8.6免疫标记技术.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,抗原,：能刺激机体免疫系统诱导免疫应答并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。,一个,完整的抗原,应包括两方面的免疫性质：,免疫原性,指,诱导,宿主产生,免疫应答,的能力，具有这种能力的物质称为免疫原；,8.5,免疫标记技术,反应原性,指抗原与抗体或致敏淋巴细胞,发生特异性结合的能力,，亦称为反应原性。有些物质在独立存在时只,具有反应原性,而,无免疫原性,，称为,半抗原,；而免疫原通常同时具有免疫反应能力。,抗体,：,抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的,浆细胞,合成并,分泌,的与抗原有特异性结合能力的一组,球蛋白,，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是,抗体,。,抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个,B,淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为,单克隆抗体。,由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是,多克隆抗体,，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生,IgG,、,IgM,、,IgA,、,IgE,和,IgD,等五类抗体。,免疫应答,：是机体免疫系统对抗原刺激所产生的以,排除抗原,为目的的,生理过程,。这个过程是免疫系统各部分生理功能的综合体现，包括了,抗原递呈,、,淋巴细胞活化,、,免疫分子形成,及,免疫效应发生,等一系列的生理反应。,通过有效的免疫应答，机体得以维护内环境的稳定,免疫标记技术,用,荧光素,、,同位素,或,酶,等,示踪物质,标记抗体（或抗原）,进行抗原,-,抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行,定量,、,定性,或,定位,检测。免疫标记,技术,主要有三种基本类型：,免疫荧光技术,、,免疫酶技术,和,同位素标记技术,。,荧光免疫技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。是以,荧光物质标记,抗体,而进行,抗原,定位,的技术称为,荧光抗体技术,。,是将抗原抗体,反应的特异性,与荧光物质,检测的敏感性和直观性,结合起来的一种方法。,第一节 免疫荧光技术,一、基本原理,利用,荧光素标记抗体,，使之在涂片上或组织切片上与,标本,中的,待检抗原特异结合,，采用,高发光效率的,点光源,，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的,荧光素被,激发而产生荧光,，借助,荧光显微镜观察,底物片上荧光染色形态，来,判断有无待检抗原或抗体,。,荧光抗体是将荧光素（如,FITC,）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。,标记方法：,搅拌法,(,适合大样品,),透析法,(,适合小样品,),标记抗体的纯化：透析法,层析分离法,2.,荧光抗体的鉴定,F/P,比率（效价比）,：,将制备的荧光抗体稀释至,A,280,1.0,，分别测读,A,280,（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰,F/P,值越高,，说明抗体分子上结合的,荧光素越多,，反之则越少。一般用于,固定标本,的荧光抗体以,F/P,1.5,为宜，用于,活细胞,染色的以,F/P,2.4,为宜。,抗体效价,：效价越大标记抗体的特异性越高，非特异荧光越少。,效价在,1:16-1:32,者较为理想,抗体特异性,：免疫电泳和交叉免疫电泳观察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照射下发出强烈荧光,二 免疫荧光显微技术,基本原理,：,使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光,。,1.,标本的制作,标本切片要求尽量薄些，标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。,标本主要有组织、细胞和细菌三大类；,组织材料,可制备成,石蜡切片,或冷冻切片；,细胞或细菌,可制成,涂片,，涂片应薄而均匀；,涂片或印片,制成后应迅速,吹干、封装,。置,10,保存或立即使用,.,直接法,2.,荧光抗体染色,在标,本上滴加经稀释的荧光抗体。置,湿盒,内，在一定温度下温育一定时间，一般可用,25,37,30min,，不耐热抗原的检测则以,4,过夜为宜。用,PBS,充分洗涤，干燥。,(1),直接法：,将荧光素直接标记抗体作标本染色。,标记抗体,玻片,抗原,标记抗原抗体复合物,优点：操作简便、特异性高、非特异荧光染色因素少，,缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体,间接,法,(2),间接法：,用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。,抗原 抗原抗体复合物,未标记抗体 玻片,抗原抗体复合物 标记抗体 双抗体复合物,优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。