实验二-食品中大肠菌群的检验.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,实验二,食品中大肠菌群的检验,一、实验目的,1.,了解大肠菌群在食品检验中的意义。,2.,掌握检验的程序和步骤。,3.,通过,MPN,检索表的检索得出实验结果。,二、基本原理,大肠菌群系指一群在,32,37,下,24hr,内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。,食品中大肠杆菌群数是以每,100mL,（,g,）检样内大肠菌群最近似数（,MPN,）来表示，据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为,100mL,（,g,）食品内允许含有大肠菌群的实际数值，为报告标准。,一、牛天贵主编,食品微生物学实验技术,实验十二 大肠菌群检验,初发酵,分离培养,复发酵（证实试验）,实验操作步骤：,乳糖发酵试验,分离培养,证实试验,样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。,361,培养,482h,，观察是否产气。,将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，,36,1,培养,18-24h,，观察菌落形态。,挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管,36,1,培养,24,2h,，观察产气情况。,根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查,MPN,表，报告每,100ml,（,g,）大肠菌群的,MPN,值。,实验所需培养基及作用,乳糖胆盐发酵管,（初发酵）,伊红美蓝琼脂培养基,（鉴别培养基 分离培养）,乳糖发酵管,（复发酵）,1,、乳糖胆盐发酵管,成分：蛋白胨,20g,、猪胆盐,5g,、乳糖,10g,、,0.04%,溴甲酚紫水溶液,25mL,、蒸馏水,1000mL,，,pH,值,7.4,制法：略,实验现象：如图,现象及原理,大肠杆菌：,菌落深紫色，且有绿色金属光泽；,产酸能力较弱的几种肠道菌：,也有相应的棕色；,不发酵乳糖的肠道菌：,菌落是无色透明的，比如变形菌属，沙门氏菌属,2,、伊红美蓝琼脂培养基（,EMB,）,实验操作步骤：,1,）检样稀释,（,无菌操作）,将,25mL,（或,g,）检样置于含,225mL,灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用,8000,10000r/min,的速度处理,1 min,）,制成,1,：,10,的均匀稀释液。,用,1mL,灭菌吸管吸取,1,：,10,稀释液,1mL,，注入含有,9mL,灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成,1,：,100,的稀释液。,另取,1mL,灭菌吸管，按操作依次做,10,倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支,1 mL,灭菌吸管。,3,）,分离培养,将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（,36,士,1),恒温箱内培养,18,24 h,。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。,4,）,证实试验,在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落,1,一,2,个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（,36,士,1),恒温箱内培养（,24,士,2)h,，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。,取产酸产气的发酵管中培养液在伊红美兰平板上进行划线,取有核心和带金属光泽的深紫色菌落进行革兰氏染色,乳糖蛋白胨培养液,镜检（,革兰氏阴性菌,）,37,培养,48h,证实产气（阳性）结果与否,37,培养,24h,37,培养,24h,实验报告,根据证实为大肠菌群阳性的管数，查,MPN,检索表，报告每,100mL,（或,g,）大肠菌群的,MPN,。,结果表示方法：,120MPN/100mL,（,g,）,附表：,大肠菌群最大可能数（,MPN,）检索表,注：,本表采用,3,个稀释度：,1ML(g),，,0.1mL(g,）和,0.01 mL(g),。每稀释度,3,管。,表内所列检样量如改用,10mL(g),，,1mL(g,）和,0.1mL(g,）时，表内数字应相应降低,10,倍；如改用,0.1ML(g),0.01ML(g,）和,0.001mL(g,）时，则表内数字应相应增加,10,倍，其余可类推。,50ml,管阳性数,10ml,管阳性数,1ml,管阳性数,每,100ml,的,MPN,0,0,0,0,0,0,1,1,0,0,2,2,0,1,0,1,0,1,1,2,0,1,2,3,0,2,0,2,0,2,1,3,0,2,2,4,0,3,0,3,0,3,1,5,0,3,2,6,1,0,0,1,1,0,1,3,1,0,2,4,1,0,3,6,1,1,0,3,1,1,1,5,1,1,2,7,1,1,3,9,1,2,0,5,1,2,1,7,1,2,2,10,1,2,3,12,1,3,0,8,表,2-3 50,毫升检样接种,1,管、,10,毫升、,1,毫升检样各接种,3,管的大肠杆菌最近似数检索表,相 关 视 频,第一法：大肠菌群,MPN,计数法,需要用到的培养基,（,1,）,LST,肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨,成分：,胰蛋白胨或胰酪胨（,Tryticase,）,20g,，,NaCL 5.0g,，乳糖,5.0g,，,K,2,HPO,4,2.75g,，,KH,2,PO,4,2.75g,，月桂基硫酸钠,0.1g,，蒸馏水,1000mL,。