分子生物学第五、六章-DNA的损伤、修复、基因突变、重组与转座.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,5,章,DNA,损伤、修复、基因突变,5.1 DNA,的损伤,由于染色体,DNA,在生命过程中占有至高无上的地位，,DNA,复制的准确性,以及,DNA,日常保养中的,损伤修复,有着特别重要的意义。,DNA,损伤是指在生物体生命过程中,DNA,双螺旋结构发生的任何改变。,主要分为两种：,单个碱基改变,双螺旋结构的异常扭曲（链内,T,二聚体、单链缺口、凸起等）,DNA,复制过程中的损伤指碱基配对时产生的误差经过,DNA,聚合酶等综合校对因素作用后仍未被校正的,DNA,的损伤。,如：大肠杆菌,DNA,复制无,DNA,聚合酶校正时错配率为,10,-1,10,-2,，识别校正后为,10,-5,10,-6,，再经过其他因素，错配率达到,10,-10,这类损伤主要包括,5,种因素,5.1.1 DNA,分子自发性损伤,指碱基发生烯醇式,-,酮式结构互变时，氢原子位置的可逆变化，使碱基配对发生改变，这样在复制后的子链上就可能出现错误。,如：,A,、,C,或,G,、,T,错配,互变异构移位,主要指胞嘧啶,C,、,A,和,G,分子结构中都含有环外氨基，氨基有时会自动脱落，使得,C,变为,U,，,A,变为,I,，,G,变为,X,，当,DNA,复制时，会在链中产生错误导致损伤。,AIC(,非,T),下一轮,CG,导致,ATGC,引起突变,CU A(,非,G),下一轮,AT,导致,GCAT,引起突变,亚硝酸盐、羟胺诱变剂,脱氨试剂,DNA,复制时，无论模板还是新生链都会发生碱基的环出现象，即,DNA,聚合酶发生“打滑,”,，引起一个或数个碱基的插入或缺失。尤其是模板上有几个相同的碱基情况。,DNA,聚合酶的“打滑,”,DNA,分子在生理条件下可通过自发性水解，使嘌呤碱和嘧啶碱从磷酸脱氧核糖骨架上脱落下来。哺乳动物每个细胞每,20 h,脱去的嘌呤碱和嘧啶碱数分别平均为,1000,个和,500,个。,碱基丢失,电离辐射引起,DNA,损伤,直接引起,DNA,理化性质改变,细胞水分解离，产生氧自由基诱变碱基改变,最终能引起,DNA,链断裂及,DNA,链间交联，,DNA-,蛋白交联等。,碱基类似物对,DNA,的损伤,是一类结构与碱基相似的人工化合物，,5-,溴尿嘧啶（,5-BU,）与,U,结构类似，酮式能与,A,配对，烯醇式能与,G,配对。结果引起,A-T-G-C,转变。,DNA,修复是生物体细胞在长期进化中形成的一种保护功能，在遗传信息传递的稳定性方面具有重要作用。,5.2 DNA,的修复,直接修复,切除修复,错配修复,重组修复,易错修复和,SOS,应急反应,细胞,DNA,损伤的修复系统主要有：,直接修复,包括光复活修复、,0,6,-,甲基鸟嘌呤,-DNA,甲基转移酶修复、单链断裂修复,在,DNA,光解酶,(Photolyase),的作用下把在光下或经紫外光照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及,6-4,光化物,(6-4photoproduct),还原成为单体的过程。,生物体内还广泛存在着使,0,6,-,甲基鸟嘌呤脱甲基化的甲基转移酶，以防止形成,G-T,配对。,DNA,单链断裂可以通过重接（,DNA,连接酶），直接修复。,切除修复,包括碱基切除修复和核苷酸片段切除修复,碱基切除修复：,所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上的,N-,糖苷键，在,DNA,链上形成去嘌呤或去嘧啶位点（,AP,位点）。,DNA,分子中一旦产生了,AP,位点，,AP,核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷,-,磷酸键切开，并移去包括,AP,位点核苷酸在内的小片段,DNA,，由,DNA,聚合酶,I,合成新的片段，最终由,DNA,连接酶把两者连成新的被修复的,DNA,链。,损伤发生后，首先由,DNA,切割酶,(exci-nuclease),在已损伤的核苷酸,5,和,3,位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由,12,13,个核苷酸,(,原核生物,),或,27,29,个核苷酸,(,人类或其他高等真核生物,),的小片段，移去小片段后由,DNA,聚合酶,(,原核,),或,(,真核,),合成新的片段，并由,DNA,连接酶完成修复中的最后一道工序。,此后，只要两条,DNA,链上碱基配对出现错误，错配修复系统就会根据,“,保存母链，修正子链,”,的原则，找出错误碱基所在的,DNA,链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游,G,的,5,位置切开子链。,复制,重组,再合成,重组修复机制的缺陷，有可能导致肿瘤发生。已经发现，妇女,Brca 1,和,Brca 2,两个基因如果有缺陷，发生乳腺癌的概率为,80%,。