在内的各种厌氧菌具良好的抗菌活性；毒性低；对酶非常稳定。适用于腹部外科、妇产科、口腔科等的需氧菌与厌氧菌的混合感染。,氨曲南（aztreonam）属单环-内酰胺类。其抗菌谱狭窄，对肠杆菌科细菌、气单胞菌属、流感杆菌、淋球菌等具相当强的抗菌作用。但不动杆菌属、产碱杆菌和各种厌氧菌对本品的敏感性差。,主要用于严重的革兰阴性菌感染，对伴有粒细胞减少和脓毒症的癌症患者感染也可获良好的疗效。,克拉维酸（clavulanic acid）和舒巴坦（sulbactam）他唑巴坦三种-内酰胺类的抑制剂，与青霉素或头孢菌素类联合应用时，可保护-内酰胺类药物不被酶破坏，扩大临床应用适应症。,克拉维酸+替卡西林,酶抑制剂 舒巴坦+头孢哌酮,他唑巴坦+哌拉西林,氨苄西林舒巴坦（unasyn，优力新）主要用于产酶的流感杆菌、淋球菌、卡他布拉汉菌、肠杆菌科细菌、金葡菌、表葡菌、肠球菌属、脆弱类杆菌等感染。该静脉注射与肌注制剂在国内临床应用，取得良好疗效。,碳青霉烯类抗生素:亚胺培南（imipenem）。抗菌谱极广，抗菌活性甚强，对革兰阴性菌和阳性菌、需氧菌和厌氧菌，以及多重耐药或产-内酰胺酶的细菌皆有良好的抗菌作用，其毒性低。,适用于严重的革兰阴性菌感染、混合感染和免疫功能缺陷者感染。,亚胺培南的独特结构,特异的,（反式结构）,羟乙基侧链-内酰胺环，此侧链正好遮挡了细菌的内酰胺酶结合点，细菌产生的多种酶不能与内酰胺环结合，因此不被分解。,阿米卡星的抗菌谱与庆大霉素相似，其抗菌活性优于卡那霉素，但次于庆大霉素，其肾毒性与耳蜗及前庭功能损害与庆大霉素无明显差别。,氨基糖甙类,奈替米星的抗菌作用与庆大霉素相似；对各种氨基糖甙类钝化酶较稳定，但不如阿米卡星，故耐庆大霉素菌株的作用不如阿米卡星。其耳、肾较庆大霉素为低。主要用于严重的革兰阴性杆菌感染。,氟喹诺酮类,抗菌谱广，对革兰阴性杆菌包括绿脓杆菌均具良好抗菌活性，对革兰阳性菌也有一定作用，对临床分类的耐药菌株呈一抗菌活性。,口服生物利用度较高，组织分布好，细菌内穿透力强，适用于细胞内感染。,第一代：萘啶酸,第二代：氧氟沙星，环丙沙星,第三代：左氟沙星，帕珠沙星,第四代：加替沙星，莫西沙星,氟喹诺酮类主要适应症为：,（1）泌尿系感染：单纯性、复杂性尿路感染、细菌前列腺炎、淋病等；,（2）胃肠道感染：菌痢、旅游者腹泻、胃肠炎等；,（3）耐药菌株所致伤寒及其他沙门菌属感染；,（4）呼吸系感染，革兰阴性菌支气管及肺部感染，鼻咽部耐甲氧西林金葡菌带菌者；,（5）革兰阴性杆菌骨髓炎、关节炎；,（6）革兰阴性杆菌所致其他感染，如皮肤软组织 感染、五官与伤口感染等；,（7）联合用药用于不能耐受万古霉素的耐甲氧西林金葡菌感染。,亦用于沙眼衣原体、支原体、耐药结核杆菌和其他分支杆菌感染等胞内感染。,临床广泛应用后必然导致耐药性的提高，应引起高度重视。,大环内酯类,阿齐霉素（azithromycin）、克拉霉素（clarithromycin）抗菌作用不如红霉素，但半衰期较长，每日只需服药2次，除一般革兰阳性菌感染外，可用于支原体、军团菌、衣原体等引起的特殊感染。,大环内酯类抗生素,多肽类,万古霉素、去甲万古霉素的抗菌谱与药理特点相似，后者的作用较万古霉素略强。,主要对革兰阳性菌有强大抗菌活性。特别耐甲氧西林金葡菌（MRSA）与表葡菌（MRSE），及肠球菌属对本品非常敏感，几无耐药菌株。本品有明显的耳、肾毒性，轻症感染者不宜选用；,多肽类抗生素,临床常用稳可信具有独特的作用机制：,（1）抑制细菌细胞壁的合成;,（2）损害细菌细胞膜，改变细胞膜通透性，破坏其屏障作用；,（3）阻碍细菌RNA的合成影响遗传信息的复制。