酶底物法(科立得)产品培训.ppt

*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Click to edit Master title style,水中微生物检测的全球领导者,叶卫军电话：,13929538576,水中微生物检测,（新国标方法）,总大肠菌群,/,大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群,固定底物技术酶底物法介绍,总大肠菌群,/,大肠埃希氏菌 及耐热,(,粪,),大肠菌群,固定底物技术酶底物法,微生物检测的重要性,地震等自然灾害过后水体中会被大量微生物所污染，特别是粪便污染，如水体中含有肠道病原菌株，并被人饮用则会爆发严重疾病如泌尿系感染、菌血症和脑膜炎，少数肠道病原菌株可引起急性腹泻。,通常人们用投放含氯消毒剂进行消毒，但消毒效果如何还需要通过检测水体中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌来判断。,指示菌的方法学定义,总大肠菌群（,Total,Coliforms,),大肠菌群系指一群在37培养24,h,能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，,具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。,耐热大肠菌群,(,Thermotolerant Coliforms,)，原名：粪大肠菌群（,Fecal,Coliforms,),用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。,是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。,大肠埃希氏菌（大肠杆菌，,E.Coli,.),大肠埃希氏菌是指能产生,-,半乳糖苷酶（,-D-galactosidase,）,分解,ONPG,（,Ortho-nitrophenyl-,-D-galactopyranoside,）,使培养液呈黄色，能产生,-,葡萄糖醛酸酶（,-glucuronidase,）,分解,MUG,（,4-methyl-umbelliferyl-,-D-glucuronide,）,使培养液在波长,366,nm,紫外光下产生荧光的细菌。,大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分，,是水体受人畜粪便污染的最直接指标，水中含有大肠埃希氏菌提示有粪便污染。,背景知识,大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌,耐热大肠菌群,大肠埃希氏菌,大肠菌群,目前的粪大肠菌群检测方法是实际上是检测耐热大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。有关文献报道的试验结果表明,有,15%,的阳性耐热粪大肠菌群实际上属于总大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。这种情况的发生多数是由于耐热的克雷伯氏菌普遍存在于自然环境中，而非来源于人畜粪便，因此与人类疾病的产生也没有绝对的关联。同时，（用上述方法检测）会有,10%,的假阴性结果，是因为大肠埃希氏菌属有,10,不会产气（注,1,）。,注,1,：目前的粪大肠菌群检测方法，产酸产气是预试验的阳性判断指标。,粪便污染指示菌比较,总大肠菌群,耐热,(,粪,),大肠菌群,大肠埃希氏菌,肠球菌,亚硫酸盐还原菌,包含,菌属,埃 希 氏 菌 属、柠 檬 酸 菌 属、克 雷 伯 菌 属、肠 杆 菌 属（也 包 括 沙 雷 菌 属 和 哈 夫 尼 亚 菌属）,主 要 是 埃 希 氏 菌 属 和 耐 热 克 雷 伯 菌 属,大肠埃希氏菌,粪肠球菌、屎肠 球菌、耐久肠球 菌和海氏肠球菌 等,亚硫酸盐还原菌,来,源,可 来 自 人 畜 粪 便，环 境 中 自 然 存在,主 要 来 自 于 温 血 动 物 粪 便，也 可 来 自环境,主要来自温血 动物和人的粪 便,主要来自温血动 物和人的粪便,主要来自温血动 物和人的粪便,作为粪,便污染,指示菌,的意义,水处理的指示菌,不能作为消毒效果的指示菌,比较直接的指示菌,指示粪便污染 的 最 理 想 指 标、作为消毒 效果的指示菌,用于输配水系统 维修后或新输配 水管线铺设后水 质的检测、用于 饮用水中大肠杆 菌检测有争议的 