这两个蛋白质参与重组修复。,错配修复、直接修复、切除修复和重组修复都能够识别,DNA,的损伤部位或错配碱基而加以消除，在这些修复过程中不引入错误碱基，属于,避免差错的修复。,易错修复和,SOS,应急反应,当无法为修复提供正确模板时，如模板链损伤、双链断裂、双链交联等，正常复制受阻，导致易错修复。,许多能造成,DNA,损伤或抑制,DNA,复制的过程能引起一系列复杂的诱导效应，这种效应称为应急反应,(SOS response),。,SOS,包括诱导,DNA,损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶源性细菌释放噬菌体等，细胞癌变也与,SOS,反应有关。,SOS,反应是细胞,DNA,受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。,SOS,反应诱导的修复系统包括：避免差错的修复（,error free repair,）和易产生差错的修复（,error prone repair,）两类。,由于,SOS,反应还能诱导产生缺乏校对功能的,DNA,聚合酶，所以在,DNA,链的损伤部位即使出现不配对碱基，复制也能继续进行，以保证细胞的存活，叫易产差错的修复。,SOS,反应广泛存在于原核和真核生物，它是生物体在不利环境中求得生存的一种基本功能。,SOS,反应意义：,DNA,的修复；导致变异。,作为遗传物质的,DNA,有三个主要功能：,通过复制将遗传物质由亲代传给子代；,通过转录使遗传信息在子代得以表达；,通过变异在自然过程中获得新的遗传信息。,5.3,基因突变,基因突变,(mutation),：是在基因发生可遗传的结构和数量的变化，通常产生一定的表型。,广义的突变包括染色体畸变和基因突变。遗传重组也导致可遗传的变异，因此，染色体畸变、基因突变、遗传重组是可遗传变异的基础。,1,、碱基对置换：指,DNA,错配对碱基在复制后被固定下来，由原来的一个碱基对被另一个碱基对所取代，又称为点突变。碱基对置换有转换和颠换两种。,2,、插入突变：指在基因的序列中插入了一个碱基或一段外来,DNA,导致的突变。包括同义突变、错义突变和无义突变。,基因突变的类型,3.,移码突变：一个或多个非三整倍数的核苷酸对插入或缺失，导致编码区位点后的三联体密码子可读框改变，从而使后面的氨基酸都发生错误，是基因产物失活。,4.,渗漏突变：突变基因的产物尚有部分活性的错义突变。,5.,回复突变：从突变体回复原先野生型表型的突变过程。,在自然条件下发生的突变称为自发突变。自发突变的频率很低，大肠杆菌及果蝇突变率,10,-10,左右。,能够提高突变率的物理或化学因子称为诱变剂,(mutagen),。,碱基类似物：,5-BU,与,T,结构相似；碱基修饰剂：亚硝酸；烷化剂；嵌合染料,(EB),；紫外线和电离辐射,诱变剂种类及机制,4.4.3,基因突变的主要后果,生物功能丧失,获得新功能,癌症发生,作业,名词解释：,基因突变,无义突变,移码突变,回复突变,简答题,：,课后思考题,1,和,4,4.5 DNA,的重组,DNA,分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组或基因重组。重组产物称为重组体,DNA(recombinant DNA),。,真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。,细菌及噬菌体的基因组为单倍体，来自不同亲代两组,DNA,之间可通过多种形式进行遗传重组,。,遗传变异的根本原因是突变。然而突变的机率很低，且多数是有害的。如果生物只有突变没有重组，在积累具有选择优势突变的同时不可避免地积累许多难以摆脱的不利突变。有利突变随不利突变一起被淘汰，新的优良基因就不可能出现。,DNA,重组对生物进化起着关键性的作用。,4.5.1,同源重组,同源重组,(homologous recombination),：由两条同源区的,DNA,分子，通过配对、链断裂和再连接，而产生的片段间交换的过程。,Holliday,模型,详见书本图和遗传学教材,4.5.2,细菌的基因转移与重组,细菌的基因转移主要有四种机制：接合,(conjugation),、转化,(transformation),、转导,(transduction),和细胞融合（,cell fusion,）。,细菌的接合,细菌的细胞相互接触时遗传信息可由一个细胞转移到另一细胞，称为,接合作用。,供体细胞为雄性，受体为雌性。通过接合而转移,DNA,的能力由接合质粒提供，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子,(fertility factor,，,F,因子,),。,大肠杆菌,F,因子是双链闭环的大质粒，总长约,100kb,，复制起点为,ori,V,。,F,因子可以在细胞内游离存在,(F,+,),，也可以整合到宿主染色体内,(Hfr),。