大学生基本培养基的制备与高压灭菌.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物基础实验项目,1,、培养基制备与灭菌；,2,、微生物的分离培养与菌落观察；,3,、水的细菌学检验；,4,、细菌的染色观察：革兰氏染色、芽孢与荚膜染色；,5,、放线菌、霉菌的形态观察；,7,、微生物直接计数与大小测定；,8,、微生物生理生化反应,微生物基础实验注意事项,1,、提高安全意识，正确操作仪器；,2,、培养无菌操作的观念；,3,、自觉清洗器皿；,4,、注重保持环境卫生和实验室秩序；,培养基的制备与灭菌,一、目的：,1,、学习一般培养基的制备方法；,2,、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用的灭菌方法。,天然培养基：,主要成分是天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，其成分未完全了解，且各批次不均一。适用于生产上大规模培养微生物。,合成培养基：,成分明确的化学药品配制而成的培养基。如：高氏一号培养基、查氏培养基等。一般适用于在实验室范围内研究微生物的形态、营养代谢、分类鉴定、生物测定、菌种选育和遗传分析等工作。,半合成培养基：,在天然有机物的基础上，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基。具有广泛的应用，如马铃薯葡萄糖培养基，适合很多霉菌的生长。,液体培养基：,配好后成为液体状态的培养基。如糖发酵液体培养基、蛋白胨水培养基等。广泛用于理论研究和大规模的工业发酵。,固体培养基：,在液体培养基中加入凝固剂形成的固态培养基。常用凝固剂有琼脂、明胶、硅胶。硅胶用于配制自养微生物的固体培养基；对于其他多数微生物来讲，琼脂最为合适，一般加入,1.5-2.5%,，如牛肉膏蛋白胨培养基等。此培养基可供微生物的分离、鉴定、菌种保藏等。,半固体培养基：,在液体培养基中加入少量凝固剂即配成为半固体培养基，如，加入,0.2-0.7%,琼脂作为凝固剂。用来观察细菌运动特征、鉴定菌种、菌种保藏和噬菌体的效价滴定等。,根据培养基的特殊用途分类,：,基础培养基：,含有一般细菌生长繁殖所需的基本营养物质，常用的基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，也是作为某些特殊培养基的基础成分。,加富培养基：,是在基础培养基中加入血、血清、动物组织提取液或植物组织提取液，主要用于培养某些对营养要求较为苛刻的微生物。,选择培养基：,根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性而设计的培养基。,根据某些微生物对碳、氮源的特殊要求来设计选择性培养基，可以分离到能分解某些物质的微生物。,在培养基中加入某些化学物质，以抑制不需要的微生物的生长繁殖。如在分离放线菌时，在培养基中添加,10%,的酚数滴可抑制细菌和霉菌的生长。,鉴别培养基：,在基础培养基中加入某种化合物或化学试剂，使培养的微生物产生某种代谢产物与该化合物或化学试剂发生明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将此种微生物与其他种微生物区别开来，如伊红美蓝培养基。,干热法灭菌：,a),火焰烧灼：,适用于接种环、接种针、镊子等金属用具，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上短暂烧灼灭菌。,b),热空气灭菌：,使用电热干燥箱，借助热空气在,160-170,0,C,下保温,2,小时进行灭菌，此法适用于玻璃器皿（如吸管和培养皿）等的灭菌，对带胶皮的器物或培养基不适用。,三、材料：,1,、药品,：,NaCl,蛋白胨 牛肉膏 可溶性淀粉,K,2,HPO,4,HCl NaOH,琼脂 葡萄糖 蔗糖,Na,2,SO,4,黄豆芽 马铃薯 伊红 美蓝等。,2,、器材：,台秤 三角瓶 试管 漏斗 电炉 搪瓷杯（铝锅）试管架 玻棒 滴管 称量纸,pH,试纸 棉花 纱布 牛皮纸 棉线 灭菌锅 干燥箱等。,矫正,pH,值：,初配制好的培养基，往往不能符合所需求的,pH,值，故必须矫正，用精密,pH,试纸，以,1N HCl,或,1N NaOH,调节至所需要的,pH,值。,过滤：,用滤纸、棉花或双层纱布过滤。