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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物制品制造新技术,第一节 基因工程疫苗,基因工程疫苗主要是指用重组,DNA,技术研制的疫苗，包括将保护性抗原基因在原核或真核载体细胞中的重组亚单位疫苗，以及以某些病毒或细菌为外源基因载体的活载体疫苗和通过基因组突变、缺失或插入的基因缺失疫苗，以及重组,DNA,疫苗等。,疫 苗 分 类,活疫苗,经典策略-病毒,重组病毒,重组病毒载体,经典策略-细菌,重组细菌,重组细菌载体,死疫苗,完整病原体疫苗,蛋白基础疫苗,肽基础疫苗,多糖基础疫苗,抗独特型疫苗,DNA疫苗,“,Naked”DNA,Viral delivery,Bacterial delivery,根据疫苗抗原的性质和制备工艺,经典策略,活疫苗,在,细胞上培养减毒,分离异源变异病毒株,Resorted Genomes,筛选温度敏感突变株,死 疫 苗,1.,完整病原体疫苗 （细菌、病毒）,2.蛋白基础疫苗(Protein-based Vaccine),天然蛋白,化学灭活蛋白,基因灭活,(,重组突变,),重组多肽,(,HBsAg,VLPs,of,papillomavirus,),Carrier (,酵母,Ty,颗粒,),3.,多糖基础疫苗,4.,抗独特型抗体,活疫苗,可在宿主细胞中复制,毒力降低,免疫反应比较全面,免疫剂量小,免疫保护期长,死疫苗,不能在宿主细胞,中复制,无毒，不返强,免疫反应不太全面,不会传染给其它,个体,制备技术相对容易,DNA疫苗,可刺接抗原在细,胞内合成,可诱导细胞免疫,制备技术容易标,准化,不同疫苗特性比较,遗传信息的传递和表达,中心法则,基本概念,1.基因工程载体,目的外源基因分离后是无法自主进入到宿主细胞并进行复制表达的,必须有一运载工具将其运达宿主细胞才能复制、扩增、传代和表达.,这种将外源目的基因带入宿主细胞并与其一起复制、表达的基因运载工具就叫做基因载体或基因工程载体.本质上所有基因载体都是DNA.,外源基因都是插入到载体DNA的序列中，然后随载体进入宿主细胞，并随载体的复制而复制或表达.,2.,质粒,质粒,是细菌质粒(Plasmid)是指细菌细胞质中独立于,染色体外,的、能够,自主复制,的遗传单位，是,环状双链DAN,小分子,它能够随着细胞的增殖而,稳定地遗传,给子代细胞。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞所编码的蛋白质和酶，是胞质复制子。质粒不是细菌生长、繁殖所必须的结构。质粒对宿主细胞没有干扰，此不同于病毒和噬菌体.质粒的复制与染色体是同步的，而且其拷贝数是恒定的，分配给每个子细胞的质粒拷贝数也是相同的.,重组亚单位疫苗,概念,：将病原的,主要保护性抗原蛋白基因,在体外进行大量表达，纯化其表达产物辅以,佐剂,制成疫苗-亚单位疫苗。,特点,：利用体外表达系统（如大肠杆菌，杆状病毒，酵母等）大量表达病毒的主要保护性抗原蛋白作为亚单位疫苗不仅具有,良好的安全性和,稳定性,，而且便于规模化生产。利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分,亚单位疫苗免疫的动物和自然感染的动物,。,适用于,发病快，病程急，中和抗体能有效控制发病的传染病。如：猪瘟，高致病力禽流感，新城疫，传染性法氏囊病等。,不适于病程发展缓慢，潜伏期长，感染巨噬细胞且有ADE效应的疾病。,如：人类爱滋病，动物慢病毒病（马传贫，山羊关节炎脑炎等），动脉炎科病毒（猪繁殖与呼吸综合征等）。,重组亚单位疫苗,构建流程,保护性抗原的基因,原核或真核表达载体,原核或真核细胞,保护性抗原肽链,重组亚单位疫苗,佐剂,用含,EcoRI,和,NotI,酶切位点的引物扩增,PoIFN-,基因，并将其克隆入,pGEM-T Easy,载体,中,EcoRI,NotI,EcoRI,NotI,EcoRI,和,NotI,双酶切,EcoRI,和,NotI,双酶切,亚克隆,T,4,连接酶连接,图 原核表达载体pGEXIFN-重组路线图,重组质粒pGEM-T-IFN-,Z,EcoRI,和,PstI,双酶,EcoRI,和,PstI,双酶,T,4,连接酶连接,亚克隆,PstI,EcoRI,EcoRI,PstI,图 原核表达载体pETIFN-重组路线图,重组活疫苗,（recombinant live vaccine）,通过基因工程技术，将病原微生物致病性基因进行修饰、突变或缺失，从而获得弱毒株，研制成疫苗。,重组病毒构建原理,1.同源重组法,2.