整合,F,因子的大肠杆菌菌株具有较高频率的重组,(high-frequency recombination),，称为,Hfr,菌株。,F,因子可以整合在染色体不同位置，由此而得到不同的,Hfr,菌株。,细菌的遗传转化,遗传转化,(genetic transformation),是指细菌品系由于吸收了外源,DNA,而发生遗传性状的改变现象。,感受态细胞（,competent cell,）：,受体细胞经过一些特殊方法（如电击、,CaCl,2,）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源,DNA,分子进入的状态。,细菌的转导,转导,(transduction),：是通过噬菌体将基因从供体转移到受体细胞的过程。,细菌的细胞融合,由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使其成为原生质体，可人工促进原生质体融合，由此使两菌株的,DNA,发生广泛的重组。,第七章,DNA,重组与转座,4.6 DNA,的转座,转座子（,transposon,）：,是在基因组中可以移动的一段,DNA,序列。一个转座子由基因组的一个位置转移到另一个位置的过程称为转座或移位,(transposition),。本质是由转座子（可移位因子）介导的遗传物质重排现象。,转座子,是一些较短的,DNA,序列，可以转移到细胞基因组的任何位置。由于它不需要序列间具有同源性，也不是位点特异性的，所以,转座作用又被称为异常重组。,与,DNA,的同源重组相比，转座作用发生的频率要低得多。,转座作用能说明在细菌中发现的许多基因缺失或倒位现象，而且它常被用于构建新的突变体。,T-DNA,标签技术。,转座作用的特点,能从基因组的一个位点转移到另一个位点 （又称跳跃基因）；,不以独立形式存在；,转座子编码自身的转座酶；,转座的频率很低；,转座作用可引起基因表达内容的改变甚至失,活。,转座可分为,复制性和非复制性,两大类。,在复制性转座中，整个转座子被复制，所移动和转位的是原转座子的,拷贝,。,转座酶,和,解离酶,分别作用于,原始转座子,和,复制转座子,。,在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。,4.6.1,转座子的分类和结构特征,转座子,(transposon,，,Tn),：是存在于染色体,DNA,上可自主位移（非复制性）和复制（复制性）的基本单位。,1,、,IS,序列,最简单的转座子只含有与转座有关的酶基因，不含有任何宿主基因（包括抗药性基因），常被称为,插入序列,(insertional equence,，,IS),。,IS,序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。,转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。科学上用标准命名法对这些突变进行编号，如,:IS1,表示有一个,IS1,的序列插入到噬菌体,基因组内。,表,2-13 IS,序列的结构特征比较,长度,/bp,两端倒置重复区,/bp,靶位点正向重复区,/bp,靶位点,IS,1,IS,2,IS,4,IS,5,IS,10R,IS,50R,IS,903,768,1327,1428,1195,1329,1531,1057,23,41,18,16,22,9,18,9,5,11,或,12,4,9,9,9,随机,有热点,AAAN20TTT,有热点,NGCTNAGCN,有热点,未知,它们都是很小的,DNA,片段,(,约,lkb),，末端具有倒置重复序列，转座时往往复制宿主靶位点一小段,(4,15bp)DNA,，形成位于,IS,序列两端的正向重复区。,2,、复合型转座子,复合型转座子,(composite transposon),：,是一类除了转座酶基因之外，还带有抗药性基因,(,或其他宿主基因,),的转座子。因结构大而复杂，故称为复合转座子。,其两翼往往是两个相同或高度同源的,IS,序列，表明,IS,序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子,(,图,2-32),。,型：,图,2-32,一旦形成复合转座子，,IS,序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只有作为复合体移动。,型,主要指,TnA,家族,:,没有,IS,序列、体积庞大,(5000bp,以上,),、带有,3,个基因，其中一个编码,-,内酰胺酶,(Amp,R,),，另两个则是转座作用所必须的。,这类转座子两翼带有,38bp,的倒置重复序列。,复合型转座子的特点,末端反向重复序列，为转座酶所必须；,中间的开放阅读框架（,ORF,）作为标记基因；,转位后靶位点成为正向重复序列。,4.6.2,转座作用的机制,转座时发生的插入作用的普遍特征是受体分子中有一段很短的,(3,l2bp),、被称为靶序列的,DNA,会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。