,制法：,将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的,20mm150mm,试管中，每管,10mL,。,121,高压灭菌,15min,。最终,pH6.80.2,。,抑菌剂的选择,大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。,抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中,LST,肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，,BGLB,肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。,抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。,实验步骤及操作要点：,1,）无菌取样并制作梯度稀释液；,2,）样品匀液的,pH,值应在,6.5,7.5,之间，必要时分别用,1 mol/L NaOH,或,1 mol/L HCl,调节。,3,）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过,15 min,。,4,）初发酵试验,每个样品，选择,3,个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种,3,管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（,LST,）肉汤，每管接种,1mL,（如接种量超过,1 mL,，则用双料,LST,肉汤），,361,培养,24 h2 h,，观察倒管内是否有气泡产生，,24 h2 h,产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至,48 h2 h,，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。,LST,结果判断,大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。,5,）复发酵试验,用接种环从产气的,LST,肉汤管中分别取培养物,1,环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（,BGLB,）管中，,36 1,培养,48 h2 h,，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,6,）大肠菌群最可能数（,MPN,）的报告,按,5,）确证的大肠菌群,LST,阳性管数，检索,MPN,表（见附录,B,），报告每,g,（,mL,）样品中大肠菌群的,MPN,值。,表,B.1,大肠菌群最可能数（,MPN,）检索表,第二法：大肠菌群平板计数法,需要用到的培养基,（,1,）,VRBA,：结晶紫中性红胆盐琼脂,成分：蛋白胨,7.0g,，酵母膏,3.0g,，乳糖,10.0g,，氯化钠,5.0g,，胆盐或,3,号胆盐,1.5g,，中性红,0.03g,，结晶紫,0.002g,，琼脂,15g,18g,，蒸馏水,1000mL,，,pH7.4,0.1,1,）样品的稀释,：如第一法,2,）平板计数,选取,2,个,3,个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种,2,个无菌平皿，每皿,1 mL,。同时取,1 mL,生理盐水加入无菌平皿作空白对照。,3,）及时将,15 mL,20 mL,冷至,46,的结晶紫中性红胆盐琼脂（,VRBA,）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加,3 mL,4 mLVRBA,覆盖平板表层。翻转平板，置于,36 1,培养,18 h,24 h,。,实验步骤及操作要点：,4,）平板菌落数的选择,选取菌落数在,15 CFU,150 CFU,之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。,典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为,0.5 mm,或更大。,5,）证实试验,从,VRBA,平板上挑取,10,个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于,BGLB,肉汤管内，,36 1,培养,24 h,48 h,，观察产气情况。凡,BGLB,肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。,6,）大肠菌群平板计数的报告,经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以,4,）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每,g,（,mL,）样品中大肠菌群数。,例：,10,-4,样品稀释液,1 mL,，在,VRBA,平板上有,100,个典型和可疑菌落，挑取其中,10,个接种,BGLB,肉汤管，证实有,6,个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：,1006/1010,4,/g,（,mL,）,=6.010,5,CFU/g,（,mL,）。,三 大肠菌群,Petrifilm,TM,测试纸片法,四、美国,FDA,标准方法,行业标准采用两步法：,用于对出口食品中大肠菌群进行检验,推测试验,证实试验,样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管,LST,肉汤发酵管。,361,培养,482h,，观察是否产气。,将产气发酵管培养物转种于煌绿乳糖胆盐（,BGLB,）肉汤中，,36,1,培养,482h,，,观察是否产气,。,以,BGLB,产气为阳性，查,MPN,表，报告每,ml,（,g,）样品中大肠菌群的,MPN,值。,思考题,1,三步法大肠菌群的检验分哪几个步骤？各有何作用？,2,在糖发酵试验中，若发现发酵倒管内存在极微小的气泡，这种情况可否算作产气阳性？,3,造成本实验误差的主要原因有哪些？,