,抗真菌药,咪唑类：氟康唑（fluconazole）不仅抗真菌谱广，而且口服吸收迅速而完全，血药浓度高，蛋白结合率低（12%），组织分布好，可透过血脑屏障。临床上已用于各种真菌深部感染，包括败血症、脑膜炎等可获良好疗效。,达托霉素,为脂肽类抗生素,其抗菌谱与万古霉素和替考拉宁相似,但对MRSA有效,主要作用机制是扰乱细胞膜对氨基酸的转运,从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的合成,以及改变细胞膜的性质,为浓度依赖型抗生素,其抗菌作用比万古霉素及替考拉宁高。,雷莫拉宁,雷莫拉宁(ramoplanin)属于缩酚酞类(depsipeptide)抗生素,对艰难梭菌、耐万古肠球菌（VRE）和MRSA有效。将成为抗耐药菌的有效药物。,阳离子多肽,与其它抗菌药物相比，其体外抗菌活性几乎无区别，但其对一些耐药菌，如绿脓杆菌、不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、MRSA、VRE、产ESBLs的大肠菌和多重耐药革兰阴性杆菌的抗菌活性相比，可与目前最好的抗菌药物相媲美。其MIC为1-8g/ml，且耐药菌与敏感菌无区别。,恶唑烷酮类抗菌药物,20世纪80年代后期，杜邦公司开发了恶唑烷酮类抗菌药物，其后普强公司合成了两个新的化合物，即羟哌恶酮（eperezolid）和吗啉恶酮（linezolid），具有很好的治疗效果，吗啉恶酮于2000年上市，吗啉恶酮和吗啉恶酮对许多革兰阳性菌有抗菌活性。（表）,5链阳性素（streptogranin）,RP59500是一种由两个半合成的链阳性菌素组成，即由链阳性菌素B（喹奴普宁，quinupristim）和链阳性菌素A（达福普宁，dalfopristim）以30：70比例组成的化合物，可治疗各种耐药菌所引起的重症感染，包括MRSA菌血症、肠球菌性菌血症，不良反应少，可作为万古霉素的替代药物，用于治疗不能耐受万古霉素治疗的病人。,课间休息,感恩的心.mp3,感恩.ppt,细菌药物敏感性试验及其标准化,方法分类,纸片扩散法（耐药监测常用方法）,肉汤（宏量和微量）和琼脂稀释法,Etest法,仪器法,操作方法,原理,培养基的制备及注意事项,接种物的制备及接种,贴药敏纸片,孵育,判读,纸片扩散法(Kindy-Bauer,KB法),K-B法原理,按说明书配制一定浓度的培养基原液,高压灭菌,冷却至50摄氏度左右调节pH至7.2-7.4（加添加剂）,制板，,厚度为4mm,，水平,冷却至室温使用或储存,注意事项：1、全程无菌操作2、湿度控制,3、,胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影响,4、培养基用水5、质控,操作流程,培养基,Mueller-Hinton琼脂培养基（非苛氧菌）,HTM培养基：其组成成分如下：M-H琼脂粉；15,/ml牛羟基血红素；PH7.2-7.4；NCCLS不推荐用M-H巧克力培养基作嗜血杆菌药敏试验。（嗜血杆菌）,GC琼脂.此补充品(1升水中加入1.1g L-胱氨酸,0.03g 盐酸鸟嘌呤,3mg盐酸硫胺,13mg对鞍基苯甲酸,0.01g维生素B12,0.1g辅羧酶,0.25gNAD,1.0g腺嘌呤,10gL-谷氨酰胺,100g葡萄糖,和0.2g硝酸铁)是在GC琼脂高压灭菌后加入的.（淋病奈瑟菌）,57%脱纤维羊血的M-H琼脂（链球菌）,培养基厚度,4mm,是影响KB法准确性最重要的因素,接种物的制备,1.,直接菌落悬液法,多用,广泛,2.生长法,少用,局限性,3.,注意事项：,嗜血杆菌、淋球菌配制菌悬液必须采用巧克力培养基上的菌落作,直接悬浮法,。