,对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度是一样的，如,IS1,两翼总有,9,个碱基对的靶序列，而,Tn3,两端总有,5bp,的靶序列。,靶序列的复制起源于特定内切酶所造成的粘性,DNA,末端。,4.6.3,转座作用的遗传学效应,(1),转座引起插入突变 各种,IS,、,Tn,都可以引起插入突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活；,(2),转座产生新的基因 如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶,DNA,序列上的插入突变，同时也使这个位点产生抗药性；,(3),影响插入位置邻近基因的表达，使宿主表 型改变,;,(4),转座产生的染色体畸变,;,若同源重组发生在两个正向重复转座区之间，就导致宿主染色体,DNA,缺失；,若重组发生在两个反向重复转座区之间，则引起染色体,DNA,倒位。,（,5,）转座引起的生物进化,由于转座作用，使一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。,4.7,真核生物中的转座子,早在,20,世纪初，遗传学家就已发现玉米中存在决定体细胞变异的控制因子（,controlling element,），事实上就是转座子。,20,世纪,40,年代，,Barbara McClintock,在美国康奈尔大学和冷泉港实验室所进行的开创性工作，打破了孟德尔关于基因固定排列于染色体上的概念，在当时几乎不能被科学界所接受，直到,1983,年终于在分子水平上得到证实，并使她获得了诺贝尔生理医学奖。,玉米细胞内的控制因子可归纳为两大类：,一类是自主性因子，具有自主剪接和转座的功能；,另一类是非自主性因子，单独存在时是稳定的，但不能转座。,当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能，成为与自主性因子相同的转座子。,同一家族的自主性因子能为非自主性因子的转座提供反式作用蛋白（,转座酶,），而不同家族间无此反应。,研究发现，玉米转座子同样具有典型的,IS,特征,在转座子的两翼有两个倒转重复序列，在靶,DNA,插入位点有两个短的正向重复序列。,在著名的,Ac-Ds,体系中，自主转座子,Ac,长,4563bp,，转录生成单一,RNA,。成熟,mRNA,长,3500bp,，并含有一个长,807,个密码子的开放读码框，被,4,个内含子分隔成,5,个外显子。,Ac,转座子的两翼有,11bp,的倒转重复序列，在其靶,DNA,位点复制形成,8bp,正向重复。,已知所有,Ds,都是,Ac,转座子的缺失突变体，如,Ds9,只缺失了,194 bp,，而,Ds6,缺了约,2.5kb,。,非自主性转座子虽然缺失内源序列，但其两端转座特征序列却是完整的，只要细胞内有相应的转座酶活性，它就能恢复转座性能。,Spm,和,dSpm,也是玉米转座因子系统之一。其,Spm,是自主性因子，又称增强子，长,8287bp,，两端各有一个,13bp,的倒置重复序列，在其靶,DNA,位点复制形成,8bp,正向重复，含有,3,个内含子，,2,个阅读框。,dSpm,是非自主性因子（又称抑制因子），由,Spm,缺失而形成，长度不等，两端各有一个,13bp,的倒置重复序列，在其靶,DNA,位点复制形成,8bp,正向重复。,转座子存在于所有体内，人类基因组中约有,35%,以上的序列为转座子序列，其中绝大部分与疾病有关。,4.8,逆转录转座子,逆转录转座子,(retrotransposon,或,retroposon),指通过,RNA,为中介，逆转录成,DNA,后进行转座的可移动元件。,从,DNA RNA DNA,的转移过程称为逆转座作用,(retrotransposition),。以区别从,DNA DNA,的转移过程的转座作用。,经,RNA,中间体介导的转座是真核生物普遍存在的现象。,逆转录病毒能够将,RNA,病毒基因组中的,DNA,拷贝（原病毒）整合到宿主细胞染色体中。,逆转录转座子可以分成两类：,一类是,病毒超家族,(viral superfamily),，这类反转录转座子能够编码反转录酶或整合酶，能自主地进行转,座,；,另一类是非病毒超家族,(nonviral superfamily),，自身没有转座酶或整合酶的编码能力，而在细胞内已有的酶系统作用下进行转座。,两者区别：,病毒超家族成员的,DNA,分子两端有长末端重复序列,(long terminal repeats,，,LTR),。能编码产生转座酶或整合酶，或者二者兼而有之，能自主地进行转座。,非病毒超家族的成员没有,LTR,结构。非病毒超家族成员不产生有生物学活性的酶，不能进行自主转座。,逆转录转座子的生物学意义,对基因基因表达的影响,逆转录转座子介导基因的重排,逆转录转座子在生物进化中的作用,