从cDNA克隆拯救感染性病毒,野病毒基因,弱毒病毒基因,非毒力基因鉴定,克隆该关键基因至质粒,将该关键基因与野毒株基因结合,稳定低毒力基因,重组病毒构建原理（I),基因缺失疫苗,概念,：将病原体的某个或某些基因（复制非必需的，或与毒力相关的）全部或部分删除，使其毒力下降，但仍然保留一定的复制能力。,特点,：缺失与毒力相关基因及病毒复制非必需的基因是发展活疫苗的理想途径之一。由于毒力相关基因的缺失导致病毒致病力的减弱，但仍然保持其良好的免疫原性。这种基因缺失的病毒作为疫苗的突出优点是不易返祖而重新获得毒力。缺失的基因可作为一种遗传标志用于建立鉴别诊断方法。,实例,：伪狂犬病毒基因缺失标记疫苗，牛传染性鼻气管炎病毒基因缺失标记疫苗，Nef基因缺失的猴免疫缺陷病毒，Vif基因缺失的猫免疫缺陷病毒，P39基因缺失的布氏杆菌疫苗，R3/G4基因缺失的牛白血病病毒，,纯化PRV,提取PRV基因组,技术路线,经sph1、kpn1酶切,含gG、gD、gE基因,PUC18载体,质粒PUSK,质粒PAcGFP-C1,重组质粒PUSG,PRV基因组,重组基因缺失病毒,常被缺失基因：胸腺激酶基因,(TK),痘苗病毒,TK,基因缺失,单纯疱疹病毒,(HSV),的,22,毒力,基因缺失、,TK,基因缺失,牛疱疹病毒,型,(BHV-1)TK,基因缺失疫苗,缺点是疫苗病毒具有潜伏性,伪狂犬病病毒,TK,基因缺失苗,1986,年获美国农业部批准投放市场,缺失非必需基因,目前投入使用的PRV缺失疫苗,从cDNA克隆拯救感染性病毒,病毒全长感染性,cDNA,克隆技术,反向遗传操作技术,(,Reverse Genetics),“,病毒拯救,(,rescue of virus),重组病毒构建原理（II),“分段克隆”策略：将病毒基因组各片段顺次克隆。,低拷贝载体：复制严谨性较高,沉默突变：在构建,cDNA,克隆时，一般均在一处或几处,合适的位置上进行沉默突变，便于鉴定拯救,出的病毒。,基因组,3,末端和,5,末端的克隆,采用,cDNA,末端快速扩增法,(,RACE),基因组全长片段的克隆,Menlenbarg等（2000，2003）,NSP,GP2 GP3 GP4 GP5 M N,FMDV,蛋白酶2A基因,人A型流感病毒,HA基因抗原表位,感染性cDNA克隆举例,mRNA BHK21细胞 病毒子,接点,插入,位点,PRRSV,Infectious PRRSV,Progeny,感染性子代病毒,PRRSV Infectious Clone(Reverse Genetics),PRRSV Genomic RNA,Genome-length cDNA,Infectious RNA transcript,RT/PCR,PRRSV,Virions,病毒粒,CELL,基因组RNA,全长cDNA,感染性RNA拷贝,pFL12,19,195bp,F,10,PRRSV cDNA,AclI,BsrGI,3,5,1a,1b,2,3,4,5,6,7,A,n,A,B,D,Bsu36I,XbaI,BsrGl,BsrGI,5C,3C,F,10,A,n,Infectious cDNA Clone of a Highly,Pathogenic Strain of PRRSV:In Vivo Studies,高致病性PRRSV 感染性cDNA克隆：体内研究,Ha M.Truong,Judith Galeota,Fernando A.Osorio,Asit K.Pattnaik,Genetic Chimeras between Two Strains of PRRSV,DONOR,RECIPIENT,pFL12(19,231bp),ORF1a 2 4 6,ORF1b 3 5 7,pFL12 virulent infectious clone,5,A,n,3,ORF1b 3 5 7,ORF1a 2 4 6,Attenuated vaccine strain,(,Prime Pac,Hesse et al.,AASP 1996:103),5UTR.NSP1.2,NSP2.3,NSP3.8,NSP9,NSP9.12,NSP12.ORF3,ORF3.3UTR,ORF2.3UTR,C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C67,NDV-微型基因组,的构建与,共转染,启动子,病毒基因组片段,病毒前导序列,尾随序列,辅助重组质粒,NP,、,P,和,L,蛋白,共转染,微型基因组,流感病毒:,NP,、,PB1,、,PB2,、,PA,PB2,PB1,PA,HA,NA,NP,M,NS,PB2,PB1,PA,HA,NA,NP,M,NS,PB2,PB1,PA,HA,NA,NP,M,NS,Attenuated Donor Master Strain,New Virulent Antigenic Variant Strain,X,Attenuated Vaccine Strain:Coat of Virulent strain with Virulence Characteristics of Attenuated Strain,活载体疫苗,概念,：利用低致病力的,痘病毒,、,疱疹病毒,、,腺病毒,或,细菌,作为载,体，将其它病原的主要保护性抗原基因插入到载体基因组的非必,需区形成新的重组体，在同源或兼容性好的启动子驱动下随载体,的复制表达插入的外源基因。