粪致病菌指标,为间歇性粪便污 染的指标、过滤 效果评价的指标,我国水质微生物指标,(,细菌,),标准,指标菌,检测量,GB5749-2006,生活饮用水标准,菌落总数,总大肠菌群,大肠埃希氏或菌耐热大肠菌,菌落总数,:1ml;,大肠菌,100ml,CJ/T206,2005,城市供水水质标准,细菌总数,总大肠菌群、耐热大肠菌,细菌总数,1ml,总大肠菌群,/,耐热大肠菌群,:100ml,GB3838-2002,地表水环境质量标准,粪,(,耐热,),大肠菌群,1L,GB/T 14848-93,地下水质量标准,GB 9667-1996,游泳场所卫生标准,细菌总数、,总大肠菌群,细菌总数,1ml;,总大肠菌群,1L,检测方法,多管发酵法,（,Multiple Tube Fermentation,MTF),滤膜法,（,Membrane Filtration,MF),固定底物技术酶底物法,(Defined Substrate Technology,DST),酶底物法,(Enzyme Substrate Test,EST),检测方法,多管发酵法,（,MTF,）,共需,3-5,天时间,以,100,mL,水样中大肠菌最可能数,(,most probable number,MPN),表示,培养基,制备试管培养,（2226小时,）,阴性结果（无产酸，产气）,产酸，产气,平板培养1824小时,革兰氏染色，镜检,观察菌落形态，挑取特征菌落,证实试验（培养242,h，,有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在,）,检测方法,滤膜法,（,membrane filtration,MF,),共需,2-3,天时间,用孔径为,0.45,的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数,计数单位为菌落形成单位,CFU(colony forming unit),储备培养基的制备过滤（需器械灭菌等）培养,（22-24,H）,阴性结果(无典型菌落）,革兰氏染色 镜检,观察菌落形态,挑取特征菌落,证实试验,（培养,242,h,，,有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在）,酶底物法,总大肠菌群,阳性反应原理,-,半乳糖醛苷,-,半乳糖苷酶,酶底物法,大肠埃希氏菌,阳性反应原理,-,葡萄糖醛酸酶,4-,甲基-伞形葡萄糖苷酸,1,方法,本标准方法采用,固定底物技术,酶底物法,Defined Substrate Technology,DST,2,，,培养基,：,采用,M,inimal,M,edium,O,NPG-,MUG,，,简称,MMO-MUG,培养基,3,优点,假阳性,假阴性底,操作简单,快速,定性,定量（,51,孔,/97,孔定量盘法）,50,多个国家和组织认证,世界卫生组织,WHO,美国,EPA,水与废水标准检验法,.,生活饮用水标准检验方法,对酶底物法定义,科立得,应用,饮用水,源水,瓶装水,再生水,废水,食品水,畜牧用水,医疗用水,收录于,“,标准测试法,”,内,APHA,(,美国公共卫生协会,),US EPA,AOAC,US NCIMS,UK DWI,IBWA,WHO,假阳性比较：,vs,滤膜法,假阳性比较：,vs,滤膜法,*,Jacobs et al,AEM,1986.*,Fricker,et al,Water Res.,1997,报告者：英国泰晤士水务,样品来源：泰晤士河，样品数,450,个,假阳性比较,vs,滤膜法,*,Jacobs et al,AEM,1986.*,Fricker,et al,Water Res.,1997,产生的原因,传统方法培养基非选择性,会产生相似结果引起假阳性反应,培养基污染,样品交叉污染,操作误差,结论,试验证明可以用,Colilert,取代滤膜法进行大肠菌群和大肠埃希氏菌，还证明了,Colilert,DST,酶底物法是不受化学、外力等外界因素变化而变化的。,假阴性比较：,vs,滤膜法及多管法,*,Jacobs et al,AEM,1986.