体外分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,体外放射分析法,类型,一、竞争性分析：,放射免疫分析法（RIA），标记抗原,二、非竞争性分析：,免疫放射分析法（IRMA），标记抗体,放射免疫分析,一、基本原理：,限量标记抗原（*Ag）和可变量的待测的非标记抗原（Ag）与定量的特异性抗体（Ab）发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的含量。,*Ag,Ag,Ab,*Ag-Ab,Ag-Ab,*Ag,放射免疫分析标准曲线常用的三种作图法,放射免疫分析技术所用抗体质量的三种主要指标,亲和力测定,交叉反应测定,滴度的检测,（1）亲和力（2）交叉反应（3）滴度检测：,大分子抗原,125,I 小分子,3,H,或接一个大分子蛋白质，常用牛血清白蛋白，再125I标记,125,I标记：每个蛋白分子小于1个,125,I原子,3,H标记：每个蛋白分子可14个,3,H原子,2、标记抗原：,标记率、比活度,放化纯,T1/2不能太短：,125,I 59.7天,3,H,不改变原有抗原特性（特异性、亲和力、免疫活性等）,3、标准品或校准试剂：,4、质控样品：,标准品是定量的依据，要求纯度尽量高，配制时浓度要准确。,免疫活性与待测抗原相一致（平行试验）,高、中、低三种；,质控标本为血清，用PBS稀释，是提纯抗原；,用“0”血清稀释，“0”血清可用混合血清；,用活性炭等处理；,（2）固相分离剂：,材 料,：如塑料、纤维等，凝胶颗粒等,具备条件,：a、吸附牢固；b、不影响抗体免疫活性；c、NSB低；d、吸附材料的理化性质稳定；e、吸附材料价廉易得；,三、测定方法,1、加样：,（1）经典加样法；（2）顺序加样法：,Ab+待测Ag *Ag 测小分子抗原可提高灵敏度，但稳 定性、重复性较差,2、孵育：3、分离结合与游离部分：4、测放射性：5、数据处理：,3、精密度：,同一样品重复测定的实测剂量的离散程度 CV=SD/均数100%批内10%；批间15%ABCV：一批试验的 平均CV（为各样品CV的平均值,4、特异性：,主要指抗体的特异性,5、非特异结合率：,PEG10%双抗或固相5%,6、剂量-反应曲线和工作范围：,改变抗体滴度对标准曲线不同区段斜率（A）及精密度图（B）的影响,2、内容：,试验误差,：随机误差和系统误差,（1）标准曲线质量；（2）精密度检验；（3）整批试验的偏差；（4）漂移；（5）批间质控；,精密度、偏差和准确度三者关系示意图,Schewart图,Cusum图,其他放射免疫分析,放射受体分析法；放射竞争蛋白结合分析法；放射酶分析法；,免疫放射分析,一、基本原理：,免疫放射分析法（IRMA）是用过量的放射性核素标记的抗体（*Ab）和限量的抗原或半抗原（Ag）结合，形成Ag*Ab、其放射性和所加Ag的量呈正相关。,Ag+*Ab Ag*Ab,三、IRMA的试剂：,1、标记抗体；,通常是单克隆抗体。,2、标准品；,3、分离试剂：,固相抗体,4、质控；,四、IRMA的基本方法：,1、双抗体夹心法：,Ab1Ag*Ab2,2、标记第三抗体法：,Ab1AgAb2*抗Ab2,3、生物素标记抗体：,Ab1Ag生物素标记Ab2,125,I标记亲和素,特点,：每一抗体分子可以连接几十个分子生物素，提高灵敏度。,五、IRMA的实际应用中的特点：,1、标记物的稳定性：,标记抗体,2、反应动力学：,标记抗体过量，反应容易达到平衡,3、分析灵敏度：,高,五、IRMA的不足之处：,两株抗体，针对不同抗原决定簇，要求被测抗原至少有1216个氨基酸组成有特征性的序列（68个氨基酸 决定一个抗原决定簇）。主要测定肽类和蛋白质，半抗原不能应用。,非放射性标记免疫分析,优点：,1、有些技术能提高灵敏度和稳定性；2、反应迅速，缩短测定时间，提高工作效率；3、能执行全自动化；4、减少误差，提高质控水平；5、有效半衰期较长；6、从免疫分析的角度说，非放射性与放射性分析技术的原理是相同的，只是以酶、荧光、发光等代替,125,I，最后信号不是放射线而是其他物理形式。,1、酶联免疫吸附分析法（ELISA）,原理：,在抗体分子上连接酶分子，代替放射性标记的抗体，进行与IRMA相似的夹心免疫反应。反应结束后，分离结合、游离部分，取结合部分，利用酶的催化活性，由结合部分上的酶将特定的底物转化为特定的颜色，颜色的深浅与酶的量呈正比。