菌液浓度应严格要求0.5麦氏单位,接种物浊度调整好后,最好在,15分钟,内接种,用无菌棉拭子蘸取调好的菌液,在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次,挤出多余的接种菌液。用棉拭子在无菌的稍干燥的M-H琼脂表面划线接种，再重复操作两次，每次将平板转动约60度，保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹琼脂的边缘。在加含药的纸片之前，可以将培养皿盖半开3-5分钟，但不超过15分钟，促使表面过多的水分被吸收。,试验平板的接种,常规药敏试验的选药原则,基本原则,临床标本不能直接做药敏试验,目的：以准确结果回报临床,不应在同一平板做混合菌药敏试验,与感染无关菌株（定植菌）不做药敏试验,判断标准：一菌一药一规则,选择原则应考虑到药物临床疗效、耐药菌株流行情况、预防耐药菌株产生和经济的综合因素，最终目的是达到控制感染,选择抗菌药物进行常规药敏试验时应考虑：,所选药物应包含于本单位的处方手册中,结合所在医疗机构的类型、规模及病人的构成的情况,针对具有不同耐药机制的菌种的最适抗菌药物也不同,恰当限制常规药敏试验中药物的数目,目前应用于临床的抗生素的数目不断增多，大多数实验室不可能将所有的药物均同时进行药敏试验,恰当限制常规药敏试验中药物的数目,抗生素的不合理应用导致新的耐药机制不断被发现，使药物选择更加困难,预测药物,同一类药物中，有很多具有相同或相似的体外活性，其差别主要在药代动力学、毒性等方面，因此很多情况下一种抗菌药可作为其它一种或几种密切相关的药物的代表进行常规药敏试验,常用实验药物及其代表的药物,试验药物,可被推测的药物,苯唑西林,所有青霉素、头孢菌素、,-,内酰胺酶抑制剂复合药、碳青霉烯类,四环素,多西环素、米诺环素、金霉素、土霉素,红霉素,罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素,克林霉素,林可霉素,根据抗生素的作用特点选择抗生素,青霉素类,分类,代表药物,主要抗菌谱,不耐青霉素酶类,青霉素G,不产,-,内酰胺酶的革兰阳性菌（作用最强）、某些营养要求高的革兰阴性菌,氨基类,氨苄西林、阿莫西林,还可对部分肠杆菌科细菌,羧基类,羧苄西林、替卡西林,还可对铜绿假单胞菌,酰脲基类,美洛西林、哌拉西林,还可对铜绿假单胞菌,耐青霉素酶类,甲氧西林、苯唑西林、邻氯西林、奈夫西林,革兰阳性菌，如产青霉素酶的葡萄球菌,根据抗生素的作用特点选择抗生素,头孢菌素,分类,代表药物,抗菌谱评价,第一代,头孢唑啉、头孢噻吩、头孢拉定、头孢氨苄等,对革兰阳性菌作用强，对革兰阴性菌较差,第二代,头孢呋辛、头孢克罗、头孢孟多等,对革兰阳性菌作用较第一代弱或相似，对革兰阴性菌作用较优,第三代,头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑肟、头孢克肟等,对革兰阳性菌作用弱于第一代和第二代，对革兰阴性菌显著超过第一代和第二代,第四代,头孢匹罗、头孢吡肟、头孢克定等,对某些耐第三代药物的革兰阴性菌仍有效，头孢吡肟对革兰阳性菌也有高效,一些特殊菌株引起的感染在选药时有特殊的要求,例如：,沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种第三代头孢菌素的敏感性,对与肠球菌属，头孢菌素类、氨基糖甙类、复方新诺明和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，所以不能报告对这些药物敏感,常见耐药菌的筛选药物,耐药菌,筛选药物,耐甲氧西林葡萄球菌,苯唑西林,超广