*,Fricker,et al,Water Res.,1997,假阴性率产生的原因,由于是非特异培养基所以会有杂菌干扰,清洁剂、盐、抗生素、毒素、温度等原因会造成抑制反应,非发酵大肠菌,膜过滤法的问题,过滤膜的损坏,m-endo,MF*,MTF,*,MLSB MF*,Colilert,*,0%,5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,*,Jacobs et al,AEM,1986.,*,Fricker,et al,Water Res.,1997,实验步骤：,Colilert,对比,滤 膜 法,滤膜法,72,步,科立得,:5,步,实验步骤：,97,孔定量盘法,vs,多管发酵,测试时间比较表,经济成本分析,传统方法,科立得,固定设备,无菌室、显微镜、抽滤设备等,封口机、紫外灯,耗材,滤膜、平皿、试管、总大肠菌群的培养基、大肠埃希氏菌培养基,科立得、定量盘,效率和人力,2-3,人，,3-5,天,1,人，,1,天,定性检测操作示范,2,步法,加入科立得试剂，,摇晃至溶解,3,6C,培养24小时，判断结果:,1,无颜色变化阴性,2,黄色总大肠菌群阳性,3，黄色且荧光大肠埃希氏菌阳性,44.5,培养24小时,判断结果：,1、无颜色变化阴性,2、黄色粪大肠菌群阳性,定量检测（,51孔定量盘）,5,步法,加入科立得试剂后，,摇晃至溶解,将,Colilert,溶液倒入,51孔（或,97,孔）定量盘,Quanti,-Tray,内,将定量盘,Quanti,-Tray,放入,程控定量封口机,Sealer,封口,3,6,或44.5,培养24后，计算呈阳性,反应的格子，然后对照,MPN,表,计数,定量检测（,51孔定量盘）,5,步法,固定底物技术酶底物法 科立得,所需试剂及设备,定性,科立得试剂,取样瓶,（可用玻璃瓶替代）,定量,科立得试剂,取样瓶,（可用玻璃瓶替代）,51,孔,/97,孔定量盘,程控定量封口机,Colilert,使用总结,检测指标,培养温度,(),定性检测,定量检测,(100ml),总大肠菌群和大肠埃希氏菌,(,同时,),361,黄色,:,总大肠菌群阳性,黄色,+,荧光,:,大肠埃希氏菌,51,孔,:1-200MPN,97,孔,:1-2419MPN,粪,(,耐热,),大肠杆菌,44.5,黄色,:,粪,(,耐热,),大肠菌群阳性,51,孔,:1-200MPN,97,孔,:1-2419MPN,科立得市场占有率,美国的市场占有率为,95%,欧洲的市场占有率为,90%,全国有,20,余家环境监测站（如北京、上海、四川、厦门、郑州、沈阳等）、,40,余家自来水公司、,35,家省市级疾病预防控制中心及水文站,应用案例,2004,年非典,爱德士捐赠科立得试剂给中国,CDC,及上海,CDC,抗拒非典,2008,年汶川地震,爱德士公司捐赠,1000,套科立得试剂到四川省,CDC,及环境监测站,2008,年奥运会,协助北京自来水及北京,CDC,完成奥运安全供水任务,与中国环境监测站、上海环境监测站及厦门环境监测站做了对比实验,案例分析,2004,年非典,爱德士捐赠科立得试剂给中国疾病预防控制中心及上海中国疾病预防控制中心抗拒非典,困难,解决,时间紧,24,小时出结果,任务重,操作简便，无需判断典型菌落，对实验员专业水平要求不高,责任大,国标方法，结果准确可靠,案例分析,2008,年汶川地震,爱德士公司捐赠,1000,套科立得试剂到四川省,CDC,及环境监测站,第一家捐赠试剂到灾区的厂家,困难,解决,条件恶劣,无需专用的无菌室,专业的操作人员少,操作简单，无需专门培训，只需根据颜色变化判读结果，对操作员要求低,保障安全供水,-,最快的检测出符合要求的水源,24,小时可检测出两个指标，结果准确，符合国标要求。,案例分析,2008,年奥运会,协助北京自来水及北京,CDC,完成奥运安全供水任务,困难,解决,检测频率高，水样多,操作简便，手工操作时间短,-1,分钟。,奥运期间，北京环境监测站全部使用科立得试剂作为日常检测,快速发现问题并解决,-,保障各世界运动员安全饮水,24,小时可检测出两个指标,数据准确，责任重大,国标方法，结果准确可靠,多管发酵法与科立得在检测粪大肠菌群的比较,中国环境监测站、上海环境监测站及厦门环境监测站检测几百组数据的结果,此文章发表在,中国环境监测,杂志,2008,年第,4,期,定性检测配置单,序号,产品编号,产品名称,单位,报价,1,98-12973-00,DST,酶底物法,24,小时科立得试剂,可作,200,个样品,200/,盒,2,98-09221-00,取样瓶,200,个,/,盒,120,毫升带,100,毫升刻度,含硫代硫酸钠,适用含氯水样,盒,3,98-14125-EU,6,瓦特可充电紫外灯,220V,366nm,个,4,培养箱,个,5,98-11682-00,阳性标准比色瓶,瓶,准确性,通过美国,EPA,认证,通过,生活饮用水卫生标准,认证,避免试剂直接加入时散落污染环境及操作员本身，同时也避免由于试剂加入不完全造成结果的不准确。,谢 谢 ！,