,(3),补体结合免疫荧光法：,此法是在间接法的,第一步,抗原,抗体反应时,加入补体,，使之与抗原,抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗,C3,抗体进行示踪。,优点：,具有间接法的一些优点。,缺点：,非特异性荧光更多。,抗原,+,抗体,+,补体复合物,抗原 抗体 补体,抗原,+,抗体,+,补体复合物 抗补体标记抗体 荧光标记补体复合物,3.,荧光显微镜检查,荧光抗体染色的标本，在染色,当天,即作,镜检,，,以防荧光消退,，影响结果。,荧光显微镜检查应在,通风良好,的,暗室,内进行。,首先要选择好,光源,或,滤光片,。滤光片的其作用是提供合适的激发光。,荧光抗体技术的一种特殊应用是,流式细胞分析（,flowcytometry,）。,可用于检测细胞大小、折散率、粘滞度等，更常用于,T,细胞亚群等的检测。,免疫荧光显微技术,抗原,荧光抗体,一抗,补体,是用,酶标记的抗体,进行的抗原抗体反应。,EIA,将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，,通过酶作用于底物后显色来判定结果,。,第二节 酶免疫技术,1.,基本原理,2.,基本特点：,标记后,保留,酶和抗原,(,抗体,),的,活性,酶促反应专一性，保证,特异性,底物反应放大作用，提高,敏感性,酶标试剂保存,稳定,操作,简便,，安全,易行,3.,酶免疫技术的分类,均相酶免疫测定,酶免疫测定,异相酶免疫测定,均相酶免疫测定,Ag+Ab,-E,Ag Ab,-E,+Ab,-E,基本原理,：利用酶标抗体结合抗原形成,复合物,后，标记,酶的活性发生改变,的原理，在,不去除游离的酶标抗体,的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。,异相酶免疫测定,（,EIA,）,基本原理,：在抗原抗体反应后，先将抗原抗体复合物与,游离的酶标抗体分离,，,再测定,酶标记的复合物催化底物,显色活性,，最后推算出样品中抗原的含量。,液相,EIA,：,分离剂分离,游离的和结合的标记物。,固相,EIA,：固相载体结合酶标复合物，经,洗涤,去除游离的酶标抗体。如,ELISA,。,Ag+Ab,-E,Ag Ab,-E,+Ab,-E,（,1,）固相载体,基本要求,结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。,4.ELISA,的技术要点,最常用的是,聚苯乙烯,。聚苯乙烯具有,较强的吸附蛋白质,的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后,保留原来的免疫活性,。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。,最常用的载体为,微量反应板,（酶标板）,国际通用的标准板形是,812,的,96,孔式。为便于作少量标本的检测，有制成,8,联或,12,联孔条的，放入座架后，大小与标准,ELISA,板相同。,（,2,）抗原和抗体,基本要求：,酶标记,抗原纯度要高,，,抗原性完整,；,抗体的特异性好,，,效价高，亲和力强，,比活性高以及,易于,批量生产和,分离纯化,。,（,3,）免疫吸附剂,固相的抗原或抗体称为,免疫吸附剂,。,抗原或抗体固相化的过程称为,包被,。通常将抗原或抗体,溶于缓冲液,（最常用的为,pH,9.6,的碳酸缓冲液）中，加于,ELISA,板孔中在,4,过夜,，经,清洗,后即可应用。,用于标记酶的要求：,酶活性高,标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性,酶催化底物后信号易判定或测定,酶活性不受样品中其他成分的影响,酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉,（,4,）酶和底物,最常用的酶：,辣根过氧化酶（,HRP,）,碱性磷酸酶（,AP,）,（,5,）结合物,酶标记的抗原或抗体称为,酶结合物,。制备酶结合物的方法通常有：,1,戊二醛,交联法,2,过碘酸盐氧化法（,直接法,）,酶标记方法,A,.,交联法,以,双功能交联剂,为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法。,B.,直接法,用,过碘酸钠,活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如,HRP,）标记物制备。,ELISA,的操作流程：,A,加样,B,保温,C,洗涤：,决定实验成败,E,比色,比色,用酶标仪测定结果，准确性决定于：,ELISA,板底的,平整度,；,ELISA,板的,透明度,；,选用的,波长,是否正确：,OPD,490/492,，,TMB,450/620,或,630,；,酶标仪,的质量。,病原体及其抗体广泛应用于,传染病,的诊断。病毒如肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如链球菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和布氏杆菌等；寄生虫如弓形体、阿米巴、疟原虫等。,蛋白质,如各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（例如,AFP,、,CEA,、,PSA,）、多种血浆蛋白质、同工酶、激素（如,HCG,、,TSH,）。,非肽类激素,如,T3,、,T4,、雌激素、皮质醇等。,药物和毒品,如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。,第三节 酶免疫测定的应用,