谱,-,内酰胺酶（ESBLs）,筛选：头孢泊肟或头孢他啶或氨曲南或头孢噻肟或头孢三嗪,确证：头孢他啶、头孢他啶/棒酸,头孢噻肟、头孢噻肟/棒酸,氨基糖甙类呈耐药性的肠球菌（HLAR）,高水平庆大霉素、链霉素,对青霉素耐药的肺炎链球菌（PRP）,筛选：苯唑西林；确证：青霉素MIC,耐万古霉素的肠球菌（VRE）,耐万古霉素的葡萄球菌（VRS）,万古霉素,药物敏感试验的规则,目前，我国绝大多数临床微生物实验室均参考美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS),NCCLS-2007英文版-M100S17E.pdf,出版的对各类细菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南,NCCLS推荐的选药标准,肠杆菌科细菌,铜绿假单胞菌和不动杆菌属,葡萄球菌属,肠球菌属,A组首选试验和报告,氨苄西林,头孢唑林,头孢噻吩,庆大霉素,美洛西林或替卡西林,哌拉西林钠,庆大霉素,头孢他啶,青霉素,苯唑西林,青霉素或氨苄西林,B组首选试验选择性报告,美洛西林或哌拉西林钠,阿莫西林/棒酸,哌拉西林/他唑巴坦,头孢吡肟,亚胺培南,头孢吡肟,头孢哌酮,氨曲南,亚胺培南,丁胺卡那,妥布霉素,环丙沙星,万古霉素,克林霉素,阿齐霉素或红霉素,甲氧苄啶/磺胺甲恶唑,万古霉素,NCCLS推荐的选药标准（序）,肠杆菌科细菌,铜绿假单胞菌和不动杆菌属,葡萄球菌属,肠球菌属,C组补充选择性报告,头孢他啶,氨曲南,卡那霉素,乙基西梭霉素,四环素,氯霉素,头孢噻肟或头孢曲松,乙基西梭霉素,氯霉素,甲氧苄啶/磺胺甲恶唑,庆大霉素,环丙沙星,氯霉素,利福平,四环素,庆大霉素（只用于高水平耐药筛选）,链霉素（只用于高水平耐药筛选）,D组作为补充只用于尿路感染,羧苄西林,西诺沙星,呋喃妥因,复方新诺明,羧苄西林,洛美沙星,复方新诺明,洛美沙星和诺氟沙星,呋喃妥因,复方新诺明,环丙沙星,诺氟沙星,呋喃妥因,四环素,每个实验室都应决定表中的哪些药物用于常规报告（A组），哪些仅选择性报告（B组），但当临床需要时也应该提供B组常规报告的药敏结果,将事先确定的抗微生物药组合的纸片分贴到接种好菌的琼脂平板表面。每个纸片应与琼脂表面完全接触，并且应均匀分布，,使其中心间距不小于24mm。,贴完纸片后，应在15分钟内，将平板反转过来，置于35孵箱中。,在接种好的琼脂平板上贴加纸片,注意事项：,1、150mm平板所贴纸片不应超过12个，100mm的不应超过5个，嗜血杆菌,要求150mm平板贴纸片不应超过9张,，,100mm平皿贴纸片不应超过4张,2、纸片一但接触了琼脂表面，就不应再挪动位置,3、,除嗜血杆菌，淋球菌、链球菌等外，,平板不应在CO,2,含量高的空气中孵育，因为其解释结果是根据普通空气中的孵育结果研究出的，而CO,2,会显著改变某些药物的抑菌圈大小。,药物选择注意,参考推荐表,标志性药物不可少，如：OX-,STAPH,，CN120-,ENTEROCOCCI,纸片顺序可做调整，如：测定,E.coli,和,Klebsiella pneumoniae,时CAZ、CTX纸片贴在含酶抑制剂的纸片如AMC旁边，初步提示是否产ESBLs,A.,-内酰胺类药物纸片应密封包装并冷冻，少量正用的纸片可冷藏(4-8,C,)一周。某些不稳定的药物（如亚胺培南，头孢克洛，克拉维酸复合药等）也应冷冻保存直至用的当天，以尽量保持其稳定性。,B.平衡至室温后使用防止热空气接触冷纸片时产生冷凝水,C.装有纸片的塑胶管从密封包装中取出后应至于密封的干燥容器中，在使用纸片分配器时，应注意干燥剂指示剂颜色的变化。,D.过期纸片均应弃去。