,2、酶免疫荧光分析法,将酶反应的底物改为荧光物质光子激发荧光,二、发光免疫分析法：,采用化学发光物质作为标记物,化学发光免疫分析（CLIA）,酶增强发光免疫分析（ECLEA）,电化学发光免疫分析（ECLIA）,1、化学发光免疫分析法（CLIA）,原理：,发光物质标记抗原或抗体，标记的发光物质通过氢化反应获得能量，处于激发态，当其返回基态时以光子形式释放能量，其发光强度与被测物质浓度相关。,固相Ab1待测Ag化学发光物质标记Ab,氧化等反应发生化学反应光子。,发光物质：,1、异鲁米诺；2、丫啶酯类；3、苯酚类；4、咪唑类；5、苯基草酸酯类,2、酶增强发光免疫分析法（ECLEA）,原理：,将化学发光物质作为酶的发光底物，由酶触发化学发光物质激发过程，产生光子。,酶：,1、辣根过氧化酶系统；2、碱性磷酸酶系统；,以DPC公司为例：,AMPPD,中间体,减去一个磷酸基,裂解,金刚烷酮,间氧苯酯阴离子（激发态）,基态,光子,3、电化学发光免疫分析法（ECLIA）,原理：,是一种在电极表面由电化学引起的发光反应。,三联吡啶钌+三丙胺（TPA）,电场阳极面,氧化反应（失去一个电子）,TPA氧化成阳离子自由基，失去一个质子，形成一种强还原剂,三价三联吡啶钌,二价（强氧化剂）,激发态,光子,*三联吡啶钌无消耗，仅消耗TPA,三、荧光免疫分析法：,该反应系统不使用酶，而用荧光物质标记抗原或抗体进行分析。,1、荧光偏振分析技术（FPIA）；,2、时间分辨荧光免疫分析技术（TrFIA）；,铕（Eu）标记抗体+待测Ag形成复合物,酸性条件下,Eu荧光弱信号,增强液-二酮体,新的螯合物,持续且强的荧光信号,在此反应中，自然本底荧光衰变410ns，而Eu,3+,的荧光衰变为4.310,5,ns,RIA与化学发光的比较,RIA存在以下不足：,1、标记物的稳定性；,2、反应时间过长；,3、放射性计数有自身涨落；,4、人工操作存在误差；,5、不能进行全自动化操作；,6、药盒有效期短；,化学发光的优点：,1、非放射性分析；,2、灵敏度高；,3、稳定性好；,4、检测速度快；,5、全自动化；,6、半衰期长；,受体放射配基结合分析,一、基本原理：,用放射性核素标记配基与相应的受体进行特异性结合，测定复合物的放射性活度，从而对受体进行定性和定量。,R+L,RL,K1,v1,K2,v2,R为游离受体；L为游离配基的浓度,RL为复合物浓度,K1为结合速率常数，k2为解离速率常数,1、饱和曲线：,2、竞争抑制曲线：,若受体和放射性配基的结合反应系统中另加入该受体的非标记配基，则后者会与放射性配基竞争受体,一、基本条件：,1、受体标本,：,（,1）分离亚细胞组分；,（2）完整的活细胞；,（3）组织切片；,2、标记配基：,（1）高比活度；,（2）高亲和力；,（3）高特异性；,（4）高放化纯度；,3、非标记配基,：,（,1）测NSB；,（2）竞争结合反应中作为竞争剂；,4、结合反应类型：,（1）多点饱和曲线；,（2）单点法；,5、反应的环境条件：,（1）PH、Buffer；,（2）温育温度和时间；,（3）反应体积；,6、分离结合和游离部分：,临床意义：,1、内分泌系统,：,（,1）甲状腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH、TGAb、TMAb、TPOAb、Tg、TRAb；,（2）糖尿病：胰高糖素、胰岛素、C肽、生长抑素、IAb、IcAb、GAD；,（3）肾上腺：皮质醇、ACTH；,（4）生殖系统：FSH、LH、T、P、E2、PRL、HCG、-HCG；,2、垂体系统：,ACTH、TSH、LH、FSH、PRL、HGH、ADH、,3、心血管系统,：,肾素、血管紧张素、醛固酮、胆红蛋白、心肌钙蛋白、地高辛、心纳素、内皮素,4、肿瘤标志物：,AFP、CEA、Ca50、Ca199、Ca125、Ca153、Ca724、PSA、FPSA、Ca211、NSE、Scc、TPS、TSGF、,要点：,一、医师：,1、熟练掌握,：,（,1）体外放射分析（竞争性分析、非竞争性分析）；,（2）RIA基本原理和特点；,（3）放射免疫分析的质量控制；,2、掌握：,（1）放射分析的基本技术要求：,a、配体；b、特异性结合剂；c、分离技术；d、生物素和亲和素的应用；e、生物样品的制备；f、标准曲线的拟合方式；,（2）临床意义：内分泌系统,（3）放免与非放比较：包括化学发光、时间分辨荧光等；,二、技师：,1、熟练掌握,：,（,1）体外放射分析中的竞争性分析；,（2）RIA基本原理和特点；,2、掌握：,（1）放射分析的基本技术要求中的配体；,（2）临床意义：内分泌系统,