,特点,：此疫苗具有常规疫苗的所有优点，而且便于构建多价疫苗，建立鉴别诊断方法。,但成功的关键取决于外源基因的表达水平，此类疫苗不能进,行二次免疫。,实例,：痘苗病毒+狂犬病毒G蛋白基因，鸡痘病毒+多种其它禽病,原基因，伪狂犬病毒+其它猪病原基因，,病毒复制非必需片段基因鉴定,病毒复制非必需片段基因克隆,外源基因插入非必需片段基因中间(即重组载体),将病毒基因和重组载体基因共转染至细胞，同源重组，产生感染性病毒粒子,筛选稳定的重组病毒,重组病毒活载体研制原理,复制非必需基因,外源基因,病毒,转染,连接,分别扩增左臂片段（L）和右臂片段（R）,分别克隆L、R片段于pBluescript M13-,转移载体pSKLR,转移载体pSKLRG,目的基因完整表达盒,2对引物,猪伪狂犬病病毒弱毒株构建活载体疫苗的构建思路,BHK21 Cells,PRV,143TK-Cells,鉴定,鉴定,纯化PRV,提取PRV基因组,技术路线,经sph1、kpn1酶切,含gG、gD、gE基因,PUC18载体,质粒PUSK,质粒PAcGFP-C1,重组质粒PUSG,质粒PIRES-ORF2,构建重组质粒PUSGO,构建重组质粒PUSGI,质粒PIRES-IL-2,技术路线,质粒PUSGO,质粒PIRES-IL2,重组质粒PUSGOI,TK,-,/gE,-,PRV基因组,PK-15细胞,重组病毒,纯化,PCR,RT-PCR,间接免疫荧光,病毒活载体疫苗的缺点：,使用同一载体的不同疫苗不能同时使用,解决办法：,构建多价疫苗,构建多种可用的载体,建立合理的免疫程序,病毒活疫苗、灭活疫苗及病毒活载体疫苗配合应用。,四、基因疫苗,概念,：将病原的保护性抗原基因与含真核启动子的质粒DNA连接后直接导入动物体内，在机体内表达相应抗原蛋白，诱导机体免疫系统产生对相应抗原的免疫保护作用。,特点,：与传统疫苗相比，基因疫苗具有制造简单、生产速度快，成本低、容易控制质量、免疫期长、热稳定性好、便于贮藏和运输。基因表达产物虽然相当于亚单位蛋白产物，但由于产物表达于宿主细胞内，可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫，具有弱毒活疫苗的效果，并且容易制作多价疫苗。同样，利用非疫苗用的基因编码的病原蛋白抗原或抗体建立的诊断方法可以区分DNA疫苗免疫的动物和自然感染的动物。,DNA Vaccines,plasmid,Muscle cell,Gene for antigen,Muscle cell expresses protein-antibody made,CTL response,由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。,目的基因的分析,选择合适的表达载体,测序确认编码序列,体外转录翻译验证试验,动物试验,结果评价,基因疫苗构建的基本步骤,pMDTH,BamHI,pcDNA3.1,BamHI,CIAP,pcDNAH,pcDNA-IL18,PCR,BglII,Ligase,CIAP,BglII,pcDNAH-IL18,PCR鉴定,酶切鉴定,瞬时转染,PCR鉴定,SDS-PAGE,Western Blot,Ligase,Cos7细胞,鸡的免疫,MTT检测,ELESA检测,保护率的测定,BamHI,CIAP,BamHI,T4 DNA ligase,重组质粒的构建流程图,五、合成肽疫苗,概念,：利用人工方法合成病原具有保护作用的抗原多肽，辅以适当的佐剂和载体制成的疫苗。,特点,：不仅安全可靠，质量可控，而且可以随时根据流行毒株的情况加以调整，利用非疫苗用蛋白抗原建立的诊断方法也可以区分疫苗免疫的动物和自然感染的动物。,但是，一般情况下这种疫苗成本较高，只适于含线性表,位的多肽，不适于构像依赖性表位。,实例,：口蹄疫病毒合成肽疫苗（UBI公司）。,六、转基因植物可食疫苗,概念,：将病原主要保护性抗原基因导入植物形成转基因植物。利用植物作为生物反应器大量表达外源蛋白作为疫苗，或将转基因植物直接加工饲喂动物使其获得免疫。,特点,：便于大量生产，饲喂方便。,但动物个体的摄入量不一，免疫效果不易保障，此疫苗只适用于粘膜免疫为主的疾病（如胃肠道传染病）。,谢谢大家！,Thank you!,