,药敏纸片的保存,孵育16-18小时后，检查每一块平板，如果平板划线满意,接种物准确无误，抑菌圈应为正圆形，菌落应相互融和生长。如果出现明显的单个菌落，则接种量太少，必须重复试验。,注意：,联合药敏试验,葡萄球菌或肠球菌,变形杆菌属,用加血培养基测试链球时,甲氧苄啶和磺胺,判读平板和解释结果,caz,amc,CTX,CAZ,AMC,CTX,测量工具,游标卡尺（图）,普通直尺,KB试验中常见的错误来源,抄录质控数据时的书写错误,测量抑菌圈直径的读数错误,菌株有污染,错误的孵育温度或气体,试验用培养基的质量不合格，尤其厚度,纸片在试验室取用或贮存的过程中失效。,接种菌悬液太浓或太淡,判读标准错误,质控的重要意义,监测药敏试验的精密度和准确性,监测试验所用试剂质量,监测进行试验和判读结果的工作人员的操作是否正规,使用ATCC菌种进行质量保证，其目的是训练操作人员如何准确地进行药敏试验并得到可靠的结果，保证每个操作者具有正确进行药敏试验的能力。同时，可用以评价结果的准确性。,质控内容,A.关于仪器,孵育箱、冰箱、CO,2,孵育箱、自动化仪器,B.关于试剂,C.操作方法规范化,质控操作,同日常工作(操作,药敏纸片,培养基等),质控频率,质控菌株,大肠埃希菌ATCC25922,大肠埃希菌ATCC35218,（仅被推荐用于B-内酰胺霉抑制剂复合药，如含克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦的复合药的试验质控。）,铜绿假单胞菌ATCC27853,金黄色葡萄球菌ATCC25923,粪肠球菌ATCC29212,（可用于监测M-H琼脂中药物抑制剂的水平是否低得可以接受。也可用于高含量氨基糖苷类纸片的质控。）,流感嗜血杆菌ATCC49247（HTM时用）,流感嗜血杆菌49766（HTM时用）,淋病奈瑟菌ATCC49226（GC琼脂时用）,肺炎链球菌ATCC49619（M-H羊血琼脂时用）,Dilution susceptibility test,broth dilution testagar dilution test,agar dilution test,抗生素稀释梯度,不同抗菌药物对不同的特定细菌所设置的抗菌药物梯度不同，抗生素浓度梯度应包含临床有价值的稀释浓度其最高浓度应高于血液或局部组织液的峰值，最低浓度应低于对照菌的MIC值。,32 16 8 4 2 1 0.5 0.25,agar dilution test,倾注平板,将配置好的不同浓度的抗菌药物按预置比例加入已平衡温度（45-55）琼脂液中，使其成为不同浓度梯度测试系列。,agar dilution test,菌悬掖配制,将待测菌配制成1.510,8,/ml浓度。用多头接种器或加样器在每一浓度梯度的肉汤或琼脂中加入菌悬液使其达最终浓度（琼脂稀释法为10,4,/点。）,置35培养18-24小时，观察结果。,agar dilution test,结果的解释,最低抑菌浓度：,minimal inhibition concention（MIC）,以能抑制细菌生长的抗菌药物的最低浓度,MIC,90,能抑制90%被测细菌的抗生素的浓度。,MIC,50,能抑制50%被测细菌的抗生素的浓度。,最低杀菌浓度（MBC）,将最低抑菌浓度和低两个梯度培养液转种到琼脂或血平皿，置35培养18-24小时，观察有无细菌生长，最低抗菌药物浓度不生长细菌的浓度为,结果报告 应将MIC值和“解释”标准同时报告给临床医生（如0.03/ml,敏感。