,分装：,将制成的培养基分装于三角瓶或试管内。,马铃薯糖琼脂培养基,(PDA),成分：,马铃薯,200g,蔗糖,20g,琼脂,25g,水 补足,1000ml,方法：,将马铃薯洗净去皮切块，放入搪瓷杯中，掺适量水加热煮沸,30,分钟（注意不时用玻棒搅拌，避免糊底），用双层纱布滤去薯块，在薯汁中加入琼脂，加热熔化，再加入葡萄糖，完全溶化后，用水补足体积，趁热分装到三角瓶中，,121,灭菌,20 min,。,注：无须调,pH,值，保持自然的酸性。,伊红美蓝琼脂培养基,(EMB),成分,1,：,蛋白胨,10 g,NaCl 5 g,乳糖,4 g,琼脂,25 g,蒸馏水,1000 ml,pH 7.6,成分,2,：,2%,伊红水溶液,2 ml,，,0.5%,美蓝水溶液,1 ml,方法：,先配成分,1,，调好,pH,值后才可加入成分,2,，混匀，趁热分装到三角瓶中，,115,灭菌,20 min,。,3,倍浓缩乳糖蛋白胨液体培养基,成分,1,：,蛋白胨,30 g,牛肉膏,9 g,乳糖,15 g,NaCl,15 g,蒸馏水,补足,1000 ml,pH 7.2,成分,2,：,1.6%,溴钾酚紫乙醇溶液,3 ml,方法：,先配成分,1,，调好,pH,值后才可加入成分,2,，混匀，分装到三角瓶及大试管中，并加入倒置的事先充满该培养液的杜氏管（勿留气泡），封口后,115,灭菌,20 min,。,2,、灭菌：,干热灭菌步骤,：,将要灭菌的器皿（培养皿、吸管等）包扎好，放入恒温干燥箱内。,接通电源，打开开关；旋动恒温调节器至,140,0,C,，当达到此温度时，借助恒温调节器的自动控制，保持恒温两小时。,两小时后，关掉电源，当温度降至,60,0,C,以下后，才可打开箱门，取出灭菌物品。,手提式蒸汽灭菌锅,立式蒸汽灭菌锅,（电加热、自动或半自动）,卧式蒸汽灭菌锅,高压蒸汽灭菌锅的使用：,锅内加入适量的水，使水面与三脚搁架相平为宜。,把要灭菌的材料装入锅内，注意不要放得太挤，防碍蒸汽流通，影响灭菌效果。,盖好灭菌锅锅盖，按对角线形式均匀拧紧锅盖上的螺栓，螺栓松紧一致，以免漏气。,打开电源，开启排汽阀，以排除锅内的冷空气。,待冷空气完全排尽后，关闭排汽开关。让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时。控制热源，维持压力至所需时间。本实验根据培养基不同，分别采用：,1.05kg/cm,2,（,15,磅,/,英寸,2,），,121.3,0,C,保持,20,分钟；,0.7kg/cm,2,（,10,磅,/,英寸,2,），,115.6,0,C,保持,20,分钟。,五、培养基的配制及器材准备：,1,：,配牛肉膏蛋白胨固体培养基,2000 ml,，分装于,16,个,250 ml,三角瓶；,2,：,配牛肉膏蛋白胨固体培养基,500 ml,，分装于,100,支试管；,3,：,高氏,1,号固体培养基,1000 ml,，分装于,8,个,250 ml,三角瓶；,4,：,淀粉固体培养基,1000 ml,，分装于,8,个,250 ml,三角瓶；,5,：,马铃薯固体培养基,2000 ml,，分装于,16,个,250 ml,三角瓶；,6,：,豆芽汁培养基,1000 ml,分装于,8,个,250 ml,三角瓶,+20,支试管；,7,：,无氮培养基,500 ml,分装于,4,个,250 ml,三角瓶,8,：,伊红美蓝固体培养基,1000 ml,，分装于,8,个,250 ml,三角瓶；,五、培养基的配制及器材准备：,9,：,葡萄糖蛋白胨水培养基,700 ml,分装于,90,支试管（,7 ml,）；,10,：,蛋白胨水培养基,400 ml,，分装于,50,支试管（,7 ml,）；,11,：,3,倍,乳糖蛋白胨液体培养基,100 ml,，,20,只大试管（,5 ml,），均加入倒置小管；,12,：,乳糖发酵液体培养基,700 ml,，分装于,90,支试管（,7 ml,），加倒置小管；,13,：,葡萄糖发酵液体培养基,400 ml,，分装于,50,支试管（,7 ml,），加倒置小管；,思考,为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？请设计干热灭菌与湿热灭菌效果比较实验方案。,高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降低到,“,0,”,时才能打开排气阀，开盖取物？,细菌营养体和细菌芽孢对紫外线的抵抗力一样吗？为什么？,