,Broth dilution test,将抗生素按不同浓度加到肉汤中,接种相同量的菌量,孵育,判读,质控菌株,大肠埃希菌ATCC 25922,大肠埃希菌ATCC 35218,铜绿假单胞菌ATCC 27853,金黄色葡萄球菌ATCC 29213,金黄色葡萄球菌ATCC 43300,粪肠球菌ATCC 29212,粪肠球菌ATCC 51299,流感嗜血杆菌ATCC 49247（HTM时用）,淋病奈瑟菌ATCC 49226（GC琼脂时用）,流感嗜血杆菌ATCC 49766（HTM时用）,链球菌ATCC 49629（CAMHB时用）,Etest试验,原理,步骤（同纸片扩散法）,酵母样真菌药敏试验,简介,1ATB-FUNGUS,由法国生物梅里埃公司生产销售。药敏试条由16对小孔组成，第一对小孔不含任何抗菌药物，作正常生长的对照孔，另14对小孔含6种抗真菌药物，最后一对小孔为空白。将被测细菌悬浮在蒸馏水或生理盐水中，定量加入到生长培养基，并将其接种到药敏试条中，于3018-24小时孵育后用肉眼或ATB仪器自动观察生长与否，根据测定孔与对照孔生长程度比较确定待测菌的敏感性。,2Etest,依照说明书操作。,3.纸片法（几个公司不同）,特殊耐药机制的检测,(1)了解临床常见菌种天然或固有耐药性；,（2）发现异常和罕见的细菌耐药表型；,（3）了解对特殊菌种易引起选择性耐药的抗菌药物，建议临床医生尽可能不用或避免长期使用；,(4)认识代表性药物在药敏试验中的作用。,1.葡萄球菌的耐药机制,金葡菌和路邓葡萄球菌判定标准,纸片法(mm)苯唑西林MIC(g/ml),R I S R S,头孢西丁纸片 19 -20 4 2,苯唑西林纸片 10 11-12 13 4 2,纸片法(mm)苯唑西林MIC(g/ml),R I S R S,头孢西丁纸片 24 -25 0.5 0.25,苯唑西林纸片 17 -18 0.5 0.25,凝固酶阴性葡萄球菌判定标准,葡萄球菌中用头孢西丁查,mecA,-介导的耐药性,头孢西丁抑菌圈(mm),Res,Susc,金葡菌,19,*,20,*,CoNS ,24,*,2,5,*,*报告苯唑西林耐药,*报告苯唑西林敏感,CLSI/NCCLS M100-S15 Table 2C(M2,M7),44,报告,MRS（包括MRSA和凝固酶阴性的葡萄球菌）无论其体外试验的结果敏感与否，应报告对所有的-内酰胺类抗生素耐药，包括头孢菌素和亚胺配南，因为大多数MRS感染者临床上对上述抗生素没有反应。,方 法 VISA VRSA,纸片法 不能检测 抑菌圈内有稀薄的生长,微量肉汤稀释法 可检测 可检测,琼脂稀释法 可检测 可检测,E试验（培养24h）可检测 可检测,自动化鉴定系统 结果不满意 结果不满意,VISA/VRSA检测方法,Inducible,clindamycin resistance,(,erm-,mediated),another example,“D Test”,positive,reaction,15-26 mm,Photos courtesy of J.Jorgensen and K.Fiebelkorn,.,“D Test”negative reaction,NO induction,(,msr,A,-,mediated erythromycin resistance),2、PRSP,过筛试验:,苯唑青霉素纸片（1g/ml）,MHA+5%羊血，菌落直接接种，35，5%CO2，20-24 h,QC:SPN ATCC 49619,确定试验:,稀释法测定青霉素等的MIC或用E-test,CAMHB+LHB（2-5%v/v）菌落直接接种，35，,20-24 h,QC:SPN ATCC 49619,ECO ATCC 35218(测定-Lac/酶抑制剂),3、肠球菌,PEN/AMP R 低亲和力PBPs,产-内酰胺酶（少数）,HLAR 氨基糖苷类钝化酶,APH（2）-AAC（6）,VRE D-丙氨酸-D-丙氨酸,变成D-丙氨酸-D-乳酸（VANA、B、D）,或变成D-丙氨酸-D-丝氨酸（VANC、E）,HLAR和VRE,意义,GEN/STR-HLAR筛选试验,R：对作用于细胞壁的抗生素（e.g.,AMP、PEN和VAN）无协同作用。,S：对作用于细胞壁的抗生素（e.g.,AMP、PEN和VAN）有协同敏感作用。,VRE筛选试验阳性,做MIC确认，并观察动力和色素鉴别菌种，以区分获得性耐药（VanA和VanB）及某些菌种存在的固有的中介（8-16）耐药（VanC），后者在感染控制中的意义与VRE不同。,ESBLs(extend spectrum lase)的检测,ESBL表型检查程序,NCCLS筛查试验,MIC,2,g/ml 纸片法,头孢泊肟 头孢泊肟,22mm,头孢他啶 头孢他啶,22mm,氨曲南 氨曲南,27mm,头孢噻肟 头孢噻肟,27mm,头孢曲松 头孢曲松,25mm,21,NCCLS表型确证试验,肉汤稀释法 纸片法,头孢他啶 0.25128,g/ml 头孢他啶30,g,头孢噻肟0.2564,g/ml 头孢噻肟30,g,加入4,g克拉维酸 加入10,g克拉维酸,MIC,3稀释孔 抑菌环增大,5mm,ESBL表型检查程序,22,2、Plasmid-mediated AmpC Issues,Laboratory Testing,Detection,False susceptibility,Infection Control,Not laboratory based,AmpC Disk Test,Lawn culture:,E.coli,ATCC 25922,Test isolate,on disk,3、碳青霉烯类酶,金属酶：,几乎能水解所有,-内酰胺抗生素,对氨曲南水解能力弱,能被EDTA、巯基丙酸抑制,S.maltophilia,Imipenem,Imipenem+EDTA,1 天然或固有耐药的菌属或菌种,有些菌属和菌种对某些抗菌药物天然耐药或固有耐药。因此，若药敏试验的结果为敏感应予以怀疑，有必要重复药敏试验和重新鉴定菌种，同时，细菌天然耐药也可作为菌种鉴定的辅助手段之一。表1列举了临床常见细菌的天然耐药表型。,2 罕见耐药谱型,影响体外药敏试验结果的因素很多，因此，加强临床微生物实验室的质控工作至关重要。当质控菌的结果在NCCLS要求的允许范围内，所出现的异常或罕见耐药表型应引起实验室工作人员的注意。,表2中介绍的耐药谱型在世界范围内均属罕见，如在日常药敏试验中发现并经复试依然出现相同的结果，应该将菌株送到参考实验室进行核实。,罕见耐药谱型,为什么检测耐药基因why,当MIC值位于或接近折点，表型检测难以确定耐药机制,金葡菌：OXA:2-8ug/ml,mecA 或,高水平-lactamase缓慢水解OXA,如能检测到mecA基因，则按MRSA，治疗使用万古,霉素，否则使用对青霉素酶稳定的内酰胺类，或内,酰胺类与酶抑制剂的复合药,直接从临床标本检测耐药基因或与耐药相关的基因突变，旨在获得培养结果前指导用药,肺炎链球菌：检测到pbpA,pbp2b基因的突变，提示对内酰胺类敏感性降低且可能对多种药物耐药,为什么检测耐药基因why,为什么检测耐药基因why,基因检测在对医院或社区特定耐药基因的流行监测方面优于耐药表型检测,肠球菌：vanA基因检测帮助了解肠球菌多重耐药的流行，表型检测不能区分vanA和vanB,作为“金标准”用于评价新的药敏方法,尤其是当临床菌株或实验室保存菌株的MIC值在临界范围时，耐药基因的检测可帮助判定表型药敏方法的正确性。,为什么检测耐药基因why,